清香型白酒立醅期酒醅中主體酸和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)動態(tài)解析

趙欣怡，甄攀，趙鑫銳,3,4，韓英，李江華,3,4，王軍燕，堵國成,3,4，陳堅,3,4*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽，032205) 3(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)4(江南大學(xué) 未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫，214122)

白酒的常見香型主要包括：醬香型、濃香型、清香型等[1]，其中清香型白酒因其“清蒸二次清”、地缸、固態(tài)分離發(fā)酵的工藝特點(diǎn)，“清字當(dāng)頭，一清到底”的工藝獨(dú)特性，清、爽、綿、甜、凈的質(zhì)量典型性，養(yǎng)大楂、擠二楂的生產(chǎn)規(guī)律性，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。

白酒中的風(fēng)味成分主要包括酸、酯、醇、醛和其他這五大類[2]，其中有機(jī)酸是白酒重要的呈味物質(zhì)，能起到呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用，其含量及相互比例直接影響著白酒的風(fēng)味和質(zhì)量[3-6]。清香型白酒中的主要酸為乳酸和乙酸[7-8]，在清香型白酒的釀造過程中，缸內(nèi)高粱經(jīng)過蒸煮后發(fā)酵的固體糧食材料即為酒醅，酒醅經(jīng)過蒸餾即可得到原酒，故清香型白酒酒醅中的乳酸、乙酸含量對清香型白酒的品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。

立醅是生產(chǎn)過程中的第一道關(guān)口，立醅期是決定生產(chǎn)周期好壞的關(guān)鍵性因素。清香型大曲酒的立醅時間一般在9月份，此時氣溫、地溫較高，再加上立醅時所用的全部是糧食，淀粉濃度高，酒醅升溫快，來火猛，發(fā)酵快。若控制不當(dāng)，容易造成酒醅酸敗從而影響后續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)。并且由于酒醅中的淀粉酶和酵母僅適合于微酸性條件，所以酒醅中的酸度也不能過高，立醅期紅糝入缸酸度一般在0.2左右。故監(jiān)測立醅期大楂、二楂的主體酸含量變化情況對清香型白酒的生產(chǎn)有著十分重要的作用。

清香型酒醅中微生物組成十分復(fù)雜，主要包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌，其中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，尤其是乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)對酒體品質(zhì)起著決定性作用。乳酸菌能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸[9]，酒醅中乳酸的過量堆積會嚴(yán)重影響清香型白酒的口感，且酸度過大是固態(tài)發(fā)酵夏季掉排、出酒率降低的重要原因[10]，故采用高通量測序技術(shù)分析酒醅中乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)，篩選出高產(chǎn)酸能力的乳酸菌種對清香型酒醅釀造有著重大的應(yīng)用價值。

目前的研究主要集中于白酒中有機(jī)酸含量變化以及其他時期酒醅中菌群結(jié)構(gòu)的變化，對于清香型白酒立醅期的酒醅鮮有研究。本文主要對清香型白酒立醅期酒醅樣品中有機(jī)酸含量以及細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

酒醅樣品來源于山西杏花村汾酒廠有限公司。

表1 取樣時間Table 1 Sampling time

1.2 主要試劑及儀器

乳酸、乙酸， Aladdin公司。

GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)，美國 Bio-Rad 公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；UPH-IV-5/10/20T臺上式超純水儀，南京優(yōu)普公司；PowerPac系列電泳儀，美國Bio-Rad公司；RC3BPPlus離心機(jī)，美國Thermo公司；5425 FA-24x2臺式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 乳酸、乙酸含量的測定

酒醅樣品處理：準(zhǔn)確稱取1.00 g發(fā)酵酒醅于10 mL離心管中，加入6 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇攪勻。在室溫下浸泡30 min，在此期間每隔10 min攪拌一次，6 000 r/min 離心5 min；收集上清液，再往濾渣中加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，再次離心并收集上清液；全部上清液定容于10 mL容量瓶得到液相檢測樣品，備用。

