CAR-T在胃癌免疫治療中的研究進(jìn)展

程浩 依荷芭麗·遲 周全 應(yīng)建明 石素勝

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，也是全球第三大最常見的癌癥死亡原因，據(jù)2020年全球相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，新增胃癌病例超過100 萬例（約占所有癌癥診斷人數(shù)的6%），新增死亡人數(shù)約76.8 萬例（約占所有癌癥死亡人數(shù)的8.2%）[1]，在世界范圍內(nèi)成為較大的健康負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的治療方法，如手術(shù)，僅適用于早期胃癌，但這種疾病診斷時(shí)往往已是晚期，治療選擇有限，而且大多數(shù)患者對(duì)這些藥物并不特別敏感，這強(qiáng)調(diào)了發(fā)現(xiàn)新的治療模式的緊迫性。

嵌合抗原受體T 細(xì)胞免疫（chimeric antigen receptors T cell，CAR-T）療法，是細(xì)胞過繼治療（adoptive cell transfer therapy，ACT）的方法之一，其主要原理是從患者身上分離T 細(xì)胞，利用基因工程技術(shù)為T細(xì)胞插入一個(gè)能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞并同時(shí)激活T 細(xì)胞的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors，CAR），然后將擴(kuò)增好的CAR-T 細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)并攻擊表達(dá)相關(guān)抗原的目標(biāo)細(xì)胞，而不依賴于主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）限制。作為一種活性藥物，CAR-T 細(xì)胞免疫治療正迅速成為一種有前途的治療血液和非血液系統(tǒng)惡性腫瘤的創(chuàng)新治療策略。2017年，美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)諾華公司的CAR-T 細(xì)胞治療產(chǎn)品Kymriah（tisagenlecleucel，CTL019）上市，用于治療難治或至少接受二線方案治療后復(fù)發(fā)的25 歲以下B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者，是人類歷史上批準(zhǔn)的首款CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品，被FDA 授予“突破性治療”稱號(hào)。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤領(lǐng)域取得初步成功后，CAR-T 細(xì)胞治療現(xiàn)在被廣泛研究用于治療實(shí)體惡性腫瘤的難治性和復(fù)發(fā)病例，許多研究表明，CAR-T 細(xì)胞療法在胃癌中取得了重大進(jìn)展，本綜述將系統(tǒng)介紹CAR-T 療法在胃癌中的最新研究進(jìn)展，包括CAR-T 的生物學(xué)基礎(chǔ)、臨床應(yīng)用、所面臨的挑戰(zhàn)及應(yīng)對(duì)策略。

1 CAR-T 治療原理及CAR 的基本結(jié)構(gòu)

T 細(xì)胞要識(shí)別不同的細(xì)胞，需依靠T 細(xì)胞表面的T 細(xì)胞受體（T-cell receptor，TCR）與細(xì)胞表面的MHC 分子遞呈的抗原相結(jié)合，才能發(fā)揮識(shí)別作用。而腫瘤細(xì)胞可通過調(diào)低或者丟失MHC 的表達(dá)以逃脫T 細(xì)胞對(duì)它的識(shí)別和殺傷作用。細(xì)胞過繼治療方法如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）療法和T 細(xì)胞受體工程化T 細(xì)胞（T-cell receptor engineered T cell，TCR-T）療法，均僅能識(shí)別MHC提呈的抗原，可能因腫瘤細(xì)胞下調(diào)或突變其MHC 分子而逃避免疫監(jiān)視，臨床上有一定局限性。為了避開MHC 的限制作用，一個(gè)極具前景的方法就是對(duì)T 細(xì)胞進(jìn)行改造，利用CAR 對(duì)T 細(xì)胞進(jìn)行修飾，使T 細(xì)胞獲得針對(duì)某個(gè)靶點(diǎn)抗原表位的特異性，從而增強(qiáng)T 細(xì)胞識(shí)別抗原信號(hào)與活化的功能[2]，相較于天然T 細(xì)胞表面受體，CAR 賦予T 細(xì)胞人淋巴細(xì)胞抗原（human lymphocyte antigen，HLA）非依賴性方式識(shí)別腫瘤抗原的能力，具有傳統(tǒng)細(xì)胞過繼療法無法比擬的優(yōu)勢(shì)。目前已有5 款CAR-T 細(xì)胞療法藥物被美國FDA 批準(zhǔn)用于治療B 細(xì)胞白血病和淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤（表1）[2]。

