剛果紅法定量檢測酵母β-葡聚糖的方法研究

曹樺強(qiáng)，劉琛儀，李賽芬，張彭湃*

1(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封，475004)2(河南省應(yīng)用微生物工程研究中心，河南 開封，475004)

酵母細(xì)胞壁來源的β-葡聚糖(yeast β-glucan, Y β-Glu)分為堿溶性和堿不溶性，堿不溶性酵母β-葡聚糖具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、改善腸道菌群[3]、提高人體免疫力等作用，在疾病的預(yù)防、治療方面有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。酵母β-葡聚糖也是一種大分子物質(zhì)，具有β-1,3鍵構(gòu)成的主鏈，以及β-1,6鍵形成的分支，并具有獨(dú)特的三螺旋空間結(jié)構(gòu)[4]，不溶于水、酸、堿。

剛果紅(Congo red，CR)是一種陰離子偶氮染料，棕紅色、粉狀，易溶于水，具有聯(lián)苯偶氮結(jié)構(gòu)，能與酵母β-葡聚糖三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性結(jié)合[5]。有研究表明，酵母β-葡聚糖中每1個(gè)3鏈6螺旋片段中可容納1分子的剛果紅，兩者之間可通過氫鍵和疏水鍵結(jié)合，形成穩(wěn)定的紅色復(fù)合物[6-7]，并使復(fù)合物在可見光區(qū)的最大吸收波長發(fā)生紅移[8-9]。根據(jù)此性質(zhì)可定量檢測酵母β-葡聚糖的含量。

酵母β-葡聚糖檢測方法有苯酚-硫酸法[10]、酶法[11]等，這些方法都是將多糖分解成葡萄糖分子，然后再換算為β-葡聚糖，忽略了其他多糖雜質(zhì)的影響，檢測結(jié)果特異性不好，誤差偏大，在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中具有一定的局限性。NITSCHKE等[9]建立了剛果紅試劑用于檢測具有β-1,3-1,6結(jié)構(gòu)的可溶性蘑菇多糖的方法，為具有相似結(jié)構(gòu)的酵母β-葡聚糖的檢測提供了借鑒，但酵母β-葡聚糖的不溶性，卻妨礙了該方法的直接應(yīng)用。王志等[12]利用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)作為酵母β-葡聚糖的助溶劑，實(shí)現(xiàn)了酵母β-葡聚糖溶解，剛果紅試劑得以用于酵母β-葡聚糖檢測，并建立了相應(yīng)的檢測體系。但是該方法沒有對檢測的特異性進(jìn)行研究，不能排除酵母細(xì)胞壁中堿溶性β-1,3葡聚糖的干擾，該文報(bào)道的可完全溶解β-葡聚糖的最低DMSO濃度，也與我們的研究結(jié)果有較大差異。此外緩沖液的選擇、檢測限等也沒有明確說明，影響了其實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。所以在此基礎(chǔ)之上，對剛果紅與酵母β-葡聚糖的反應(yīng)體系進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，明確檢測限以確定適用范圍，增設(shè)干擾物實(shí)驗(yàn)確定檢測的特異性，完善剛果紅試劑-酵母β-葡聚糖的檢測方法，以期對酵母β-葡聚糖的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要試劑

酵母β-葡聚糖、甘露聚糖，Sigma公司，酵母堿溶性β-1,3葡聚糖，Macklin公司；剛果紅，合肥博美生物科技公司；NaH2PO4、Na2HPO4、檸檬酸、檸檬酸三鈉、醋酸、醋酸鈉、二甲基亞砜(DMSO)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%剛果紅溶液(用pH 7.5的0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液溶解)。

酵母β-葡聚糖備用液：準(zhǔn)確稱量50 mg酵母β-葡聚糖，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的DMSO溶液，于70 ℃的水浴鍋中加熱3 h助溶，即得。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750型紫外-可見分光光度計(jì)，島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司；HH-1 J型水浴鍋，常州國旺儀器制造有限公司；PHS-2F型酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反應(yīng)體系

總反應(yīng)體系為4 mL，先加入擬定量的酵母β-葡聚糖溶液，再用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足至2 mL，最后加入2 mL剛果紅試劑，以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照，測定吸光度值。