標(biāo)準(zhǔn)混合液的配制[11]：分別準(zhǔn)確量取0.1 mL乳酸和乙酸的標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇色譜溶解并定容于100 mL容量瓶中，即得混合母液。分別量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL標(biāo)準(zhǔn)混合母液用去離子水稀釋、定容于10 mL容量瓶，得到8.0～650.0 mg/L不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，備用。

流動相的配制：準(zhǔn)確稱取6.80 g KH2PO4，用去離子水溶解、定容于1 000 mL容量瓶，并用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.50，再經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾、超聲脫氣30 min后使用；色譜級乙腈經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾、超聲脫氣30 min后使用。

液相色譜條件：T13色譜柱；流動相V(乙腈)∶V(0.05 mol/L KH2PO4)=8∶92；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長210 nm。

等毛夫人平靜了些，秦明月與邢慧一起對毛夫人進(jìn)行了詢問。據(jù)毛夫人介紹，大約兩周前，也就是7月1日，毛德君下班前電話說是晚上有應(yīng)酬可能晚一點(diǎn)回。毛夫人也沒有在意，因?yàn)檫@樣的事對于事業(yè)如日中天的毛德君來說是再正常不過的。但是此后就沒有再與她聯(lián)系過，打電話也始終處于關(guān)機(jī)狀態(tài)，其后毛德君夫人找遍他所有的社交圈均沒有人看到，毛德君失蹤后，他的家人、醫(yī)院、擔(dān)任教授的醫(yī)學(xué)院、兼職健康講座的電視臺都瘋狂地找。他就這樣在千萬人口的城市中神秘失蹤了，直到昨天在火車站以行李的方式寄存被發(fā)現(xiàn)。

1.4 酒醅微生物DNA的提取

首先稱取10 g酒醅樣品加入15～20 mL滅菌后的PBS，加入3顆玻璃珠，將50 mL離心管放置在振蕩儀上振蕩5 min，隨后150×g離心5 min。再重復(fù)2次之前的步驟，每次加5～10 mL的PBS，振蕩儀可改成手搖。緩慢傾倒收集上清液，用PBS精確配平后10 000 r/min離心10 min，往樣品中加入PBS多次吹吸，收集沉淀至5 mL管中，大顆粒盡量留在原管中。隨后10 000 r/min離心10 min。最后往得到的沉淀中加入500 μL PBS混懸，接著反復(fù)凍融3次，液氮30 s，70 ℃水浴2 min。往離心管中先加5 μL溶壁酶，30 ℃水浴1 h；接著加2 μL溶菌酶，37 ℃水浴30 min；隨后加5 μL RNA酶，37 ℃水浴1 h；最后加2.5 μL蛋白酶K，65 ℃水浴30 min。采用QIAGEN試劑盒提取，利用瓊脂糖電泳對提取的微生物DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，合格后進(jìn)行建庫、測序。

1.5 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

建庫與測序由武漢華大基因公司完成。取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品30 ng及對應(yīng)的融合引物配置PCR反應(yīng)體系，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer，貼上標(biāo)簽，完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 對文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測。檢測合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq平臺進(jìn)行測序。下機(jī)數(shù)據(jù)過濾，剩余高質(zhì)量的Clean data用于后期分析；通過reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成Tags；將Tags聚類成OTU并與數(shù)據(jù)庫比對、物種注釋；基于OTU和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析，組間物種差異分析，以及關(guān)聯(lián)分析與模型預(yù)測等。對原始的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得Clean Data。OTU聚類有2種方法，Usearch和DADA2。如果聚類方法用的是Usearch，要用這里的tag直接進(jìn)行OTU聚類，序列拼接使用軟件 FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads)，利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags。對OTU聚類結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，得到OTU代表序列后，通過RDP classifer軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫有比對進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.6。比對數(shù)據(jù)庫對注釋結(jié)果進(jìn)行過濾，剩余的OTU可用于后期分析。

