布拉氏酵母壁多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化及其對早期斷奶羔羊盲腸中微生物的影響

■劉孟健 劉武軍 臧長江 姚 峻 董 玲 張文舉*

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；3.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧 沈陽 110036）

布拉氏酵母壁多糖（Saccharomyces boulardii Poly?saccharides）是一種天然的益生元，主要由β-葡聚糖和甘露聚糖組成[1]。布拉氏酵母壁多糖作為布拉氏酵母的主要生物活性部分，不僅具有無毒副作用、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，還具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、防治腹瀉等生物學(xué)功能，有報(bào)道其可用于嬰幼兒腹瀉的治療[2-3]。我國北方牧區(qū)在換季時期溫差較大，加之羔羊提前斷奶飼養(yǎng)方式的普及，因此加劇了斷奶羔羊的應(yīng)激反應(yīng)和腸道菌群紊亂，普遍出現(xiàn)了斷奶羔羊腹瀉、脫水、免疫力低下等情況，對當(dāng)?shù)氐难驑I(yè)發(fā)展產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的影響。在我國禁抗的大趨勢下，急需找到全部或部分具有抗生素效用的天然綠色添加劑，以此改善早期斷奶羔羊較為劇烈的應(yīng)激反應(yīng)和腸道菌群紊亂等問題。因此，若通過優(yōu)化布拉氏酵母的發(fā)酵條件以提高其細(xì)胞壁多糖產(chǎn)量，并評估其理化特性和生物活性，制備成綠色、安全、有效的益生元，定會在我國無抗養(yǎng)殖的大環(huán)境下，特別是在北方養(yǎng)羊業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，大部分研究主要集中于布拉氏酵母菌的生物學(xué)功能、作用機(jī)制及其相關(guān)應(yīng)用，鮮有對布拉氏酵母壁多糖發(fā)酵的工藝優(yōu)化、理化特性及體內(nèi)、外生物學(xué)功能方面進(jìn)行報(bào)道。因此，本研究首先通過單因素試驗(yàn)研究培養(yǎng)基、pH、轉(zhuǎn)速和溫度對多糖產(chǎn)量的影響，再通過響應(yīng)面法得到最適發(fā)酵條件，并用高效凝膠色譜技術(shù)檢測其多糖分子量以及單糖組成；然后通過布拉氏酵母壁多糖對氧自由基的清除效率和抑菌試驗(yàn)評價其抗氧化活性和抑菌特性；最后通過飼喂試驗(yàn)研究其對早期斷奶羔羊盲腸中微生物的影響，為布拉氏酵母壁多糖的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：布拉氏酵母菌株，由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院提供，菌種編號為BLS-06。

藥品試劑：葡萄糖標(biāo)樣（純度≥99.00%），美國Sig?ma公司；D（+）-甘露糖標(biāo)樣（純度≥99.99%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；酵母提取物、大豆蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、蔗糖、甘油、中性蛋白酶、胰蛋白酶、異丙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)有機(jī)試劑；抗壞血酸（VC），德國Sig?ma-Aldrich公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美國Sigma公司；鹽酸、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸銨、氯化鈣、D-泛酸鈣、氯化鈉、乙酸鈉、氫氧化鈉、過氧化氫等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋，松下健康醫(yī)療器械株式會社；PL602E 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SJIA-5FE抽真空冷凍干燥機(jī)，寧波市雙嘉儀器有限公司；UV-2102 PCS紫外可見光分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；BF260強(qiáng)制對流培養(yǎng)箱，德國賓得集團(tuán)；GTR16-2高速冷凍離心機(jī)，北京時代北利儀器有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明儀器有限公司；快流速瓊脂糖凝膠，美國艾爾特公司；BIOTECH-10BG-7000A全自動發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；ZWYR-D2402恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SB-804 HQ 凝膠過濾色譜，日本昭和電工株式會社；Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基對多糖產(chǎn)量的影響

以全自動發(fā)酵罐為試驗(yàn)設(shè)備（下同），在無菌條件下將活化好的布拉氏酵母分別接入到8 L下列供試發(fā)酵培養(yǎng)基中，其基礎(chǔ)發(fā)酵條件為接種量5%、pH 為7、溫度32 ℃、轉(zhuǎn)速300 r/min、發(fā)酵時間72 h，每個處理3 個重復(fù)[4]，培養(yǎng)結(jié)束后按1.3.7 中方法提取多糖并對其進(jìn)行稱量。

