復(fù)合益生菌產(chǎn)品菌種鑒定及活菌定量檢測(cè)方法

周立光，楊明喆，馮會(huì)粉，劉藝茹，劉蕊，張欣，葛媛媛， 張旭光，劉佳奇，程坤，于學(xué)健，姚粟*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京,100015)2(湯臣倍健有限公司，廣東 廣州,510663)

益生菌是一類活的微生物，當(dāng)攝取足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主健康有益[1]，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、膳食補(bǔ)充劑、飼料等領(lǐng)域[2]。益生菌的功能具備菌株特異性[3]，且需要攝入足夠的數(shù)量才能達(dá)到預(yù)期功效，因此在選擇益生菌產(chǎn)品時(shí)，其活菌數(shù)量尤為重要?！兑嫔惐＝∈称飞陥?bào)與審評(píng)規(guī)定(征求意見(jiàn)稿)》規(guī)定“益生菌類保健食品在其保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)目不得少于106CFU/mL(g)”。近年來(lái)，隨著益生菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，多元化的復(fù)合益生菌產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，對(duì)復(fù)合益生菌產(chǎn)品的菌種水平進(jìn)行精確鑒定并確認(rèn)其活菌數(shù)是確保產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。

目前，乳酸菌的檢測(cè)主要基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，通過(guò)使用選擇性培養(yǎng)基分離益生菌產(chǎn)品中所含的微生物[4]，進(jìn)而通過(guò)BIOLOG[5]、FT-IR以及MALDI-TOF[6]等表型方法和16S rRNA基因[7]、功能基因[8]等基于分子標(biāo)記基因的遺傳學(xué)手段來(lái)進(jìn)行微生物菌種鑒定。盡管基于全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)技術(shù)的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)[9]和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析[10]技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)物種的精確鑒定，但仍需要獲得純培養(yǎng)物?；?6S rRNA基因序列的高通量測(cè)序，可以揭示產(chǎn)品屬水平的物種組成，并能檢測(cè)是否存在污染菌，采用宏基因組分箱方法能在種水平上精確評(píng)估益生菌種類，解析產(chǎn)品中的物種組成[11]。

流式細(xì)胞分析技術(shù)(flow cytometry analysis，F(xiàn)CM)是快速興起的非培養(yǎng)活菌定量技術(shù)，通過(guò)熒光染料的選擇可以快速區(qū)分活、死細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)樣品中活細(xì)胞的定量[12]，但目前該檢測(cè)技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)每種菌的活菌計(jì)數(shù)。反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(reverse transcription qPCR，RT-qPCR)可以實(shí)現(xiàn)活菌定量檢測(cè)的目的[13]，但RNA易降解，并且需將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行qPCR，操作過(guò)程復(fù)雜、容易帶來(lái)誤差，因此不適宜復(fù)雜樣品中的微生物檢測(cè)。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)是一種常見(jiàn)的活菌染料，其與qPCR結(jié)合的技術(shù)(propidium monoazide-quantitative PCR，PMA-qPCR)，不僅可以特異性地定量菌株數(shù)量，而且可以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞[14]，作為靶向方法具有良好的應(yīng)用潛力，已成為益生菌產(chǎn)品中乳酸菌活菌數(shù)量檢測(cè)的有效方法[15]，在腸道環(huán)境益生菌活菌數(shù)檢測(cè)[16]的研究中亦有廣泛應(yīng)用，在其他研究領(lǐng)域，如水環(huán)境[17]、生物膜[18]中活微生物的檢測(cè)以及流行病學(xué)研究中亦有文獻(xiàn)報(bào)道[19]。

本研究以2種市售復(fù)合益生菌固體飲料及其添加的5種(6株)益生菌為研究對(duì)象，采用宏基因組測(cè)序分析方法、ANI分析方法及PMA-qPCR方法，在菌種水平精確鑒定復(fù)合益生菌產(chǎn)品的物種組成，并對(duì)活菌數(shù)進(jìn)行快速定量，為復(fù)合益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考，對(duì)促進(jìn)益生菌在食品行業(yè)更加安全和廣泛的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 產(chǎn)品選擇