1.6 產(chǎn)乳酸關(guān)鍵微生物的篩選及鑒定

首先用稀鹽酸調(diào)節(jié)MRS瓊脂培養(yǎng)基pH至6.0，接著在滅菌后，凝固前液體狀態(tài)的培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為8 μg/mL的兩性霉素以抑制真菌的生長。用分析天平稱取8 mg的兩性霉素，置于超凈臺中紫外滅菌15 min，接著往兩性霉素中加入1 mL DMSO混勻后用1.5 mL的離心管分裝，配成8 mg/mL溶液。使用時，往培養(yǎng)基中加入0.1%的量。最后往滅菌后的液態(tài)培養(yǎng)基中加一定量的溴甲酚綠作為乳酸菌產(chǎn)酸的指示劑，取0.1 g溴甲酚綠溶于5 mL DMSO中，最后將配好的溶液加入至1 L培養(yǎng)基中。

準(zhǔn)確稱取10.0 g酒醅于含玻璃珠的滅菌后的100 mL PBS中，室溫振蕩20～30 min混合，靜置后取上清液1 mL置于9 mL無菌水試管中，得到10-1的稀釋液，以此類推，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋樣液。吸取0.1 mL梯度稀釋液均勻涂布于培養(yǎng)基平板上，同一稀釋梯度涂2個板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96～120 h，剛開始培養(yǎng)時每隔4 h觀察一次菌落顏色是否變綠，及時將變綠菌落標(biāo)記出來。

根據(jù)稀釋涂布平板上的單菌落特征，挑取變色菌落中形態(tài)不同的菌株在MRS平板上劃線純化3～4次，得到單菌落后接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)一定時間后保藏在甘油管中-20 ℃?zhèn)溆?。采用分子生物學(xué)的鑒定方法對菌株進(jìn)行鑒定[12-13]。

1.7 產(chǎn)乳酸關(guān)鍵微生物的產(chǎn)酸能力驗(yàn)證

將篩選所得菌株與16S擴(kuò)增子測序的種水平數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行比對，選出占比較大的菌株。將這些菌株在MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行液體培養(yǎng)，活化后接種500 μL至50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，各菌株接種3個平行，37 ℃下靜置培養(yǎng)，前兩天每隔12 h取樣，后期每隔24 h取樣，檢測各菌株在發(fā)酵過程中的pH下降速率，采用HPLC技術(shù)檢測發(fā)酵趨于穩(wěn)定時發(fā)酵液中的乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸等含量，用以評估各菌株的產(chǎn)酸能力，挑選出產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌株。

1.8 產(chǎn)乳酸關(guān)鍵微生物的耐酸、醇能力驗(yàn)證

耐酸性實(shí)驗(yàn)：已知酒醅環(huán)境pH值為3.5～4.5。將滅菌的MRS培養(yǎng)基用乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，將活化好的菌株按體積比1%的接種量分別接入調(diào)節(jié)pH后的MRS培養(yǎng)基中，每個梯度3個平行，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，以未接菌的MRS培養(yǎng)基為對照，用酶標(biāo)儀測定其吸光度[14]以得出該菌的耐酸能力。

耐醇性實(shí)驗(yàn)：設(shè)置體積分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%乙醇梯度的MRS培養(yǎng)基，將活化好的菌株按體積比1%的接種量分別接入調(diào)節(jié)pH后的MRS培養(yǎng)基中，每個梯度3個平行， 37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，以未接菌的MRS培養(yǎng)基為對照，用酶標(biāo)儀測定其吸光度得出該菌的耐酸能力

