磁性多孔PLGA微球制備及其功能化研究

顧加雨 張 超 史樂樂 夏 炎

(江蘇省計量科學研究院醫(yī)學所，南京 210046)

引言

聚合物微球是通過單體聚合而形成的球形聚合物顆粒，易于制備、調(diào)控及復合，廣泛應(yīng)用于藥物緩釋遞送等多個領(lǐng)域[1]。微球是粒徑尺寸為1 ～250 μm 的球狀實體[2]，具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、單分散性、多樣性及穩(wěn)定性，將其與磁性納米顆粒結(jié)合，制成兼具磁性納米顆粒和高分子微球特性的復合型磁性聚合物的研究越來越活躍。磁性聚合物復合微球具有易加工、成本低、比表面積大、易于吸附、較好的生物相容性及磁響應(yīng)性等優(yōu)點，可作為負載藥物的優(yōu)良載體，并且可在外加恒磁場的作用下實現(xiàn)分離純化與定向操縱，在外加交變磁場作用實現(xiàn)快速升溫，為構(gòu)建兼具磁感應(yīng)熱療與磁控藥物釋放的多功能載體提供了有效手段。同時，磁性聚合物微球可以方便地進行基團表面改性(如-NH2、-OH、-COOH、-SH 等)和進一步功能化修飾，如連接藥物、熒光分子、特異性抗體等[3]，賦予磁性聚合物微球更廣泛的應(yīng)用前景。目前，聚合物磁性微球已經(jīng)在細胞分離、藥物負載、固定化酶、熱療栓塞等生物醫(yī)學領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用研究[4]。

近年來，具有優(yōu)良的生物可降解特性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]作為FDA 批準的可用于人體的藥物載體材料，受到學術(shù)界越來越多的關(guān)注[5]。PLGA 是由乳酸(lactic acid，LA)和羥基乙酸(glycolic acid，GA)按照一定比例聚合而成，同時具有兩種材料的優(yōu)勢。PLGA 作為一種可降解聚合物，在體內(nèi)可以進一步代謝，最終降解生成CO2和H2O，并無毒副作用，因此成為多種藥物的緩釋載體[6]。

磁性納米材料具有優(yōu)異的磁學性能和獨特的生物相容性，普遍用于磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、靶向藥物遞送、磁熱療、生物標記與分離、生物催化、生物傳感器等生物醫(yī)學工程領(lǐng)域[4]。而Fe3O4納米顆粒作為最早被FDA批準的臨床使用的納米材料，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域有廣泛研究[7]。

本研究采用簡單易于實現(xiàn)的溶劑揮發(fā)法制備包載油溶性Fe3O4納米顆粒的PLGA 磁性微球，同時溶劑揮發(fā)還導致微球具有多孔結(jié)構(gòu)，易于通過簡單吸附而實現(xiàn)CT 造影劑、熒光分子等的復合，并對微球的形貌結(jié)構(gòu)、藥物吸收與釋放行為以及磁感應(yīng)熱性能進行了研究。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器

主要試劑包括:聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，50:50，5000，山東省醫(yī)療器械研究所，中國)，吐溫80(國藥集團化學試劑有限公司，中國)，二氯甲烷(DCM，國藥集團化學試劑有限公司，中國)，聚乙烯醇(PVA，31000，Aladdin 公司Aladdin 公司)，F(xiàn)e3O4＠OA(南京東納生物有限公司，中國)，碘海醇(100 mL:30 g，揚子江藥業(yè)集團有限公司，中國)，羅丹明B(479.01，Aladdin 公司Aladdin 公司)。實驗所用試劑均為分析純，所用水為超純水。

主要儀器包括:高速剪切乳化器(FA25，德國Fluko 公司)；超聲波儀(RQ45，上海聲儀有限公司，中國)；機械攪拌器(D2 004 W，上海梅穎浦儀儀器儀表制造有限公司Aladdin 公司)；高速離心機(Cebtrifuge 5430R，德國Eppendoff 公司)；電子分析天平(XS105DU，瑞士梅特勒托利公司)；光學顯微鏡(ECLIPSE E200，日本尼康株式會社)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Ultra Plus，德國Zeiss 公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(SP8，德國Leica 公司)；紫外分光光度計(UV-3600日本Shimadzu 公司)；振動樣品磁強計(VSM 7407，美國Lakeshore 公司)；交變磁場(SPG-60-II/III； 深圳雙平磁感應(yīng)儀器有限公司，中國)。