表1 美國FDA 批準(zhǔn)CAR-T 治療藥物

CAR 的典型結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)區(qū)。細(xì)胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域是單鏈可變區(qū)片段抗體（singlechain variable fragment，ScFv），這是CAR-T 識(shí)別腫瘤抗原靶點(diǎn)的關(guān)鍵部位，可識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）或腫瘤特異抗原（tumor specific antigen，TSA）。間隔區(qū)又稱鉸鏈區(qū)，與ScFv 共同組成細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?？缒そY(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是最重要的結(jié)構(gòu)特征，一般由二聚體膜蛋白組成，其將CAR 錨定在T 細(xì)胞上，并與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接?；诩?xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的不同目的，CAR-T 設(shè)計(jì)已經(jīng)發(fā)展到第五代（圖1）[3]。1989年，Gross 等[4]將表達(dá)特定抗體的基因序列插入細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）內(nèi)，這是人類歷史上首次提出CAR 這一概念。第一代CAR-T 的胞外結(jié)構(gòu)域ScFv 通過跨膜結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)基序CD3 復(fù)合物（ζ 鏈）相連，但由于沒有共刺激分子的表達(dá)，不足以促進(jìn)T 細(xì)胞的持續(xù)擴(kuò)增，且在體內(nèi)存活時(shí)間及細(xì)胞因子分泌等方面存在不足，導(dǎo)致腫瘤殺傷治療效果不明顯。第二代CART 在第一代的基礎(chǔ)上引入一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，如CD28、CD137（4-1BB）或DAP10等，可以增加免疫記憶效應(yīng)和殺傷活性，并提高了其作用持久性。第三代CAR-T 包含兩個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，如CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）和ICOS 等，旨在進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)能力和抗腫瘤反應(yīng)，然而有研究表明，第三代CART 細(xì)胞殺傷活性并沒有獲得明顯的提升，這可能是因?yàn)橐粋€(gè)共刺激分子在T 淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活化信號(hào)就已達(dá)到閾值，單純?cè)跀?shù)量上添加共刺激結(jié)構(gòu)域并不會(huì)進(jìn)一步提升CAR 對(duì)T 淋巴細(xì)胞的活化效果[5]。第四代CAR-T 又稱為通用細(xì)胞因子介導(dǎo)殺傷的重定向T 細(xì)胞（T cell redirected for universal cytokine-mediated killing，TRUCKs），其通過產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子（特別是IL-12）用以促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中CAR-T 細(xì)胞的進(jìn)一步活化，或在CAR-T 的結(jié)構(gòu)上添加自殺基因或趨化因子的受體結(jié)構(gòu)，有利于避免脫靶效應(yīng)和增加T 細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)，從而達(dá)到增強(qiáng)殺傷實(shí)體瘤的效果。第五代CAR 基于第二代CAR 結(jié)構(gòu)，添加了激活其它信號(hào)通路的共刺激結(jié)構(gòu)域，如IL-2Rβ 胞內(nèi)結(jié)合STAT3/5 的結(jié)構(gòu)域，提供抗原依賴的細(xì)胞因子信號(hào)，并提高了增殖、存活和抗腫瘤活性。

圖1 CAR 的結(jié)構(gòu)和演化的示意圖[3]