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅發(fā)酵過程中主要有機(jī)酸的變化情況

在清香型白酒酒醅發(fā)酵過程中，酒醅中的有機(jī)酸以乳酸含量最高，占支配地位，乙酸含量次之[15]，故乳酸、乙酸是構(gòu)成酒體風(fēng)味的主要有機(jī)酸，立醅期酒醅中適當(dāng)?shù)乃岷繉罄m(xù)清香型白酒生產(chǎn)有著十分重要的作用。對清香型白酒大楂、二楂在不同發(fā)酵階段的乳酸、乙酸變化情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在大楂發(fā)酵階段，發(fā)酵初期0～7 d乳酸含量逐漸升高，7 d后至出缸時乳酸含量無顯著變化，逐漸趨于平穩(wěn)(圖1-a)；乙酸則在發(fā)酵初期0～15 d顯著增加，15 d之后增長速率放緩(圖1-b)。

在二楂發(fā)酵階段，乳酸、乙酸的初始含量與酒醅大楂時期出缸時的主體酸含量基本一致，這說明大楂出缸時蒸餾酒醅的步驟對有機(jī)酸的損失影響較小，這與清香型白酒生產(chǎn)過程的實(shí)際情況相一致。乳酸在發(fā)酵初期0～15 d含量逐漸增加但增長速率減緩，15 d至出缸時乳酸含量緩慢下降(圖1-c)；乙酸變化情況與大楂時相似，從整體上看入缸至出缸時酒醅中乙酸含量處于上升狀態(tài)，發(fā)酵初期0～4 d乙酸含量增長速率較高，4～22 d乙酸增長速率放緩，22 d至出缸時乙酸增長速率又顯著提高(圖1-d)。

立醅期大楂酒醅中的乳酸含量為3.20～7.74 g/L,乙酸為0.58～0.93 g/L；二楂酒醅中乳酸含量為7.85～13.9 g/L，乙酸含量為0.86 ～1.43 g/L，由此可知二楂酒醅中的主體酸含量顯著高于大楂酒醅，這是因?yàn)樵谶M(jìn)行二楂蒸餾時，會再一次添加輔料，二楂酒醅與大楂時相比更為疏松，且此時酒醅中已含有大楂發(fā)酵階段產(chǎn)生的各種代謝物質(zhì)，所以二楂階段微生物迅速繁殖，升溫提前[16]，同時由于二楂混料時曲細(xì)，水分大，入缸溫度高，高溫時間顯著早于大楂。高溫及二楂的混料工藝適合產(chǎn)酸細(xì)菌的生長，因此二楂酒主體酸含量顯著高于大楂酒[17]。

由乳酸、乙酸含量變化范圍也可知立醅期酒醅中的乳酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙酸含量，從圖2可知，大楂酒醅中乳酸與乙酸之比在5.53～9.93，在發(fā)酵初期(0～4 d)乳酸與乙酸比值顯著升高，4～15 d乳酸與乙酸比值逐漸降低，15 d之后乳酸乙酸比值趨于平穩(wěn)；二楂酒醅中乳酸與乙酸之比為8.62～11.48，在發(fā)酵初期0～15 d乳酸與乙酸比值逐漸升高，發(fā)酵后期15 d至出缸時乳酸與乙酸比值顯著降低，這與乳酸變化情況基本一致。綜上所述，除二楂酒醅中的主體酸含量高于大楂酒醅外，二楂酒醅乳酸與乙酸的比值也始終高于大楂酒醅。

a-大楂乳酸濃度；b-大楂乙酸濃度；c-二楂乳酸濃度；d-二楂乙酸濃度圖1 大楂、二楂酒醅發(fā)酵過程中乳酸、乙酸變化情況Fig.1 Change of lactic acid, acetic acid in fermented grains of Dacha and Ercha

圖2 酒醅發(fā)酵過程中乳酸與乙酸含量比例的變化情況Fig.2 Change in the ratio of lactic acid to acetic acid during the fermentation of fermented grains

2.2 酒醅發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析及其變化規(guī)律

乳酸菌能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸[9]，酒醅中酸類物質(zhì)的產(chǎn)生主要是不同微生物作用的結(jié)果。為了進(jìn)一步認(rèn)識清香型酒醅中微生物隨時間的變化規(guī)律，對不同發(fā)酵時間大楂和二楂階段的酒醅微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。從酒醅16S擴(kuò)增子測序結(jié)果可以看出，立醅期發(fā)酵過程中的主要細(xì)菌門類包括厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，其中厚壁菌門在酒醅樣品中的占比最高，在清香型酒醅發(fā)酵過程中始終處于優(yōu)勢地位[18]。