發(fā)酵培養(yǎng)基：①酵母浸粉葡萄糖培養(yǎng)基：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、純化水1 L；②改良察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g、硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、純化水1 L；③自配1 培養(yǎng)基：蔗糖50 g、大豆蛋白胨40 g、酵母膏30 g、甘油16 g、純化水1 L；④自配2培養(yǎng)基：蔗糖50 g、葡萄糖20 g、酵母膏50 g、硫酸銨10 g、硫酸二氫鉀3 g、甘油2 g、氯化鈣1 g、純化水1 L；⑤自配3 培養(yǎng)基：蔗糖60 g、酵母膏40 g、硫酸銨10 g、硫酸二氫鉀3 g、甘油10 g、純化水1 L；⑥自配4 培養(yǎng)基：蔗糖50 g、葡萄糖20 g、蛋白胨60 g、硫酸銨30 g、甘油3 g、氯化鈣3 g、硫酸鎂1 g、D-泛酸鈣0.6 g、純化水1 L。以上培養(yǎng)基均為自然pH，并以121 ℃滅菌30 min[5-10]。

1.3.2 pH對多糖產(chǎn)量的影響

以氫氧化鈉和鹽酸對優(yōu)化后的培養(yǎng)基pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其pH 分別達(dá)到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 進(jìn)行初篩。再以0.4為梯度對培養(yǎng)基pH進(jìn)行復(fù)篩，每個處理3個重復(fù)，確定此培養(yǎng)基產(chǎn)多糖的最適發(fā)酵pH區(qū)間。

1.3.3 溫度對多糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度分別設(shè)定為24、26、28、30、32 ℃和34 ℃，在無菌環(huán)境下接種后以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)束后提取酵母壁多糖并精確稱量，每個處理3個重復(fù)，確定此培養(yǎng)基產(chǎn)多糖的最適發(fā)酵溫度區(qū)間。

1.3.4 轉(zhuǎn)速對多糖產(chǎn)量的影響

分別將轉(zhuǎn)速設(shè)定為200、300、400、500、600 r/min和700 r/min，在無菌環(huán)境下接種后以基礎(chǔ)發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)束后提取酵母壁多糖并稱量，每個處理3個重復(fù)，確定此培養(yǎng)基產(chǎn)多糖的最適轉(zhuǎn)速區(qū)間。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以多糖產(chǎn)量為考察指標(biāo)，選擇發(fā)酵pH、溫度和轉(zhuǎn)速作為需要組合優(yōu)化的3個因素，每個因素設(shè)定3個水平，通過響應(yīng)面法對其進(jìn)行優(yōu)化，見表1。

表1 布拉氏酵母壁多糖最佳發(fā)酵條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.6 發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)

在理論最佳發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測定布拉氏酵母壁多糖的實(shí)際最佳產(chǎn)量，3次重復(fù)，并計(jì)算實(shí)際多糖產(chǎn)量與預(yù)計(jì)產(chǎn)量之間的相對誤差。

1.3.7 多糖的提取和純化

將酵母發(fā)酵液放入離心機(jī)中以5 000 r/min 離心5 min，去上清液。沉淀物用3～5倍體積的純化水溶解，攪拌10 min，除去雜質(zhì)后，用組織搗碎機(jī)機(jī)械破壁8 min，再加入中性蛋白酶300 IU/g，恒溫40 ℃下酶解36 h，離心去除上清液。沉淀物用2%氫氧化鈉處理3 h，再用5%鹽酸中和至pH為7.0，2倍乙醇醇析，真空干燥48 h后，粉碎制得粗多糖，精確稱量，測3次取其平均值[11]。

在粗多糖中加入2 倍體積丙酮，攪拌20 min，離心去除上清液，反復(fù)上述步驟3次進(jìn)行脫脂。然后加入5倍于壁多糖溶液體積的Sevag液（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V），并調(diào)節(jié)使其pH為3，充分振蕩30 min后，置于4 ℃冰箱冷藏24 h除去蛋白質(zhì)，5 000 r/min離心10 min，傾出上清液，吸出上層水相，除去中間層變形蛋白和下層氯仿，反復(fù)上述步驟至少3 次。將5 倍95%乙醇緩慢加入到壁多糖溶液中，邊加邊攪拌，多糖以白色絮狀沉淀物析出，靜置過夜后去除上清液，用無水乙醇洗滌脫水3次并烘干粉碎。取烘干多糖溶于蒸餾水后于3 500 u透析袋中透析48 h，0.22 μm濾膜除雜質(zhì)，抽真空冷凍干燥并制得純多糖[12]。