2 CAR-T 治療過程及檢測(cè)技術(shù)

CAR-T 治療過程可以分為不同的步驟：1）醫(yī)師從患者體內(nèi)提取血液。2）將提取的血液分離出非特異性的T 細(xì)胞，在體外常使用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)或基因組編輯技術(shù)，在T 細(xì)胞表面插入可特異性識(shí)別腫瘤抗原的CAR。3）經(jīng)過一定程度的擴(kuò)增后產(chǎn)生的T 淋巴細(xì)胞，隨即再回輸回患者體內(nèi)以對(duì)抗腫瘤細(xì)胞。盡管這種自體CAR-T 細(xì)胞不會(huì)引起排斥反應(yīng)，但它也有一些眾所周知的缺點(diǎn)如高昂的費(fèi)用成本（約35～40 萬美元）和制備時(shí)間較長(zhǎng)（約2～3 周），且多數(shù)患者在接受CAR-T 細(xì)胞治療前均需使用放療或者化療進(jìn)行淋巴耗竭預(yù)處理，這可能導(dǎo)致自體CAR-T 細(xì)胞的生產(chǎn)效率低下甚至制備失敗[6]?！艾F(xiàn)貨型”（off-the-shelf）CAR-T 細(xì)胞是指同種異體來源的T 細(xì)胞制備而成的CAR-T 細(xì)胞，其制備過程分為以下步驟：1）從健康供體內(nèi)分離出T 淋巴細(xì)胞。2）通過病毒載體將CAR 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入T 細(xì)胞中并進(jìn)行T 細(xì)胞擴(kuò)增。3）經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)檢、分裝、冷凍儲(chǔ)存后，理論上可以如同“藥品”一般，隨時(shí)可供患者使用，無需等待。同種異體CAR-T 細(xì)胞治療有許多潛在的優(yōu)勢(shì)，例如由于工業(yè)化和規(guī)?；膶?shí)施而降低了成本，生產(chǎn)成批的低溫保存的T 細(xì)胞，使患者可以立即獲得治療。但現(xiàn)貨型”CAR-T 細(xì)胞存在2 個(gè)問題：1）可能危及患者生命的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GvHD），為避免GvHD 的發(fā)生，制備“現(xiàn)貨型”CAR-T 細(xì)胞應(yīng)利用基因編輯技術(shù)敲除會(huì)引起GvHD 和免疫系統(tǒng)排斥的相關(guān)基因（如HLA 等）；2）異體T 細(xì)胞可能被宿主免疫系統(tǒng)迅速清除，為增加T 細(xì)胞持久性可通過基因編輯給予更多的共刺激信號(hào)，延長(zhǎng)T 淋巴細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間，而不影響CAR-T 細(xì)胞活性。

CAR-T 治療效果若要得到保障，高效的檢測(cè)技術(shù)必不可少。流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞或生物微顆粒生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，在整個(gè)生產(chǎn)、治療過程中監(jiān)控CAR-T 細(xì)胞群體組成，并評(píng)估體內(nèi)細(xì)胞的持久性和治療效果發(fā)揮重要作用[7]。如制備過程中，F(xiàn)CM 可分析患者分離血液的成分，篩選與預(yù)后更好的供體T 細(xì)胞特定群體以及評(píng)估CAR-T 細(xì)胞的表型和功能，F(xiàn)raietta 等[6]對(duì)自體來源CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行基因組、表型和功能評(píng)估，發(fā)現(xiàn)CD27+CD45RO-CD8+T 細(xì)胞的比例增高，與抗CD19CAR-T 細(xì)胞治療慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的持續(xù)緩解有關(guān)。Salem 等[8]采用FCM 和免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細(xì)胞中BCMA 表達(dá)的發(fā)生率和強(qiáng)度。FCM 檢測(cè)的陽性率顯著高于IHC 檢測(cè)（97%vs.72%，P＜0.01）。值得注意的是，目的抗原的表達(dá)百分比和強(qiáng)度可能受到是否進(jìn)行IHC 或FCM、使用的抗體克隆、偶聯(lián)熒光團(tuán)或染料以及儀器設(shè)置和校準(zhǔn)的影響[9]。

3 CAR-T 治療在胃癌中的應(yīng)用

晚期胃癌生存期短，治療效果不理想，迫切需要新的治療方法。目前，全球范圍內(nèi)針對(duì)胃癌的CART 細(xì)胞治療研究已取得了一些進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些胃癌的腫瘤標(biāo)志物，現(xiàn)依據(jù)靶點(diǎn)對(duì)CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行分類介紹。