進(jìn)一步從屬水平對立醅期酒醅發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，所有酒醅樣品中豐度較高的菌種有13種，包括：泛菌屬(Pantoea)、克羅彭施泰特氏菌屬(Kroppenstedtia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、普氏菌屬(Prevotella)、GPI、魏斯氏菌屬(Weissella)、擬桿菌屬(Bacteroides)。

其中厚壁菌門下的乳桿菌屬在整個發(fā)酵過程中始終占有絕對的優(yōu)勢，故乳酸菌的代謝產(chǎn)物乳酸的含量在發(fā)酵過程中始終處于高位。隨著發(fā)酵時間的延長，在大楂(DX)酒醅樣品發(fā)酵初期0～7 d過程中乳桿菌屬的相對豐度明顯升高，發(fā)酵后期至出缸時(D33)的乳桿菌屬相對豐度趨于平穩(wěn)，這與之前所述乳酸含量在發(fā)酵初期含量顯著上升，7 d后乳酸含量幾乎無明顯波動的變化情況基本一致。而二楂(EX)酒醅樣品在發(fā)酵后期15 d后的乳桿菌屬相對豐度高達(dá)96%，這與之前所述二楂發(fā)酵過程中乳酸含量在15 d后增加也相一致(圖3)。除此之外可以明顯的看出乳桿菌屬在各對時酒醅中相對豐度較大，尤其在發(fā)酵后期菌種數(shù)量顯著升高，故后續(xù)乳酸菌的篩選可集中在發(fā)酵后期的樣品上。

圖3 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)酵期間屬水平豐度變化Fig.3 Change in bacterial flora structure during the fermentation at genus level

進(jìn)而從種水平對立醅期酒醅發(fā)酵過程中的菌種進(jìn)行動態(tài)解析，由16S擴(kuò)增子測序原始數(shù)據(jù)可知，立醅期酒醅樣品中共有16個優(yōu)勢菌種，包括：類腸膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)、舊金山乳桿菌(Lactobacillussanfranciscensis)、直桿糖多孢菌(Saccharopolysporarectivirgula)、類食品乳桿菌(Lactobacillusparalimentarius)、Kroppenstedtiaeburnea、仁果枝孢醋酸桿菌(Acetobactermalorum)、索里魏氏菌(Weissellasoli)、耐酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)、棒狀腐敗乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)、Pantoeavagans、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、普氏菌(Prevotellacopri)、白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)、小片球菌(Pediococcusparvulus)、食二酸乳桿菌(Lactobacillusdiolivorans)、檸檬色明串珠菌(Leuconostoccitreum)。

其中在12種產(chǎn)乳酸微生物中，舊金山乳桿菌能很好地利用面粉中的主要糖類麥芽糖,對饅頭的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)有重要的影響[19]；類食品乳桿菌利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，多用于面制品發(fā)酵；耐酸乳桿菌可發(fā)酵果糖、半乳糖、葡萄糖和核糖；類腸膜魏斯氏菌可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸；索里魏氏菌是一種從土壤中分離出來的乳酸菌[20]；棒狀腐敗乳桿菌、植物乳桿菌、食二酸乳桿菌均為乳桿菌屬，故均可產(chǎn)乳酸。Pantoeavagans屬于泛菌屬，可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸；小片球菌屬于片球菌屬，會利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣；檸檬色明串珠菌利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，常用于生產(chǎn)酸奶、奶酪輔發(fā)酵劑。普氏菌采用溴甲酚紫作為產(chǎn)酸指示劑進(jìn)行篩選[21]。產(chǎn)乙酸微生物仁果枝孢醋酸桿菌能將糖類和酒精氧化成醋酸等產(chǎn)物。