1.3.8 多糖的分離

將純化好的酵母壁多糖配成2 mL 50 mg/mL 的水溶液，5 000 r/min離心5 min后用DEAE 52-Sepha?rose Fast Flow 陰離子柱層析分段洗脫。平衡液為0.05 mol/L、pH為9.18的硼酸鹽、流動相分別為0.1、0.5、0.9、1.3、1.7 mol/L NaCl梯度溶液，流速1.0 mL/min，每6 mL收集1管，通過苯酚-硫酸法檢測各管OD490nm值，繪制洗脫曲線，分別收集各梯度中主要含糖組分，濃縮后透析脫鹽冷凍干燥保藏[13]。

1.3.9 多糖分子量的測定

通過高效凝膠滲透色譜（HPGPC）法檢測酵母壁多糖的分子量，選用TSK-GEL 凝膠過濾色譜柱（G3000PWXL，7.8 mm×30.0 cm），以404、212、112、47.3、22.8、11.8、5.9、2.5 ku的右旋糖酐制作多糖分子量雙對數(shù)（log-log）保留時間標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取樣品并與流動相制成5 mg/mL溶液，離心吸取上清液20 μL進(jìn)樣，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的分子量。分析柱條件為SB-804 HQ色譜柱；流動相為0.1 mol/L的Na2SO4；流速為0.5 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；最大柱壓為2 500 kPa[14-15]。

1.3.10 多糖組成的測定

參考徐婷婷等[16]和袁志梅等[17]的方法對布拉氏酵母壁多糖進(jìn)行處理，通過高效液相色譜（HPLC）測定多糖中葡聚糖和甘露聚糖的含量。準(zhǔn)確稱取干燥葡萄糖和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品并與純化水配制成2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并稀釋制成質(zhì)量濃度分別為200、400、600、800、1 000 μg/mL 的葡萄糖和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度與色譜峰面積之間的回歸方程，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取干燥待測樣品并與純化水配制成2 g/mL 溶液，吸取50 μL 進(jìn)樣，得到待測樣品的液相色譜圖，并通過補(bǔ)償系數(shù)公式以及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得出多糖中葡聚糖和甘露糖的含量。色譜柱條件為Welch Sugar-Ca 色譜柱（7.8 mm×300 mm），流動相一級水，流速0.5 mL/min，柱溫為85 ℃，進(jìn)樣量50 μL。

1.3.11 多糖抗氧化活性的測定

準(zhǔn)確稱量1 g經(jīng)過冷凍干燥后的布拉氏酵母壁多糖，用純化水定容至100 mL，配成10 mg/mL的多糖溶液，避光保存。

1.3.11.1 DPPH·清除能力的測定

對上述多糖溶液進(jìn)行稀釋，配制成100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL 的梯度濃度溶液，分別精確吸取2 mL梯度溶液并與等量5 mmol/L的DPPH·乙醇溶液混合并振蕩均勻，室溫靜置30 min，在λ為517 nm下測定其吸光度A0，并測定2 mL無水乙醇、2 mL純化水混合液吸光值A(chǔ)1，并測定2 mL 純化水、2 mL 5 mmol/L DPPH·乙醇溶液混合液吸光值A(chǔ)2，每個處理3 個重復(fù)，取其平均值，通過清除率公式計(jì)算其對DPPH·的清除率[18-19]。

1.3.11.2 羥自由基（·OH）清除能力的測定

精確稱取9.0 mmol/L 硫酸亞鐵1 mL 于試管中，依次加入1 mL 9.0 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、1 mL不同濃度的布拉氏酵母壁多糖溶液（如上述所示）、5 mL純化水、振蕩均勻后加入1 mL 0.06%過氧化氫，室溫反應(yīng)1 h，在λ為510 nm下測定其吸光度A0，將上述各處理試管中的過氧化氫換成純化水測其吸光度A1，將上述處理各試管中的多糖溶液換成等量純化水測其吸光度A2，每個處理3個重復(fù)，取其平均值，通過清除率公式計(jì)算其對·OH的清除率[20-21]。