3.1 HER-2

人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，屬于EGFR 家族成員之一，其高表達(dá)可啟動(dòng)多種信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。正常人體組織中其表達(dá)量極低，HER-2 在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，并可作為腫瘤預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。在胃癌中，10%～20%的確診病例中HER-2 過表達(dá)。曲妥珠單抗（赫賽?。┦且环N靶向HER-2 的單克隆抗體，并常聯(lián)合化療治療HER-2 陽性胃癌，但在治療約1年后通常出現(xiàn)耐藥導(dǎo)致治療失敗，因此，采用新的更有效的治療方法是必要的。Han 等[10]將共刺激因子CD137 加入到HER-2CAR-T 細(xì)胞中構(gòu)建的chA21-4-1BBz CART 細(xì)胞，可在體外特異性地消除HER-2 細(xì)胞，在體內(nèi)研究中能夠抑制皮下移植腫瘤模型和腹膜轉(zhuǎn)移模型中HER-2 的過表達(dá)。Song 等[11]將CD137-anti-HER-2 ScFv CAR 通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染到T 細(xì)胞中，能有效殺傷HER-2 陽性胃癌細(xì)胞系和患者來源的原代胃癌細(xì)胞，還可以有效抑制胃癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)。Luo 等[12]設(shè)計(jì)一種雙特異性T 細(xì)胞激動(dòng)劑（bispecific T-cell engagers，BiTEs），由兩個(gè)ScFv 組成，可同時(shí)靶向TCR 的CD3 分子和腫瘤表面抗原HER-2，使T 細(xì)胞和癌細(xì)胞之間形成免疫突觸，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，這表明HER-2 靶向CAR-T 細(xì)胞治療是治療HER-2陽性進(jìn)展期胃癌的潛在治療策略，但其毒性仍需驗(yàn)證。

3.2 EpCAM

上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是一種表達(dá)于部分正常上皮細(xì)胞和多數(shù)惡性上皮腫瘤細(xì)胞表面的糖蛋白，EpCAM 在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化、遷移和增殖中發(fā)揮重要作用，其過表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。EpCAM 在超過90% 的胃癌中過表達(dá)，這使得這種蛋白有潛力成為CAR-T 細(xì)胞治療的理想靶點(diǎn)。靶向EpCAM 的CAR-T 細(xì)胞治療正在胃癌患者中進(jìn)行研究，2015年的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)NCT02725125，旨在評(píng)估EpCAM CAR-T 細(xì)胞治療復(fù)發(fā)或難治性EpCAM 陽性胃癌患者的療效及安全性。2018年的臨床試驗(yàn)NCT03563326，旨在比較EpCAM CAR-T 與常規(guī)化療兩種療法對(duì)Ep-CAM 陽性且有腹膜轉(zhuǎn)移的晚期胃癌患者的有效性和安全性。

3.3 CEA

癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）是一種腫瘤相關(guān)抗原，最初認(rèn)為是一種存在于結(jié)腸癌、正常胚胎腸道的蛋白多糖復(fù)合物，后被證實(shí)可廣泛存在于內(nèi)胚層起源的消化系統(tǒng)腫瘤，如結(jié)直腸癌、胃癌和胰腺癌等，其表達(dá)量與腫瘤的惡性程度正相關(guān)，在正常人血清中也可有微量存在，因此針對(duì)CEA 的CAR-T治療需考慮其可能不良反應(yīng)。Wang 等[13]針對(duì)CEA特異性CAR-T 細(xì)胞治療的研究表明，使用CAR-T 細(xì)胞治療有助于延長(zhǎng)晚期胃癌小鼠的生存時(shí)間，并減緩腫瘤生長(zhǎng)。Shibaguchi 等[14]將IL-2 基因插入到CAR結(jié)構(gòu)中，使CAR-T 能夠自分泌細(xì)胞因子IL-2，增強(qiáng)了其對(duì)人胃癌細(xì)胞系MKN-45 的殺傷作用。Chi 等[15]將CEA 特異性CAR-T 與重組人IL-12（rhIL-12）聯(lián)合應(yīng)用，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)rhIL-12 顯著增加CEACAR-T 細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞毒性，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞系MGC803 的生長(zhǎng)抑制作用明顯強(qiáng)于單用CEACAR-T 細(xì)胞，因此，需要開發(fā)一種利用細(xì)胞因子增強(qiáng)CEA CAR-T 治療效果的策略。此外，2014年開展的臨床試驗(yàn)NCT02349724，主要目的是驗(yàn)證CEA CAR-T 細(xì)胞的安全性，并確定注射CART 細(xì)胞的適當(dāng)劑量。