由圖4可知，各菌種隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈現(xiàn)出不規(guī)則的動態(tài)變化(圖4)。在酒醅大楂發(fā)酵時期，植物乳桿菌的相對豐度占比最大，且波動較大，大楂0～7 d逐漸上升，7～33 d顯著下降，二楂0～4 d相對豐度逐漸升高，4 d之后該菌株占比整體有呈現(xiàn)下降趨勢；在酒醅二楂發(fā)酵時期，耐酸乳桿菌從二楂15 d開始該菌株相對豐度顯著升高，二楂15～26 d該菌株呈現(xiàn)上升趨勢，在22 d相對豐度高達(dá)95.49%。食二酸乳桿菌在大楂發(fā)酵階段相對豐度逐漸增加，特別是大楂發(fā)酵后期15～33 d該菌株在酒醅樣品占比最大，在二楂發(fā)酵階段該菌株相對豐度整體呈下降趨勢。棒狀腐敗乳桿菌的相對豐度在大楂0～4 d逐漸升高，4～33 d該菌株相對豐度降低且趨勢逐漸平穩(wěn)，二楂階段該菌株相對豐度較低。仁果枝孢醋酸桿菌在二楂發(fā)酵前期0～7 d相對豐度占比較大且逐漸上升，7 d之后該菌株占比驟減。

圖4 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)酵期間種水平豐度變化Fig.4 Change in bacterial flora structure during the fermentation at species level

結(jié)合2.1中圖1的相關(guān)分析可知，立醅期酒醅主體酸含量與菌落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其中在大楂發(fā)酵階段植物乳桿菌相對豐度隨發(fā)酵時間的變化與乳酸含量變化呈正相關(guān)，在二楂發(fā)酵階段耐酸乳桿菌相對豐度隨發(fā)酵時間的變化與乳酸含量變化呈正相關(guān)，仁果枝孢醋酸桿菌與二楂后期酒醅中乙酸含量的升高有關(guān)。故植物乳桿菌、耐酸乳桿菌是影響酒醅發(fā)酵過程中乳酸產(chǎn)量的關(guān)鍵菌株，仁果枝孢醋酸桿菌是影響酒醅發(fā)酵過程中乙酸產(chǎn)量的關(guān)鍵菌株。

2.3 MRS培養(yǎng)基分離篩選清香型酒醅中的產(chǎn)乳酸微生物

為了進(jìn)一步確定清香型白酒立醅期發(fā)酵體系中的產(chǎn)乳酸優(yōu)勢菌種，采用MRS培養(yǎng)基對發(fā)酵后期酒醅樣品中的產(chǎn)乳酸微生物進(jìn)行分離純化。

根據(jù)高通量測序結(jié)果可知，立醅期酒醅樣品中主要有16個相對豐度較高的優(yōu)勢菌種。將篩選得的產(chǎn)乳酸微生物進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，分離得到的菌株主要包括：植物乳桿菌Lactobacillusplantarum(LP)、棒狀腐敗乳桿菌Lactobacilluscoryniformis(LC)、食二酸乳桿菌Lactobacillusdiolivorans(LD)、嗜酸片球菌Pediococcusacidilactici(PA)、利維短乳桿菌Levilactobacillusbrevis(LB)。其中分離得到3株相對豐度較高的優(yōu)勢菌種，包括：L.plantarum、L.coryniformis、L.diolivorans，各菌株在酒醅樣品中的相對豐度占比分別是：L.plantarum在大楂酒醅樣品中占比25.42%，在二楂酒醅樣品中占比5.57%；L.coryniformis在大楂酒醅樣品中占比1.36%，在二楂酒醅樣品中占比0.004 8%；L.diolivorans在大楂酒醅樣品中占比2.44%，在二楂酒醅樣品中占比0.39%(圖5)。而P.acidilactici和L.brevis可能由于豐度過小，在圖5中并未找到這2株菌。還有部分高豐度菌株(耐酸乳桿菌Lactobacillusacetotolerans等)未篩選到，可能是由于這些厭氧菌株需要在嚴(yán)格的無氧環(huán)境下才能篩選得到。