1.2 PLGA-Fe3O4＠OA 微球的制備

PLGA-Fe3O4＠ OA 微球的制備采用溶劑揮發(fā)法。首先，配制1%及0.3%濃度的PVA 水溶液(外水相)；其次，將120 mg PLGA 溶于5 mL 二氯甲烷中，超聲震蕩溶解，待充分混合后加入Fe3O4＠ OA納米顆粒[(Fe3O4＠OA/PLGA)%=5%]，超聲使其充分混合(油相)；將外水相中加入適量的表面活性劑Tween 80，將混合均勻后的油相置于外水相中，室溫下以500 r/min 低速攪拌過夜，揮發(fā)有機溶劑使微球固化；最后離心洗滌，冷凍干燥備用。

1.2 磁性微球形貌表征

取適量冷凍干燥后的微球分散于蒸餾水中，然后分別滴加到玻璃片、錫箔紙上，室溫干燥后用光學顯微鏡及掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)分析所制備樣品的外貌及形狀。

1.3 磁性微球表面成分的測定

取少量所制備的材料，將其固定在導電膠上，利用掃描電子顯微鏡中的元素分析儀進行碘元素測定( mapping)及能量譜( energy dispersive spectrometer，EDS)測定。

1.4 磁性微球吸附碘釋放情況研究

取一定量的磁性微球加入1 mg/mL 的碘溶液中，室溫下?lián)u床震蕩孵育5 h 洗滌、滴樣以備檢測后，將樣品繼續(xù)在搖床上震蕩孵育。分別取再孵育0.5 和1 h 的樣品進行Micro-CT、掃描電子顯微鏡中的元素分析儀進行碘元素測定。Micro-CT 值計算時，1/25/50/75/100 分別代表選取第1、25、50、75、100 層進行平均數(shù)值計算。

1.5 磁性微球孔結(jié)構(gòu)的研究

取少量制備材料于5 mL 去離子水中復溶，然后取10 mg 的水溶性熒光染料羅丹明B 加入上述溶液，室溫下?lián)u床震蕩4 h。取少量熒光微球于載玻片，激光共聚焦顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)分布。

1.6 磁性微球吸附羅丹明釋放的研究

取一定量的磁性微球加入1 mg/mL 的羅丹明B的PBS 溶液中，室溫下?lián)u床震蕩孵育，并分別于0.5、1、2、4、6、8 h 磁分離，用純水洗滌后用紫外分光光度計測量。

1.7 磁熱效應(yīng)測試

磁性高分子微球的磁熱效應(yīng)實驗是由交變磁場(alternating current magnetic field，ACMF)發(fā)生裝置完成。取適量的磁性高分子微球(Fe 濃度已知)于EP 管中，放置于磁感熱線圈內(nèi)，插入測溫光纖，設(shè)置參數(shù)后開啟交變磁場及測溫裝置，記錄數(shù)據(jù)。比吸收率(specific absorption rate，SAR)表示每單位材料質(zhì)量在單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的熱量多少，常用于衡量磁性材料在交變磁場的升溫效率，表示為[8]

式中，C表示樣品比熱容，dT/dt為起始斜率，ms 為樣品質(zhì)量，mFe 為樣品中Fe 的質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 PLGA 磁性微球形貌分析

光鏡下微球呈圓形，且分布均勻，如圖1所示。由圖可見，所制備的微球呈球形較圓整，但表面較粗糙，有助于藥物的吸附，往往會引起藥物的高突釋[9]。粒徑為10～15 μm，微球粒徑較小，導致藥物向外流失面積越大，流失越多，包封率下降[10]。

圖1 磁性PLGA 微球的光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡圖像Fig.1 The optical microscope and scanning electron microscope( SEM )imageofmagnetic PLGA microspheres