選擇2種市售復(fù)合益生菌固體飲料產(chǎn)品：Life·space益倍適?益生菌固體飲料(產(chǎn)品P1)由動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)Bi-07(簡(jiǎn)稱菌株Bi-07)、動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)HN019(簡(jiǎn)稱菌株HN019)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)HN001(簡(jiǎn)稱菌株HN001)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)CECT5716(簡(jiǎn)稱菌株CECT5716)和短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)M-16V(簡(jiǎn)稱菌株M-16V)組成，每袋(1 g)添加活菌75億CFU；Nature’s Bay天然博士?益生菌固體飲料(產(chǎn)品P2)由菌株HN019、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)299v(簡(jiǎn)稱菌株299v)、菌株HN001和菌株CECT5716組成，每袋(1 g)添加活菌≥60億CFU。

乳桿菌屬(Lactobacillus)微生物的表型和基因型具有多樣化特征，基于已公布的大量乳桿菌屬菌種的全基因組數(shù)據(jù)分析，原乳桿菌屬被重新劃分為25個(gè)屬，乳桿菌屬菌種分類學(xué)地位已發(fā)生重要變遷[20]。2020年6月更新的QPS名單已采納了新的分類學(xué)名稱，亦認(rèn)可原分類學(xué)名稱的使用?？紤]到新分類單元的使用存在過(guò)渡期，本研究仍沿用之前的乳桿菌屬國(guó)際分類體系。

1.1.2 主要試劑、儀器及培養(yǎng)基

DNA提取試劑盒(QIAGEN Dneasy Blood & Tissue DNA)，QIAGEN公司；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus))、pMD-19T TA克隆載體(TaKaRa pMD-19T vector)，寶生物工程(大連)有限公司；PMA，Biotium公司；DNA純化試劑盒(Cycle-pure kit)，OMEGA公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI，NEB公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基，BD公司。

BD1236核酸蛋白分析儀，Biodrop公司；TRIO48普通PCR儀，Biometra公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific 公司；PT-H18A LED光敏儀，Biotium公司；Bead Ruptor 12破碎儀，OMNI公司；7500型定量PCR儀，ABI公司；Miseq PE30016Sr RNA基因擴(kuò)增子測(cè)序平臺(tái)、Hiseq 3000宏基因組測(cè)序平臺(tái)，Illumina公司。

1.1.3 菌株及培養(yǎng)方法

產(chǎn)品聲稱添加的菌株：動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)Bi-07、動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)HN019、植物乳桿菌(L.plantarum)299v、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)HN001、短雙歧桿菌(B.breve)M-16V和發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)CECT5716分別分離自單一菌株制備而成的商業(yè)化純菌劑，16S rRNA 基因序列和持家基因序列鑒定結(jié)果表明6株菌在種(或亞種)水平上的分類學(xué)地位與商業(yè)化純菌劑聲稱一致。

5種菌的模式菌株：動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)CICC 24210T，短雙歧桿菌(B.breve)CICC 6079T，鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)CICC 6135T，植物乳桿菌(L.plantarum)CICC 6240T，發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)CICC 24209T均來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

雙歧桿菌屬菌株和乳桿菌屬菌株分別采用強(qiáng)化梭菌和MRS固體培養(yǎng)基在37 ℃下厭氧、避光培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

用于宏基因組測(cè)序的固體飲料樣品微生物總DNA的提取，按照QIAGEN Dneasy Blood & Tissue 提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用Biodrop測(cè)定DNA濃度和純度。

用于PMA-qPCR檢測(cè)的固體飲料樣品微生物總DNA及菌株純培養(yǎng)物的DNA提取，參考SCARIOT等[21]的方法，采用機(jī)械破碎生理鹽水菌懸液獲取DNA粗提液的方式進(jìn)行提取。所有DNA溶液置于-20 ℃ 保存待用。

1.2.2 16S rRNA 基因高通量測(cè)序及生物信息分析

1.2.2.1 PCR擴(kuò)增及Illumina Miseq測(cè)序

使用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將同一樣本的PCR產(chǎn)物(3個(gè)平行樣品)混合，以2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒(axygen biosciences AxyPrep DNA gel extraction kit)進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收效果。用QuantusTMFluorometer(美國(guó)Promega)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào)：SRR15195391、SRR15195390)。