3.4 CLDN18.2

細(xì)胞緊密連接蛋白18.2（claudin18.2，CLDN18.2）是claudins 蛋白的一種剪接體，主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，其功能主要是調(diào)節(jié)屏障結(jié)構(gòu)的滲透性。CLDN18.2在70% 的原發(fā)性胃腺癌及其轉(zhuǎn)移灶中過表達(dá)，在胰腺、食管和肺腫瘤中也存在表達(dá)，因此特異性地抑制CLDN18.2 被認(rèn)為是治療晚期或者轉(zhuǎn)移性胃癌的一個(gè)有效途徑。Jiang 等[16]設(shè)計(jì)了優(yōu)化抗體hu8E5-2I-28z（28z:CD28CD3ζ）并構(gòu)建CLDN18.2 CAR-T 細(xì)胞，能夠有效抑制人源性腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）腫瘤模型的生長(zhǎng)，且CLDN18.2 CAR-T 具有較好的安全性，對(duì)小鼠的胃和其他器官未造成明顯的不良反應(yīng)。2019年，Zhan 等[17]發(fā)表的一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)NCT03159819 結(jié)果顯示，應(yīng)用CLDN18.2 CAR-T 治療進(jìn)展期胃癌和胰腺癌患者，總客觀緩解率為33%，且無嚴(yán)重不良反應(yīng)。2020年開展的一項(xiàng)多中心Ⅰb 期臨床試驗(yàn)NCT04404595，旨在評(píng)估自體CLDN18.2CAR-T 細(xì)胞治療進(jìn)展期胃或胰腺腺癌患者的安全性和有效性。

3.5 MUC1

黏蛋白（MUC1）是一種高度糖基化的跨膜蛋白，在多種器官（胃腸、眼及肺等）的上皮表面形成黏膜屏障，起著重要的保護(hù)作用。同時(shí)，MUC1 在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及腫瘤發(fā)生的所有階段均起著重要作用，其過表達(dá)與包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤有關(guān)，且高表達(dá)往往提示預(yù)后不良，被廣泛用于監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移情況。此外，腫瘤組織和正常組織的MUC1 不僅在表達(dá)量上有差異，腫瘤與正常組織的MUC1 糖基化也存在差異，這也是開發(fā)區(qū)分腫瘤特異性藥物的生物學(xué)基礎(chǔ)[18]。Wilkie 等[19]設(shè)計(jì)了一種包含CD28/OX40/CD3-ζ 結(jié)構(gòu)域的CAR（HOX），并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-17 的產(chǎn)生，對(duì)MUC1 陽性腫瘤細(xì)胞顯示出殺傷作用。2015年的一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)NCT02617134，旨在評(píng)價(jià)MUC1CAR-T 在MUC1 陽性的復(fù)發(fā)或難治性胃癌等實(shí)體瘤患者中的有效性和安全性。

3.6 MSLN

間皮素（mesothelin，MSLN）是一種40-kDa 的膜蛋白，通過磷脂酰肌醇附著在細(xì)胞表面，正常在胸膜、心包和腹膜的間皮細(xì)胞中低表達(dá)，高表達(dá)于多種腫瘤組織中，如間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和胃癌等，MSLN的異常表達(dá)通過激活PI3K、ERK 和MAPK 信號(hào)通路在癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起核心作用。Lv 等[20]設(shè)計(jì)了包含ScFv 及CD28、CD3ζ、DAP10 胞內(nèi)信號(hào)域的靶向MSLN 的第三代CAR-T 細(xì)胞（M28z10 T），在體內(nèi)尾靜脈模型和腹腔模型等多個(gè)模型表明，M28z10T 細(xì)胞能夠明顯抑制胃癌的生長(zhǎng)，甚至在部分小鼠體內(nèi)達(dá)到完全清除腫瘤的效果，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)相比靜脈注射，癌旁或瘤內(nèi)注射等局部注射方式可能會(huì)有效地提高治療效果。Zhang 等[21]使用改良的piggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建了anti-meso1（膜遠(yuǎn)端區(qū)域）-scFv 和anti-meso3（膜近端區(qū)域）-scFv 與28z 連接的第二代CAR-T，發(fā)現(xiàn)靶向膜近端區(qū)域的anti-meso3-scFvCAR-T 分泌更多的細(xì)胞因子，介導(dǎo)的殺傷腫瘤反應(yīng)更強(qiáng)，對(duì)HGC-27 皮下胃癌模型具有良好的抗腫瘤活性。2019年的一項(xiàng)多靶點(diǎn)CAR-T 細(xì)胞治療多種腫瘤的臨床試驗(yàn)NCT03941626，其中包括評(píng)估MSLN CAR-T 細(xì)胞治療胃癌的療效和安全性。