1.3.11.3 超氧自由基（·O2-）清除能力的測定

準(zhǔn)確稱量1 mL不同濃度的布拉氏酵母壁多糖溶液（如上述所示），并加入3 mL Tris-鹽酸緩沖液（pH 8.2），25 ℃下保溫20 min，加入25 ℃7 mmol/L的鄰苯三酚0.3 mL，精準(zhǔn)反應(yīng)4 min 后加入1 mL 19 mmol/L HCl 終止反應(yīng)，在λ為420 nm 下測定其吸光度A0，將上述各處理試管中的多糖溶液換成純化水測其吸光度A1，將上述處理各試管中的鄰苯三酚溶液換成等量純化水測其吸光度A2，每個處理3個重復(fù)，取其平均值，通過清除率公式計(jì)算其對·O2-的清除率[22]。

1.3.12 多糖抑菌活性的測定

在無菌條件下，將濃度為109CFU/mL 大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌分別均勻涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿周圍以相同間隔放置5個牛津杯（9 mm），分別加入濃度為30、60、120、240、480 μg/mL的布拉氏酵母壁多糖混合液，分別以無菌水和200 μg/mL頭孢類抗生素做其陰性對照和陽性對照，37 ℃培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑，每個培養(yǎng)皿做3 個平行試驗(yàn)。無抑菌圈即無抑菌能力，記為“-”；抑菌圈直徑為9～12 mm 即低抑菌能力，記為“+”；抑菌圈直徑為12～15 mm 即高抑菌能力，記為“++”；抑菌圈直徑為15～18 mm即極高抑菌能力，記為“+++”[23]。

1.3.13 多糖對早期斷奶羔羊盲腸微生物的影響

選取遺傳背景相近、胎次體重相近和健康狀況良好的32-35日齡羔羊（薩福克羊♂×阿勒泰羊♀×哈薩克羊♂）48 只，其中公羔36 只，母羔12 只。試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)方法，按同質(zhì)原則將試驗(yàn)羔羊分為4 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)4 只羔羊（3 只♂和1 只♀），所有試驗(yàn)羔羊均于32 日齡強(qiáng)制斷奶。4 個試驗(yàn)組分別飼喂羔羊代乳料（Ⅰ組）、代乳料+0.1%布拉氏酵母壁多糖（Ⅱ組）、代乳料+0.3%布拉氏酵母壁多糖（Ⅲ組）和代乳料+0.5%布拉氏酵母壁多糖（Ⅳ組）。代乳料參照NRC（2007）體重20 kg、日增重300 g綿羊的營養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制。飼喂期為30 d，期間羔羊自由采食代乳料，每日飼喂4次，自由飲水。

于試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天早晨10：00未采食前，隨機(jī)從每個重復(fù)中選取1只羔羊（確保每個處理均能隨機(jī)選取2 只♂和1 只♀），肌肉注射4%戊巴比妥鈉溶液對其麻醉，待其完全昏迷后，通過頸部放血將其處死。用手術(shù)刀沿腹線劃開腹腔，用棉繩將帶有內(nèi)容物的盲腸腸段分別于中間和兩端結(jié)扎，在無菌環(huán)境下（酒精燈火焰上方的無菌環(huán)境），快速將盲腸段中的內(nèi)容物取出并放入充滿ATCC冷凍保護(hù)劑（10%甘油+5%二甲亞砜+培養(yǎng)液）的樣品袋中，緩慢降溫后置于液氮中冷凍。盲腸中乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和總好氧菌均用培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 18.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，對發(fā)酵條件優(yōu)化的組間顯著性差異對比采用Design Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面曲線設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對多糖產(chǎn)量的影響（見表2）

表2 5種培養(yǎng)基對布拉氏酵母壁多糖產(chǎn)量的影響（mg/100 mL）

由表2 所示，布拉氏酵母在自配2、自配4 發(fā)酵培養(yǎng)基的多糖產(chǎn)量顯著高于其他組（P＜0.05），分別達(dá)到341.00 mg/100 mL和347.92 mg/100 mL，說明自配2、自配4 培養(yǎng)基更有利于布拉氏酵母壁多糖的生成。由于自配2 培養(yǎng)基的配方成本低，故采用自配2 培養(yǎng)基為后續(xù)發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 pH對多糖產(chǎn)量的影響（見表3）