1.2.2.2 數(shù)據(jù)處理及分析

使用fastp[22](https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH[23](http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE[24]軟件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根據(jù)97%[24]的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[25](http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)(v138)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.2.3 鳥(niǎo)槍法宏基因組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq(美國(guó)，Bioo Scientific)建庫(kù)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行文庫(kù)制備。使用Illumina Hiseq 3000(美國(guó)Illumina)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏基因組測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始數(shù)據(jù)已提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào)：SRR15194982、SRR15194981)。

1.2.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及拼接組裝

使用fastp[22](https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)對(duì)reads 3′端和5′端的adapter序列進(jìn)行質(zhì)量剪切，并去除剪切后長(zhǎng)度小于50 bp、平均堿基質(zhì)量值低于20以及含N堿基的reads，保留高質(zhì)量的pair-end reads 和single-end reads。

1.2.3.2 基因組重建

采用MetaWRAP宏基因組分析流程對(duì)clean reads 進(jìn)行分箱(Bining)操作。首先，利用read_qc模塊對(duì)clean reads進(jìn)行質(zhì)控；其次，用assembly模塊對(duì)質(zhì)控后的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝；再用binning模塊對(duì)組裝后的contigs進(jìn)行分箱操作[26]。利用checkM對(duì)分箱后bins的完整度和污染度進(jìn)行評(píng)估[27]。去除完整度<70%和污染度>5%的bin，對(duì)分箱結(jié)果再次提純優(yōu)化，利用blobology模塊進(jìn)行可視化分析[26]。

1.2.4 ANI分析

從NCBI genome數(shù)據(jù)庫(kù)下載5個(gè)種的模式菌株的基因組序列，利用ANI Calculator軟件分別對(duì)6個(gè)菌株與所在種內(nèi)模式株的基因組序列進(jìn)行ANI分析。以95%～96%的ANI值作為細(xì)菌物種界定的標(biāo)準(zhǔn)[9]，對(duì)6個(gè)菌株進(jìn)行物種鑒定。

1.2.5 PMA-qPCR 方法

1.2.5.1 PMA處理?xiàng)l件

參考GOBERT等[28]的方法制作熱致死菌體，略有改動(dòng)。刮取在37 ℃厭氧條件，固體培養(yǎng)48 h的乳酸菌，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至108CFU/mL的菌懸液(OD620為0.4左右)，分成2份，一份記為活菌，一份于80 ℃水浴處理20 min，取出立即于冰浴冷卻，記為死菌(利用平板菌落計(jì)數(shù)法來(lái)檢測(cè)無(wú)活菌生長(zhǎng))。

分別向500 μL活、死菌菌液中加入PMA溶液，使其終濃度為50 μmol/L，暗孵育5 min，每隔1 min混勻1次，于LED光敏儀曝光15 min。12 000 r/min室溫離心15 min收集菌體，用于純培養(yǎng)物DNA提取。通過(guò)qPCR檢測(cè)PMA處理?xiàng)l件計(jì)算對(duì)死菌DNA擴(kuò)增的抑制率，如公式(1)所示。

(1)

式中：C死菌-PMA(+)，樣品PMA處理的菌濃度，CFU/mL；C死菌-PMA(-)，樣品未經(jīng)PMA處理的菌濃度，CFU/mL。

1.2.5.2 引物篩選及特異性分析

通過(guò)文獻(xiàn)檢索5種乳酸菌常用引物，先通過(guò)NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)檢索引物特異性，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成，以1.1.3中的6株細(xì)菌為目標(biāo)菌株，通過(guò)直接熱裂解菌落的方式獲取DNA，PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證引物特異性。進(jìn)一步通過(guò)qPCR驗(yàn)證產(chǎn)物是否單一，引物來(lái)源及詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2.5.3 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

乳桿菌和雙歧桿菌分別接種于MRS和強(qiáng)化梭菌固體培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h。分別刮取菌株HN001、菌株CECT5716、菌株299v、菌株Bi-07和菌株HN019的菌體，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)OD620至0.4 左右，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定初始菌液濃度(CFU/mL)。取500 μL菌液，按照1.2.1的方法提取DNA；獲得的基因組DNA以10倍梯度稀釋至10-7，通過(guò)qPCR測(cè)定每個(gè)稀釋度DNA對(duì)應(yīng)的Cq值，以菌液濃度的對(duì)數(shù)值(lg CFU/mL)為x軸，Cq值為y軸，建立基于CFU的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)公式(2)計(jì)算qPCR擴(kuò)增效率：