3.7 FOLR1

葉酸受體1（folate receptor 1，F(xiàn)OLR1），又稱葉酸受體α 和葉酸結(jié)合蛋白，是一種糖基磷脂酰肌醇連接蛋白，F(xiàn)OLR1 對(duì)葉酸有很高的親和力，在與葉酸結(jié)合時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)信號(hào)，與葉酸結(jié)合的FOLR1 被內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞增殖活化。FOLR1 在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，包括卵巢癌、乳腺癌、腎癌和肺癌等，超過1/3 的胃癌患者腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)FOLR1，但在正常組織中很少表達(dá)，這使得FOLR1 成為CAR-T 細(xì)胞治療的潛在靶點(diǎn)。Kim 等[22]構(gòu)建了包含CD28 和CD3ζ 信號(hào)域的第二代CAR-T細(xì)胞，對(duì)FOLR1 陽性的胃癌細(xì)胞系表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷作用，研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)FOLR1CAR-T 細(xì)胞與FOLR1陽性胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，人T 細(xì)胞中的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和顆粒酶B 增加，顆粒酶B 在細(xì)胞毒性中起重要作用。

3.8 NKG2D

自然殺傷細(xì)胞家族2 成員D（natural killer group 2 member D，NKG2D）常表達(dá)于自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞表面，通過與靶細(xì)胞表面配體（NKG2Dligand，NKG2DL）相結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)以發(fā)揮殺傷作用。NKG2DL 在正常細(xì)胞表面不表達(dá)或較低水平表達(dá)，然而當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病原體感染、氧化或應(yīng)激、藥物、組織損傷、增殖和惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化等情況，NKG2DL 將在細(xì)胞表面誘導(dǎo)性表達(dá)，免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)NKG2DL 在胃癌中廣泛表達(dá)，且NKG2DL 的表達(dá)使得胃癌細(xì)胞容易被NK 細(xì)胞識(shí)別、殺傷。Liu 等[23]設(shè)計(jì)了NKG2D-CD28-CD3ζ CAR-T 細(xì)胞，這種CART 細(xì)胞能夠殺傷表達(dá)NKG2DL 的胃癌細(xì)胞系MKN-28 和MKN-74 和腹水來源的原發(fā)人胃癌細(xì)胞。Tao等[24]類似地也構(gòu)建針對(duì)NKG2D 的第二代CAR-T 細(xì)胞，在體內(nèi)外顯示出強(qiáng)大的抗胃癌的細(xì)胞溶解活性，此外研究還發(fā)現(xiàn)順鉑還可以上調(diào)胃癌細(xì)胞中NKG2D配體的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)NKG2D CAR-T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性。Landmark Medical Center 牽頭的Ⅰ期臨床研究NCT04107142，評(píng)估NKG2D CAR-T 細(xì)胞治療包含胃癌在內(nèi)的復(fù)發(fā)或難治性實(shí)體腫瘤患者的安全性和耐受性。

3.9 Trop2

人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2（human trophoblast cell surface antigen 2，Trop2）首次在人滋養(yǎng)細(xì)胞和絨癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，主要表達(dá)在上皮細(xì)胞膜表面，是一種36-kDa 的單跨膜蛋白。Trop2 在胃癌中高表達(dá)，且通常提示預(yù)后較差，因此可以作為胃癌的新靶點(diǎn)[25]。Zhao等[26]制備了一種雙特異性的Trop2/PD-L1 CAR-T 細(xì)胞，該細(xì)胞能夠特異性靶向Trop2 和PD-L1 腫瘤抗原，并能夠阻斷PD-1/PD-L1 信號(hào)通路，且雙特異性CART 細(xì)胞在體內(nèi)和體外均對(duì)胃癌細(xì)胞顯示出殺傷作用。