1.2.2 檢測波長與吸收差譜測定

將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度為200 μg/mL，取1 mL于試管中，加磷酸鹽緩沖液1 mL，再加2 mL剛果紅試劑；以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照，進(jìn)行全波段光譜掃描。

1.2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.3.1 最適pH對反應(yīng)的影響

考察pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液對反應(yīng)體系的影響，反應(yīng)體系參照1.2.1，其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg；在25 ℃下反應(yīng)15 min，測定540 nm下的吸光度值。

1.2.3.2 最適溫度對反應(yīng)的影響

考察不同溫度對反應(yīng)的影響，設(shè)定反應(yīng)溫度為20、30、40、50、60 ℃，反應(yīng)體系參照1.2.1，其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg；在pH為7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中反應(yīng)15 min，測定540 nm下的吸光度值。

1.2.3.3 最適時(shí)間對反應(yīng)的影響

反應(yīng)體系參照1.2.1，其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg；在pH為7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25 ℃，考察不同反應(yīng)時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，選取反應(yīng)時(shí)間為5、10、15、20、25 min，分別測定540 nm下的吸光度值。

1.2.4 緩沖液種類對反應(yīng)的影響

對比pH 7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液、C6H8O7·H2O-C6H5Na3O7·2H2O緩沖液、CH3COOH-CH3COONa·3H2O緩沖液對反應(yīng)體系的影響，反應(yīng)體系參照1.2.1，其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg，通過全波段光譜掃描確定緩沖液種類對反應(yīng)的影響。

1.2.5 DMSO對酵母β-葡聚糖溶解的影響

準(zhǔn)確稱取酵母β-葡聚糖10 mg，加入10 mL不同體積分?jǐn)?shù)(選擇為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)的DMSO溶液，在70 ℃水浴鍋中處理3 h，根據(jù)酵母β-葡聚糖與剛果紅的反應(yīng)結(jié)果考察酵母β-葡聚糖在DMSO中的溶解情況。

1.2.6 剛果紅的檢測限測定

最低檢測限：將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度20 μg/mL，反應(yīng)體系參照1.2.1，在試管中分別加入0、2、4、6、8、10、12 μg的酵母β-葡聚糖，測定540 nm下的吸光度值。

最大檢測限：將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度1 mg/mL，反應(yīng)體系參照1.2.1，在試管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg的酵母β-葡聚糖，測定540 nm下的吸光度值。

1.2.7 酵母β-葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將酵母β-葡聚糖用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度200 μg/mL，按照表1加樣，考察不同酵母β-葡聚糖濃度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系。

表1 剛果紅法染色酵母β-葡聚糖實(shí)驗(yàn)組 單位：mL

1.2.8 精密度實(shí)驗(yàn)

將酵母β-葡聚糖備用液配制質(zhì)量濃度為200 μg/mL。反應(yīng)體系參照1.2.1，分別在5組試管中加入酵母β-葡聚糖160 μg，測定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.2.9 回收率實(shí)驗(yàn)

配制質(zhì)量濃度為200 μg/mL的酵母β-葡聚糖備用液。反應(yīng)體系參照1.2.1。每次加入酵母β-葡聚糖的量為200 μg，測定5次。計(jì)算回收率和RSD。

1.2.10 干擾物實(shí)驗(yàn)

以200 μg/mL酵母β-葡聚糖為對照品，配制200 μg/mL堿溶性β-1,3葡聚糖和甘露聚糖為干擾物，將干擾物加入反應(yīng)體系，測定吸光度3次并取平均值，以評價(jià)干擾效果和檢測方法準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收波長和吸收差譜的確定

將酵母β-葡聚糖和剛果紅反應(yīng)的復(fù)合物進(jìn)行全波段光譜掃描，以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照，如圖1所示。

a-吸收波譜；b-吸收差譜圖1 反應(yīng)復(fù)合物的全波段光譜掃描Fig.1 Full-band spectral scanning of the reaction complex

在剛果紅體系中加入酵母β-葡聚糖后吸收光譜發(fā)生了紅移現(xiàn)象。由吸收差譜可得最大檢測吸收波長為540 nm，故此后反應(yīng)體系均采用540 nm作為測定波長。