E=10-1/s-1

(2)

式中：s為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

刮取半環(huán)短雙歧桿菌(B.breve)菌體，提取DNA，用qPCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目標(biāo)產(chǎn)物，利用Cycle clean試劑盒純化PCR產(chǎn)物。將純化的片段連接到pMD-19T Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans 5α，獲得攜帶目的序列的陽(yáng)性克隆。提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoRI對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行線性化，用Cycle clean試劑盒純化酶切產(chǎn)物，測(cè)定線性化DNA濃度。通過(guò)公式(3)將DNA濃度換算基因拷貝數(shù)濃度。

(3)

式中：NA，阿伏伽德羅常數(shù)，6.02×1023。

對(duì)線性質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，選擇10-2～10-9作為模板進(jìn)行qPCR，根據(jù)每個(gè)稀釋度對(duì)應(yīng)的質(zhì)?？截悢?shù)的lg值(橫坐標(biāo))和Cq值(縱坐標(biāo))繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算qPCR擴(kuò)增效率。

1.2.5.4 qPCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

qPCR 反應(yīng)體系：參考SYBR Premix ExTaqTM說(shuō)明書(shū)提供的反應(yīng)體系：SYBR qPCR Mix 12.5 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、50×Rox 0.5 μL、稀釋的DNA模板5 μL，加無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。

qPCR反應(yīng)條件：每對(duì)引物的反應(yīng)條件略有不同，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)入溶解曲線分析，程序?yàn)?5 ℃ 逐步升溫至95 ℃，每升溫0.5 ℃檢測(cè)一次熒光信號(hào)，每次檢測(cè)持續(xù)5 s。

1.2.6 PMA-qPCR 定量檢測(cè)產(chǎn)品中的活菌數(shù)

根據(jù)產(chǎn)品聲稱的活菌總數(shù)，加入適當(dāng)體積的生理鹽水，使活菌濃度為108CFU/mL，混勻并充分溶解菌粉；取500 μL菌液于1.5 mL無(wú)菌離心管中，12 000 r/min室溫離心15 min收集菌體，去掉上清液；再用500 μL的生理鹽水清洗菌體1次；用500 μL生理鹽水充分懸勻菌體，按照1.2.5進(jìn)行PMA處理；按照1.2.1的方法提取基因組DNA，通過(guò)qPCR定量檢測(cè)產(chǎn)品中每種菌的活菌數(shù)。

1.2.7 平板菌落計(jì)數(shù)

按照1.2.6的方法溶解菌粉；對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋，選取2～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度菌液1 mL于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，于37 ℃ 厭氧、避光培養(yǎng)72 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)品中微生物多樣性分析

通過(guò)基于16S rRNA 基因的338～806 nt區(qū)域進(jìn)行PE300高通量測(cè)序，分析產(chǎn)品P1和P2中的微生物組成。過(guò)濾后，P1和P2的序列數(shù)分別為61 338和69 853條(表2)。序列平均長(zhǎng)度為424 bp，每種產(chǎn)品的有效序列均超過(guò)50 000條，且稀釋曲線均趨于平穩(wěn)，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足微生物多樣性分析的要求。

表2 產(chǎn)品16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序 信息統(tǒng)計(jì) 單位：bp

每個(gè)產(chǎn)品的測(cè)序結(jié)果分析均只產(chǎn)生4個(gè)OTU，表明產(chǎn)品P1和P2中均存在4種菌，與P1和P2聲稱添加的菌種組成一致。對(duì)獲得的OTU進(jìn)行注釋，在種水平上，除一種雙歧桿菌注釋至屬(unclassifiedBifidobacterium)水平外，P1中含有的其他3種菌分別注釋為發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、短雙歧桿菌(B.breve)；P2中含有的其他3種菌分別注釋為發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、植物乳桿菌(L.plantarum)，均與產(chǎn)品聲稱的菌種一致。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明顯示的物種添加信息，推測(cè)是由于動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種的種間相似性高，短片段的16S rRNA 基因無(wú)法將其界定到種水平。為了在種水平上精確鑒定產(chǎn)品中的每個(gè)物種，同時(shí)對(duì)產(chǎn)品DNA進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