3.10 MG7-AG

胃癌單克隆抗體（monoclonal gastric cancer 7 antigen，MG7-Ag）是一種中性糖脂類TTA，其在正常胃黏膜中不表達(dá)或低表達(dá)，而在早期胃癌中的特異性高表達(dá)讓其有可能成為早期胃癌診斷的預(yù)警因子。Yuan 等[27]設(shè)計(jì)的MG7CAR-T 細(xì)胞用于治療胃癌PDX 模型的結(jié)果顯示，100% 小鼠見到腫瘤縮小，其中60%小鼠達(dá)到腫瘤的完全消除，且在治療1年后仍未看到腫瘤的復(fù)發(fā)，外周血中仍可檢測(cè)到1年前回輸?shù)腗G7 CAR-T 細(xì)胞。

4 CAR-T 在實(shí)體瘤治療中的挑戰(zhàn)

盡管CAR-T 細(xì)胞已在胃癌等實(shí)體瘤治療中取得了初步療效，但其治療效果與血液系統(tǒng)腫瘤相比還存在著差距，面臨更多挑戰(zhàn)。

4.1 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是一種癌細(xì)胞重新設(shè)計(jì)以促進(jìn)其生長(zhǎng)的微環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間質(zhì)組織及各種細(xì)胞因子等組成。對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤而言，進(jìn)入血液循環(huán)的CAR-T 細(xì)胞便到達(dá)目的地，而對(duì)于實(shí)體腫瘤而言，腫瘤微環(huán)境不僅具有物理屏障抑制T 細(xì)胞的浸潤(rùn)，而且腫瘤微環(huán)境中還包含多種免疫抑制細(xì)胞（M2 型巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞等）和免疫檢查點(diǎn)（程序性細(xì)胞死亡受體1、細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 等），通過多種途徑抑制CAR-T 細(xì)胞發(fā)揮殺傷活性。此外，實(shí)體腫瘤腫瘤微環(huán)境中低pH、低氧和營養(yǎng)不良均不利于CAR-T 細(xì)胞的存活和激活[28]。

為克服這一難題，將CAR-T 有效運(yùn)輸至腫瘤部位，可在CAR-T 細(xì)胞中添加趨化因子來增加其向腫瘤部位的募集，或改善腫瘤周圍的細(xì)胞、組織及血供等來增加CAR-T 細(xì)胞在腫瘤部位的浸潤(rùn)[29]；為改善因腫瘤微環(huán)境引起的免疫抑制作用，有研究設(shè)計(jì)了連接抗PD-L1 ScFv 序列的CAR-T 細(xì)胞，這種CAR-T 細(xì)胞在殺滅胃癌腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還阻斷PD-1/PD-L1 信號(hào)通路以解除免疫抑制狀態(tài)[30]。

4.2 靶點(diǎn)的特異性

CAR-T 細(xì)胞治療的前提是靶抗原的選擇，但與血液系統(tǒng)腫瘤相比，在實(shí)體瘤中找到理想的靶抗原更加困難。血液系統(tǒng)腫瘤如急性淋巴細(xì)胞白血病或慢性淋巴細(xì)胞白血病，普遍表達(dá)B 細(xì)胞標(biāo)志物CD19，但實(shí)體瘤很少表達(dá)一種TSA。另一方面，本文提到的部分靶抗原如EpCAM、CEA 等均為TAA，CAR-T 細(xì)胞在清除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也有可能錯(cuò)誤地攻擊正常組織細(xì)胞，即所謂的“脫靶現(xiàn)象”，使得CAR-T 細(xì)胞療法不能得到預(yù)期的治療效果。

針對(duì)這一問題，有研究為CAR 串聯(lián)雙特異性靶抗原，只有當(dāng)CAR 與所有抗原同時(shí)結(jié)合時(shí)才能充分活化發(fā)揮殺傷作用[31]。還可利用低氧誘導(dǎo)因子1α 降解途徑來限制，只有CAR-T 細(xì)胞位于腫瘤低氧微環(huán)境時(shí)才表達(dá)CAR，從而減少對(duì)非惡性組織的負(fù)面影響（非惡性組織主要是非低氧狀態(tài)）[32]。最近，美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員開發(fā)了一種靶向LOH（雜合性缺失）的新型癌癥免疫療法NASCAR，即腫瘤靶向等位基因特異性CAR（neoplasm-targeting allele-sensing CAR），LOH 是惡性腫瘤中常見的一種基因突變，LOH 的發(fā)生有助于將癌細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開。該療法旨在將癌細(xì)胞中等位基因的缺失事件轉(zhuǎn)化為免疫細(xì)胞的激活信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的殺傷，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。