2.2 PLGA 磁性微球表面成分測定

圖2為磁性微球的SEM 圖像、元素mapping 圖及微球EDS 元素分析圖。如圖2(a)所示，在磁性微球中含有多種元素存在，包括C 元素、O 元素及Fe 元素(圖中虛線框所示)；圖2(b)進一步證實了微球中含有一定量的Fe 元素，F(xiàn)e 元素所占原子百分比為0.62 %，證明已成功合成含有Fe3O4＠ OA的磁性聚合物微球。

圖2 磁性 PLGA 微球表征。(a)SEM mapping；(b)EDS 分析Fig.2 Magnetic PLGA microspheres. (a)SEM mapping； (b)EDS analysis

2.3 PLGA 磁性微球碘吸附實驗

2.3.1 不同孵育時間碘的釋放

室溫下與碘海醇溶液震蕩孵育，于不同時間取樣所做mapping 如圖3所示。由圖可見，隨著孵育時間延長，碘元素發(fā)生變化。當磁性微球與碘海醇溶液共孵育5 h 后，碘吸附量最多，圖片亮度最大，且此時的碘元素大部分都集中在微球表面，吸附量較多，如圖3(a)所示。而由圖3(b)和(c)中可以明顯看出亮度變暗，碘元素開始向周圍擴散。在2 h的時候，磁性微球中碘元素亮度最低。上述結(jié)果說明CT 造影劑碘海醇能夠有效吸附到PLGA 磁性微球內(nèi)部，并且隨著時間增加逐漸釋放，在2 h 之內(nèi)仍然含有較多的碘海醇。

圖3 碘海醇不同孵育時間的SEM 元素映射圖像。(a)0 h；(b)0.5 h；(c)2 hFig.3 The SEM element mapping images of iohexol for different incubation times. (a)0 h； (b)0.5 h；(c)2 h

2.3.2 不同孵育時間Micro-CT 定量結(jié)果分析

將PLGA 磁性微球與碘海醇溶液孵育，待成功吸附碘海醇后用純水洗滌后保存在水溶液中，分別在0、0.5、1 h 時取樣，進行Micro-CT 測試。表1中數(shù)據(jù)是未吸附碘海醇的磁性微球以及吸附后不同釋放時間點的樣品的CT 值，按掃描斷層編號選取圖片計算平均值而得，CT 值越大，說明材料吸收越強。從表中可以看出，對于不同的掃描斷層，變化趨勢是一致的，未吸附碘海醇的樣品CT 值明顯小于吸附后的樣品。隨著釋放時間增加，CT 值減小，在1 h 時CT 值仍維持較高水平。

表1 含碘海醇的磁性PLGA 微球在不同釋放時間的平均顯微CT 值Tab.1 Average micro-CT values of magnetic PLGA microspheres with iohexol at different release time

2.4 PLGA 磁性微球羅丹明B 吸附實驗

2.4.1 PLGA 磁性微球孔結(jié)構(gòu)研究

為了證明上述實驗中的碘海醇是通過PLGA 磁性微球的多孔結(jié)構(gòu)進行負載的，將熒光染料羅丹明B與PLGA 磁性微球進行孵育，如果存在孔結(jié)構(gòu)，羅丹明B 則能夠分散在孔道中，利用激光共聚焦顯微鏡可觀察出其分布情況，結(jié)果見圖4，所示為磁性微球不同截面的共聚焦成像。圖中紅色發(fā)光物質(zhì)為羅丹明B，羅丹明B 越多，則圖片越亮?？梢娙軇]發(fā)法制備的PLGA 磁性微球內(nèi)部分布著大小不均一的孔洞，而且聯(lián)通性較高，羅丹明B 通過孔洞進入微球，較多吸附在微球孔壁上。微球不同掃描層面上紅色熒光分布不均一，說明微球內(nèi)部孔道分布不均勻。微球在有機溶劑揮發(fā)固化的過程中，高分子首先在球心凝聚形成1 個核，而后逐漸向外揮發(fā)聚集，此時隨著有機溶劑的揮發(fā)帶走了部分有機物，孔道由內(nèi)而外形成。