2.2 產(chǎn)品中的物種鑒定

2.2.1 益生菌基因組重建

對(duì)基于Illumina Hiseq 3000測(cè)序平臺(tái)的宏基因組數(shù)據(jù)，采用fastp軟件、堿基質(zhì)量值≥20，對(duì)Raw reads進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控后產(chǎn)品P1和P2的clean reads 數(shù)分別為98 414 620和99 779 276條，每種產(chǎn)品質(zhì)控后的clean reads均占Raw reads的98.77%以上(表3)。

表3 產(chǎn)品宏基因組測(cè)序質(zhì)控后數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Data statistics after metagenomic sequencing and quality-control

采用MetaWRAP宏基因組分析流程，用maxbin2算法對(duì)組裝后的contigs進(jìn)行分箱(binning)，每個(gè)產(chǎn)品的contigs數(shù)據(jù)均被分為4個(gè)bins(表4)，與OTU數(shù)和產(chǎn)品添加的菌種數(shù)一致。

利用checkM對(duì)分箱后bins的完整度和污染度進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明，P1和P2分箱產(chǎn)生的bins的完整度均高于98%，污染度均低于5%(表4)，成功實(shí)現(xiàn)了P1和P2宏基因組數(shù)據(jù)的分箱。每個(gè)bin分別通過(guò)blast與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，初步分析每個(gè)bin所代表的物種(圖1)，與16S rRNA基因微生物多樣性一致。宏基因數(shù)據(jù)分箱成功實(shí)現(xiàn)4種菌的基因組重建。

表4 宏基因組分箱結(jié)果Table 4 The results of metagenomics binning

a-宏基因組分箱分析產(chǎn)品P1 的bins豐度； b-宏基因組分箱分析產(chǎn)品P2 的bins豐度圖1 Bin豐度散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plots of bins abundance

2.2.2 益生菌種水平鑒定

對(duì)分箱獲得的bins與NCBI NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定其代表的菌種。進(jìn)一步通過(guò)bins與所代表種內(nèi)的模式菌株的基因組進(jìn)行ANI分析，每個(gè)樣品中的4個(gè)bins與模式菌株基因組ANI分析的值均大于96%，表明每個(gè)bin代表的菌種與模式菌株為同一個(gè)種(表5)。產(chǎn)品P1中的bin 0與B.animalis種內(nèi)的B.animalissubsp.lactisDSM 10140T相似性較高，ANI值為99.99%；產(chǎn)品P2中的bin 2與B.animalis種內(nèi)的B.animalissubsp.lactisDSM 10140T相似性較高，ANI值亦接近99.99%；表明P1中的bin 0和P2中的bin 2代表的均為B.animalissubsp.lactis(表5)，與產(chǎn)品聲稱一致。通過(guò)circos v 0.69-8 軟件對(duì)產(chǎn)品中的bins進(jìn)行可視化，每個(gè)bin中挑選最長(zhǎng)的12條contigs進(jìn)行作圖(圖2)。

表5 Bins與參考模式菌株基因組ANI 分析結(jié)果Table 5 The analysis results of ANI between bins and type strains genomes

圖2 通過(guò)宏基因組分箱進(jìn)行產(chǎn)品菌種基因組重建Fig.2 Re-constructed genomes from probiotic products by means of the metagenomics binning 注：每一個(gè)產(chǎn)品的bins 都由橫向排列的遺傳圖譜來(lái)表示；相同物種用同一種顏色顯示，綠色“√”表示分箱得到的物種與產(chǎn)品聲稱菌種一致