4.3 CAR-T 細(xì)胞的持久性

2017年于美國上市的兩款靶向CD19 的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，在治療B-ALL 和彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤方面表現(xiàn)出出色的療效，但研究發(fā)現(xiàn)約30%～50%接受CD19 CAR-T 療法的患者在達(dá)到緩解之后癌癥會(huì)再度復(fù)發(fā)，大多數(shù)復(fù)發(fā)出現(xiàn)在接受治療后1年內(nèi)，這通常是由于CAR-T 細(xì)胞持久性有限和/或B 細(xì)胞發(fā)育不全。且復(fù)發(fā)并不限于靶向CD19 的療法，CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中的增殖存活情況也并不樂觀觀[33]。

為提高CAR-T 抗腫瘤持久性、預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，有研究[34]設(shè)計(jì)了結(jié)合可誘導(dǎo)共刺激因子ICOS 和4-1BB 的第三代CAR-T 細(xì)胞，在實(shí)體腫瘤模型中顯示出了較為顯著的抗腫瘤作用和增強(qiáng)的體內(nèi)持久性。此外，另有研究[35]對(duì)CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行改造，使其過表達(dá)硫氧還蛋白1（thioredoxin-1，Trx1），以適應(yīng)TME 中營養(yǎng)物質(zhì)和氧減少的條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T 細(xì)胞的壽命明顯延長(zhǎng)、細(xì)胞活力也相應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)Trx1 的抗氧化作用可降低供體T 細(xì)胞中的毒性活性氧，使其對(duì)患者健康組織的反應(yīng)性降低，從而阻止GvHD 的發(fā)展。

4.4 不良反應(yīng)

CAR-T 細(xì)胞治療展現(xiàn)出顯著療效的同時(shí)，也伴隨著多種不良反應(yīng)，其中最常見且最嚴(yán)重的是細(xì)胞因子釋放綜合征/細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokine storm，CRS），當(dāng)大量有活性的CAR-T 回輸入體內(nèi)，會(huì)釋放大量促炎性細(xì)胞因子，如IL-6、IFN-γ、TFN-α 等，從而引起高燒、低血壓、多器官功能衰竭等臨床表現(xiàn)。除CRS 外，另一常見不良反應(yīng)為CAR-T 細(xì)胞相關(guān)腦病綜合征，可表現(xiàn)為語言障礙、手寫障礙和定向力障礙等，若發(fā)生腦水腫則屬于最嚴(yán)重的神經(jīng)毒性并發(fā)癥。值得注意的是，一項(xiàng)國內(nèi)開展的CLDN18.2 CAR-T（CT041）治療12 例轉(zhuǎn)移性腺癌（胃腺癌7 例）的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有患者均未發(fā)生嚴(yán)重不良事件，包括治療相關(guān)死亡或嚴(yán)重神經(jīng)毒性等。其他不良反應(yīng)包括腫瘤溶解綜合征、血細(xì)胞減少、感染，低免疫球蛋白血癥及乙肝病毒激活等。

目前解決方案主要有：使用糖皮質(zhì)激素來藥物，如甲潑尼龍；使用靶向阻斷上調(diào)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物，如托珠單抗（tocilzumab）；引入“自殺基因”，其基因產(chǎn)物會(huì)當(dāng) CAR-T 細(xì)胞處于不合理的活化時(shí)將其清除，避免CAR-T 細(xì)胞潛在的不良反應(yīng)等。

5 結(jié)語與展望

胃癌占比腫瘤的較大，因此亟需找到有效針對(duì)胃癌的治療手段，CAR-T 細(xì)胞治療在胃癌中也顯示出其獨(dú)有的價(jià)值，越來越多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行以驗(yàn)證其在胃癌中的安全性和有效性。綜上所述，CAR-T 技術(shù)的發(fā)展，以及CAR 的改良是未來治療癌癥的最有希望的方法之一，相信在不久的將來將出現(xiàn)更加成熟、安全和有效的CAR-T 細(xì)胞治療技術(shù)，利于延長(zhǎng)患者生存期。