2.2 不同因素對反應(yīng)的影響

2.2.1 pH對反應(yīng)的影響

剛果紅是一種酸堿指示劑，其pH變色范圍為3.5～5.2，與β-葡聚糖反應(yīng)時(shí)應(yīng)在剛果紅的非變色范圍內(nèi)進(jìn)行測定，反應(yīng)pH與吸光度的關(guān)系如圖2-a所示：在pH 6.5～8.5內(nèi)，檢測結(jié)果差異不大，F(xiàn)=2.455，P=0.114>0.05，pH條件為反應(yīng)的非顯著性因素。因pH 7.5時(shí)吸光度值最大，故選擇緩沖液pH為7.5。

2.2.2 溫度對反應(yīng)的影響

在不同溫度下(20～60 ℃)反應(yīng)，測定吸光度，測定結(jié)果如圖2-b所示，在20～30 ℃時(shí)吸光度變化較為平緩，之后吸光度隨著溫度的升高迅速下降。溫度升高時(shí)，可能會(huì)引起1,3-β-葡聚糖鏈發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致其結(jié)合位點(diǎn)容納的剛果紅分子的數(shù)量減少[13]，故實(shí)驗(yàn)選擇20 ℃為反應(yīng)溫度。

2.2.3 時(shí)間對反應(yīng)的影響

時(shí)間與吸光度的關(guān)系如圖2-c所示，隨著反應(yīng)時(shí)間增長，反應(yīng)的吸光度逐漸升高后趨于平緩。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí)，吸光度達(dá)到最大值為0.231，故選擇反應(yīng)時(shí)間為15 min。β-葡聚糖與剛果紅結(jié)合后的吸收光譜是平衡時(shí)游離染料和復(fù)合物的吸收光譜之和，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆反應(yīng)過程，隨著時(shí)間的變化，其反應(yīng)會(huì)逐漸趨于平衡[14]。

a-pH；b-溫度；c-時(shí)間圖2 不同因素對反應(yīng)的影響Fig.2 The influence of different factors on the reaction

2.3 不同種類緩沖液的選擇結(jié)果

在540 nm處，吸光度值由上至下依次為，磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、剛果紅對照液。如圖3所示。

圖3 不同緩沖液對吸光度的影響Fig.3 The influence of different buffers on absorbance

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽溶液可能會(huì)導(dǎo)致β-葡聚糖無序的空間結(jié)構(gòu)向有序轉(zhuǎn)變，而有序的能更好地與剛果紅結(jié)合[14]。而在磷酸緩沖液中酵母β-葡聚糖與剛果紅結(jié)合更為靈敏，其結(jié)合度要高于其他幾種緩沖液。

2.4 不同體積分?jǐn)?shù)DMSO處理酵母β-葡聚糖的結(jié)果分析

用不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO處理酵母β-葡聚糖，其濃度與吸光度的關(guān)系如圖4所示。隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)增加，溶解的酵母β-葡聚糖逐漸增多，直接觀測法可明顯看出從50%～90%懸浮物逐漸減少，吸光度與DMSO體積分?jǐn)?shù)接近線性關(guān)系，說明此濃度范圍的DMSO溶液對酵母β-葡聚糖的空間結(jié)構(gòu)沒有破壞或破壞程度極?。辉?0%～100%時(shí)，溶液呈澄清透明狀，說明酵母β-葡聚糖被完全溶解，但吸光度有所降低，可能與酵母β-葡聚糖結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道[15]的DMSO能破壞酵母β-葡聚糖結(jié)構(gòu)說法有所不同，可能是實(shí)驗(yàn)所使用的酵母β-葡聚糖的分子質(zhì)量不同所致，其具體原因有待進(jìn)一步探究。