2.3 建立PMA-qPCR 檢測(cè)體系

2.3.1 引物特異性分析

引物的特異性結(jié)合是qPCR檢測(cè)生物量準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。通過(guò)NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)文獻(xiàn)中篩選的引物特異性進(jìn)行初步判斷，進(jìn)而通過(guò)普通PCR擴(kuò)增檢測(cè)引物的特異性，最后通過(guò)qPCR溶解曲線判斷產(chǎn)物的單一性。如表6所示，發(fā)酵乳桿菌引物(LFer-1/LFer-2)、植物乳桿菌引物(LplantarumF/LplantarumR)、鼠李糖乳桿菌引物(LrhamnosusF/LrhamnosusR)在種間、自身基因組中均具有高特異性，每株菌基因組DNA的PCR擴(kuò)增條帶的大小與模式菌株(陽(yáng)性對(duì)照)基因組DNA、靶菌株基因組DNA及對(duì)應(yīng)產(chǎn)品總基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小一致，并且qPCR溶解曲線為單一峰；短雙歧桿菌引物(BiBRE-1/BiBRE-2)以菌株HN019基因組DNA為模板時(shí)，會(huì)產(chǎn)生弱的條帶，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種引物(Bal-talF/Bal-talR)在以菌株299v基因組DNA為模板時(shí)，亦會(huì)產(chǎn)生弱的條帶，但兩條帶的大小與模式菌株(陽(yáng)性對(duì)照)基因組DNA、靶菌株基因組DNA及對(duì)應(yīng)產(chǎn)品總基因組DNA的PCR擴(kuò)增條帶大小不一致，并且產(chǎn)品qPCR溶解曲線單一，不影響P1中短雙歧桿菌和P2中動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種的準(zhǔn)確定量。

表6 qPCR 引物特異性檢測(cè)Table 6 The specificity test of qPCR primers

2.3.2 建立定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以2種產(chǎn)品中的6株菌為研究對(duì)象，分別建立每株菌的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表7所示，qPCR反應(yīng)信號(hào)Cq值與菌落濃度的對(duì)數(shù)值(lg CFU/mL)之間線性關(guān)系良好(R2>0.98)；通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系與條件，擴(kuò)增效率均達(dá)到85%～110%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)限為102CFU/mL(表7)。

表7 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)信息Table 7 The parameter information of standard curves for qPCR

2.3.3 PMA條件確定

因不同微生物對(duì)PMA的敏感度不同[33]，采用qPCR方法檢測(cè)PMA作用條件對(duì)6株乳酸菌死菌DNAqPCR擴(kuò)增的抑制，以及對(duì)活菌DNA qPCR的影響。參考益生菌及致病菌活菌數(shù)定量研究中最常用的PMA作用條件[30]：PMA終濃度為50 μmol/L，暗孵育時(shí)間5 min，曝光時(shí)間15 min，作為最初的PMA作用條件。

2.3.3.1 PMA處理對(duì)活菌qPCR擴(kuò)增影響

取新鮮的純培養(yǎng)物，調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL左右，通過(guò)qPCR檢測(cè)PMA作用條件對(duì)活菌DNA qPCR的影響。通過(guò)t檢驗(yàn)分析不加PMA處理的活菌與加PMA處理的活菌qPCR的Cq值，結(jié)果表明，6株菌的活菌在有和無(wú)PMA處理后，其qPCR 的Cq 值間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖3-a)，表明在有、無(wú)PMA處理的樣品中可擴(kuò)增的靶DNA量基本相等，表明此PMA作用條件不影響活菌qPCR擴(kuò)增。

2.3.3.2 PMA處理對(duì)死菌qPCR 抑制

通過(guò)1.2.5.1中的公式計(jì)算PMA作用條件對(duì)死菌DNA 的qPCR 擴(kuò)增抑制率。結(jié)果表明，6株菌的抑制率均高達(dá)99.11% 以上(圖3-b)。最終通過(guò)qPCR確定，除菌株CECT 5716 PMA作用終濃度為40 μmol/L外，其他5個(gè)菌株的PMA作用終濃度均為50 μmol/L；所有菌株P(guān)MA處理的暗孵育時(shí)間均為5 min，曝光時(shí)間均為15 min。

a-50 μmol/L PMA對(duì)活菌DNA的PCR擴(kuò)增影響； b-50 μmol/L PMA對(duì)死菌DNA的PCR擴(kuò)增抑制率圖3 PMA作用條件對(duì)活菌和死菌DNA qPCR的影響Fig.3 Effect of PMA treatment on DNA qPCR of viable and non-viable bacteria