圖4 含有羅丹明B(紅色)的磁性PLGA 微球在不同掃描層面上的激光共聚焦圖像Fig.4 The laser confocal images of magnetic PLGA microspheres containing rhodamine B ( red)at different scanning levels

2.4.2 PLGA 磁性微球吸附羅丹明B 釋放研究

圖5為不同時間用純水洗滌后的羅丹明B 釋放情況。結(jié)果顯示，羅丹明B 在初始時釋放迅速，4 h后釋放速度開始減緩，在8 h 時釋放達到飽和，表明可以將磁性微球在使用前與藥物分子簡單混合，吸附后用于介入給藥，從而可實現(xiàn)不同藥物的負載和釋放。

圖5 羅丹明B 在不同時間的累積釋放Fig.5 Accumulated release of rhodamine B at different times

2.5 PLGA 磁性微球磁學性能研究

磁性納米材料的磁特性一般受尺寸、形貌等多種因素影響。圖6(a)顯示的磁滯回線為采用振動樣品磁強計(vibrating sample magnetometer，VSM)的測試結(jié)果，說明納米顆粒具有良好的磁學性能，矯頑力和剩磁幾乎為零，說明具有超順磁性，其飽和磁化強度為33.9 emu/g Fe。飽和磁化強度對材料在交變磁場下的熱升溫能力有重要影響，因此，用光纖測溫器測量了600 s 內(nèi)的升溫情況。其發(fā)熱性能在加交變磁場作用下隨時間的變化如圖6(b)所示。在外加交變磁場作用下600 s 后，最高溫度可達55.6℃。目前研究表明，腫瘤細胞對熱比較敏感，當溫度達到或高于42℃時可以更有效地殺死腫瘤細胞以達到治療的效果[11]。采用SAR 值來衡量納米顆粒在交變磁場誘導下的熱效率，計算得SAR 值為47.42 W/g Fe。

圖6 PLGA 磁性微球在交變磁場下的性能測試。(a)水相中的磁滯回線；(b)時間－溫度曲線Fig. 6 Performance test of PLGA magnetic microspheres under alternating magnetic field. (a)Hysteresis loop in aqueous phase； (b)Timetemperature curves

3 討論和結(jié)論

本研究的實驗結(jié)果顯示，PLGA 包裹后并不改變其超順磁性。利用激光共聚焦觀察磁性微球孔洞結(jié)構(gòu)，為后續(xù)載藥提供了理論依據(jù)。此外，通過研究碘及羅丹明B 的吸附釋放行為，表明PLGA 磁性微球可以用來持續(xù)時間的CT 造影，并且具有明顯的緩釋功能。上述結(jié)果皆說明PLGA 高分子復合磁性微球是一種常用的藥物攜帶載體?？赡苡绊戓尫判袨榈闹饕蛴?1)制備PLGA 微球時有部分藥物在微球表面，易形成突釋；2)PLGA 質(zhì)量以及微球制備時儀器選擇等均能影響吸附釋放行為[12]。PLGA 磁性微球具有良好的超順磁特性與磁感應(yīng)熱療能力，為未來構(gòu)建兼具磁感應(yīng)熱療與磁熱藥物控釋的多功能載體奠定了基礎(chǔ)。

本研究采用簡單的溶劑揮發(fā)法制備了包裹Fe3O4＠OA 的PLGA 磁性微球，其直徑約10～15 μm，溶劑揮發(fā)導致微球具有多孔結(jié)構(gòu)。以CT 造影劑碘海醇和熒光分子羅丹明B 作為模型分子進行吸附和釋放研究，結(jié)果表明這些分子可以被有效負載到微球的多孔結(jié)構(gòu)之中，并且具有一定的藥物緩釋特性。CT 造影劑和熒光分子負載同時為發(fā)展多模態(tài)影像學指導藥物遞送提供了可視化手段。

(致謝:感謝東南大學張宇教授的指導；感謝南京東納生物科技有限公司提供的技術(shù)支持)