圖4 不同含量DMSO與吸光度的關(guān)系Fig.4 Relationship between different DMSO and absorbance

2.5 剛果紅檢測限結(jié)果分析

對酵母β-葡聚糖的最大檢測限和最小檢測限進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析，酵母β-葡聚糖的含量與吸光度關(guān)系如圖5所示。酵母β-葡聚糖的含量為0～4 μg時(shí)，其顏色反應(yīng)不足于檢測出來；當(dāng)含量大于4 μg，吸光度隨著含量增加而接近線性關(guān)系。當(dāng)含量達(dá)到1 600 μg時(shí)，吸光度逐漸趨于平穩(wěn)，其中線性較好的范圍是4～200 μg。2 mL的0.1 mg/mL剛果紅試液即為0.2 mg，可與4～1 600 μg內(nèi)酵母β-葡聚糖的發(fā)生反應(yīng)。說明酵母β-葡聚糖的三螺旋結(jié)構(gòu)片段與剛果紅分子結(jié)合有上限，并不是無限結(jié)合，其結(jié)合度與氫鍵和疏水鍵有關(guān)。

圖5 剛果紅檢測限Fig.5 Limit of detection of Congo red

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.7步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過Origin Pro 8.5軟件擬合回歸方程，酵母β-葡聚糖在4～200 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=0.001 15X-0.001 14，R2=0.998 6。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對同一批樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對該方法進(jìn)行精密度驗(yàn)證。分別在5組試管中加入相同量的酵母β-葡聚糖，測定吸光度，結(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD為1.154%，表明檢測方法重復(fù)性良好，可作為酵母β-葡聚糖檢測方法使用。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision test results

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在酵母β-葡聚糖樣品中加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品，測定回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，其平均回收率為100.32%，RSD為1.11%。準(zhǔn)確度高，可滿足一般檢測的需要。

表3 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of sampling recovery

2.9 干擾物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以酵母β-葡聚糖為對照組，在干擾組中分別加入β-1,3葡聚糖和甘露聚糖，測定干擾率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 干擾物實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of interference

結(jié)果顯示，β-1,3葡聚糖干擾率(0.587%)<精密度(RSD=1.154%)，說明β-1,3葡聚糖對檢測的結(jié)果影響較??；而甘露聚糖對反應(yīng)有較大的影響，但是在實(shí)際樣品的檢測中，經(jīng)過預(yù)處理后的甘露聚糖已經(jīng)被去除，并不影響測定結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)利用剛果紅與酵母β-葡聚糖特異性結(jié)合的性質(zhì)，對酵母β-葡聚糖進(jìn)行定量檢測，避免了傳統(tǒng)檢測方法間接、多步測定和誤差偏大的缺點(diǎn)，顯示出一定的優(yōu)越性。對剛果紅和酵母β-葡聚糖的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，0.1 mol/L，pH 7.5磷酸緩沖液使反應(yīng)靈敏度提高，最低檢出限提高為4 μg；溫度影響剛果紅和酵母β-葡聚糖兩者的結(jié)合度，在20 ℃下，結(jié)合度最大。15 min時(shí)，反應(yīng)可以達(dá)到平衡。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。精密度RSD為1.160%，平均回收率為100.32%，相比優(yōu)化前具有更好的精密度和更高的回收率，測定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定；干擾性實(shí)驗(yàn)顯示，反應(yīng)不受堿溶性β-1,3葡聚糖的干擾，而受甘露聚糖影響較大。酵母β-葡聚糖為不溶性物質(zhì)，經(jīng)過預(yù)處理以及中間的制備過程，可溶性的甘露聚糖幾乎被完全去除，幾乎無法檢出。因此，按照制備過程得到的酵母β-葡聚糖樣品可以忽略甘露聚糖對反應(yīng)的影響。但是對于市售的酵母細(xì)胞壁產(chǎn)品而言，其中存在較多的甘露聚糖，檢測前的預(yù)處理極為必要，須去除甘露聚糖才可以確保檢測的準(zhǔn)確性。

DMSO溶解實(shí)驗(yàn)說明，有效溶解酵母β-葡聚糖需要較高濃度的DMSO，酵母β-葡聚糖溶解度與DMSO作助溶劑時(shí)濃度間存在近似的線性關(guān)系，由此推測高濃度的DMSO并沒有對酵母β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)造成破壞或者破壞極小，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道[15]的結(jié)果存在一定的差異，所以還需進(jìn)行更深一步探討。

本實(shí)驗(yàn)完善了剛果紅與酵母β-葡聚糖反應(yīng)的具體條件，使之更具可操作性，對酵母細(xì)胞壁產(chǎn)品中的β-葡聚糖的檢測具有參考價(jià)值。