2.3.4 PMA-qPCR檢測(cè)方法的可靠性評(píng)估

調(diào)整純菌株培養(yǎng)物的菌液濃度至108CFU/mL，基于建立的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每株菌的活菌數(shù)，并與菌落計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較。如表8所示，t檢驗(yàn)分析2種活菌計(jì)數(shù)方法，結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表明在菌液濃度為108CFU/mL左右時(shí)，PMA-qPCR方法具有良好的可靠性。

表8 PMA-qPCR與平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)6株 菌活菌數(shù)的檢測(cè)結(jié)果Table 8 Detection results of six strains of viable bacteria by PMA-qPCR and colony counting

2.4 PMA-qPCR檢測(cè)方法在產(chǎn)品中的應(yīng)用

復(fù)合益生菌產(chǎn)品是一種由多菌種混合的食品，檢測(cè)其活菌數(shù)是判斷產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。在種水平檢測(cè)復(fù)合益生菌產(chǎn)品中每種菌的含量仍具有一定難度。目前，關(guān)于PMA-qPCR方法用于益生菌及致病菌靶菌種的活菌定量檢測(cè)的研究較多。本研究亦采用PMA-qPCR檢測(cè)法，在種水平上對(duì)市售2種固體飲料P1和P2中的6株益生菌的活菌數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。

如圖4所示，將產(chǎn)品P1中每種菌的PMA-qPCR定量結(jié)果相加獲得產(chǎn)品P1的活菌總數(shù)為1.01×1010CFU/g，t檢驗(yàn)分析其與平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果1.01×1010CFU/g無(wú)顯著性差異(P=0.78>0.05)。產(chǎn)品中B.animalissubsp.lactis和L.rhamnosus含量較高，分別為4.86×109和4.33×109CFU/g；其次為L(zhǎng).fermentum3.95×108CFU/g，3種益生菌活菌數(shù)與產(chǎn)品實(shí)際添加數(shù)量基本吻合。B.breve的含量最低，約為6.38×106CFU/g，在純菌株培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌M-16V對(duì)環(huán)境敏感，易死亡，PMA-qPCR檢測(cè)結(jié)果亦顯示短雙歧桿菌活菌數(shù)量低于實(shí)際添加量，推測(cè)短雙歧桿菌M-16V的不穩(wěn)定性是導(dǎo)致其活菌檢出量低的主要原因。

a-產(chǎn)品P1;b-產(chǎn)品P2圖4 PMA-qPCR 法檢測(cè)產(chǎn)品中6 株乳酸菌的含量Fig.4 Quantitative test results of six strains of lactic acid bacteria in products by PMA-qPCR

將產(chǎn)品P2中每種菌的PMA-qPCR 定量結(jié)果相加獲得產(chǎn)品P2的活菌總數(shù)為6.00×109CFU/g，t檢驗(yàn)分析其與平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果4.35×109CFU/g無(wú)顯著性差異(P=0.427>0.05)。產(chǎn)品中L.rhamnosus含量最高，為3.12×109CFU/g；其次為L(zhǎng).plantarum和L.fermentum，活菌數(shù)分別為1.53×109和9.36×108CFU/g；B.animalissubsp.lactis含量最低，約為4.16×108CFU/g，4種益生菌活菌數(shù)量與產(chǎn)品實(shí)際添加數(shù)量基本吻合。

3 結(jié)論

復(fù)合益生菌產(chǎn)品的菌種組成與活菌數(shù)的含量是產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵，本研究以2種復(fù)合益生菌固體飲料及其添加的5種(6株)益生菌為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序及組學(xué)分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了2種復(fù)合益生菌產(chǎn)品物種組成的精確鑒定；通過(guò)PMA-qPCR方法實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品中每種乳酸菌活菌數(shù)快速定量檢測(cè)。采用多技術(shù)聯(lián)用，構(gòu)建適合益生菌產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的快速、精準(zhǔn)的活菌計(jì)數(shù)及檢測(cè)技術(shù)體系已成為益生菌行業(yè)的重要研究方向，本研究為建立和完善復(fù)合益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐，有助于提升產(chǎn)品評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制及市場(chǎng)監(jiān)管水平。