圖5 大楂和二楂酒醅中細(xì)菌種水平占比情況Fig.5 Proportion of bacterial species level in fermented grains of Dacha and Ercha

2.4 優(yōu)勢產(chǎn)乳酸微生物產(chǎn)酸、耐酸、耐醇能力驗(yàn)證分析

由2.2的相關(guān)分析可知，菌株的相對豐度變化與酒醅中主體酸含量相關(guān)，因此對立醅期發(fā)酵階段篩選出的5種產(chǎn)乳酸微生物進(jìn)行產(chǎn)酸能力驗(yàn)證分析(圖6)。

圖6 各菌株發(fā)酵液中pH隨時間的變化情況Fig.6 Variation of pH in fermentation broth of strains with time

由圖6可知，菌株LP在發(fā)酵過程中的pH下降速率最快，且發(fā)酵穩(wěn)定時發(fā)酵液pH達(dá)到3.9，故菌株LP的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，這與菌株LP是酒醅發(fā)酵前期產(chǎn)乳酸關(guān)鍵菌株的結(jié)論相一致。菌株LC、菌株P(guān)A的pH下降速率以及穩(wěn)定期時發(fā)酵液pH值僅次于菌株LP。

對產(chǎn)乳酸微生物的耐酸、耐醇能力進(jìn)行驗(yàn)證分析：菌株LD在pH 4時OD600值為0.589，pH 3.5時OD600值為0.528，遠(yuǎn)高于另外4株菌的吸光度，說明其耐酸能力較強(qiáng)。菌株LC pH 4.5時，其OD600已降至0.721，略低于其他菌株，說明其在pH 4.5時耐酸能力較弱。但這5株菌株均可耐受pH 2.5時的發(fā)酵環(huán)境(圖7)。

圖7 各菌株耐酸能力特性Fig.7 Acid resistance of strains

菌株LP在乙醇體積分?jǐn)?shù)6%時OD600值下降至0.771，遠(yuǎn)低于其他菌株，說明其耐醇能力最弱；菌株LC在乙醇體積分?jǐn)?shù)10%時OD600值高達(dá)1.35，說明其耐醇能力最強(qiáng)(圖8)。

圖8 各菌株耐醇能力特性Fig.8 Alcohol resistance of strains

各菌株的發(fā)酵特性分別為：菌株LP產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，可以耐受pH 2.5的酸環(huán)境，但耐醇能力最弱；菌株LC產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，耐醇能力也最強(qiáng)，雖然也能耐受pH 2.5的酸環(huán)境，但在pH 4.5的酸環(huán)境下OD600值較低；菌株P(guān)A產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，可以耐受pH 2.5的酸環(huán)境，也可以耐受體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇環(huán)境；菌株LD可耐受pH 2.5的酸環(huán)境且酸耐受性最強(qiáng)，可耐受體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇，但產(chǎn)酸能力最弱；菌株LB產(chǎn)酸能力較弱，但耐酸醇能力較強(qiáng)?？偠灾?，棒狀腐敗乳桿菌LC和嗜酸片球菌PA具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和耐酸、耐醇能力，對改善清香型白酒的風(fēng)味口感有著潛在的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

本研究對立醅期清香型白酒發(fā)酵過程中主體酸含量的變化規(guī)律，以及酒醅中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化情況進(jìn)行分析，進(jìn)而從發(fā)酵后期的酒醅樣品中篩選得到具有較強(qiáng)產(chǎn)酸、耐酸、耐醇能力的菌株:棒狀腐敗乳桿菌Lactobacilluscoryniformis和嗜酸片球菌Pediococcusacidilactici。這為之后的微生物代謝改造提供了基本的信息，篩選出的菌株也對改善清香型白酒的風(fēng)味口感具有潛在應(yīng)用價值。