如表3所示，在pH初篩階段，隨著pH的升高，布拉氏酵母壁多糖的產(chǎn)量增加，當(dāng)pH 為6.0 時達(dá)到高峰，其多糖產(chǎn)量為402.92 mg/100 mL，顯著高于其他組（P＜0.05），而后產(chǎn)量下降。由此推斷，pH 在5～7 的區(qū)間為布拉氏酵母產(chǎn)細(xì)胞壁多糖的適宜pH，故在此范圍內(nèi)進(jìn)行復(fù)篩。由pH 復(fù)篩結(jié)果可知，當(dāng)pH=5.8時，酵母壁多糖的產(chǎn)量最高為437.86 mg/100 mL，顯著高于其他組（P＜0.05），故選取pH 水平為5.4、5.8、6.2進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表3 pH對布拉氏酵母壁多糖產(chǎn)量的影響（mg/100 mL）

2.3 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對多糖產(chǎn)量的影響（見表4）

如表4 所示，當(dāng)轉(zhuǎn)速為300～500 r/min 時，其多糖的產(chǎn)量較高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 r/min 時，多糖產(chǎn)量最高為403.43 mg/100 mL，顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。故選擇轉(zhuǎn)速水平為300、400、500 r/min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表4 不同轉(zhuǎn)速對布拉式酵母壁多糖產(chǎn)量的影響（mg/100 mL）

2.4 發(fā)酵溫度對多糖產(chǎn)量的影響（見表5）

如表5 所示，隨著溫度的升高，布拉氏酵母壁多糖的產(chǎn)量先升后降，28 ℃時的多糖產(chǎn)量最高，達(dá)到383.85 mg/100 mL，顯著高于其他組（P＜0.05）；其次26 ℃和30 ℃的多糖產(chǎn)量分別達(dá)到363.56 mg/100 mL和370.68 mg/100 mL，其組間差異不顯著（P>0.05），故選擇溫度水平為26 ℃、28 ℃和30 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表5 不同溫度對布拉式酵母壁多糖產(chǎn)量的影響（mg/100 mL）

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)（見表6）

以pH（A）、溫度（B）、轉(zhuǎn)速（C）為考察因素，每個因素3 水平，以發(fā)酵液中多糖含量為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)探討布拉氏酵母壁多糖的最佳發(fā)酵條件。如表6所示，在發(fā)酵條件pH為5.8、溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速400 r/min時多糖產(chǎn)量最高，均能達(dá)到520 mg/100 mL以上，顯著高于其他組合（P＜0.05）。

表6 發(fā)酵條件影響布拉氏酵母壁多糖產(chǎn)量的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 ANOVA分析（見表7）

發(fā)酵條件對布拉氏酵母壁多糖產(chǎn)量影響的模型方差分析如表7 所示，3 個因素的F值從大到小分別為C>A>B，因此確定在此發(fā)酵因素水平下對多糖產(chǎn)量影響程度的大小順序分為轉(zhuǎn)速>pH>溫度。以多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件進(jìn)行二元回歸擬合，得到壁多糖產(chǎn)量對編碼自變量pH（A）、溫度（B）、轉(zhuǎn)速（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：多糖產(chǎn)量（Y）=537.19+11.02×A+1.50×B+12.07×C-13.82×AB+15.54×AC+12.50×BC-64.12×A2-62.11×B2-61.19×C2。在方差分析中，P＜0.000 1，即模型達(dá)到極顯著水平；多糖含量失擬項(xiàng)P=0.548 6，P>0.05，即模型失擬項(xiàng)不顯著，證明模型選擇合適，本試驗(yàn)的模型有意義。回歸系數(shù)R2=0.987 7>0.9，說明模型相關(guān)性良好，可以用于響應(yīng)值的變化分析。

表7 發(fā)酵條件影響布拉氏酵母壁多糖產(chǎn)量的響應(yīng)面方差分析結(jié)果

2.5.3 響應(yīng)面分析（見圖1～圖3）

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量間的交互作用并確定最優(yōu)發(fā)酵條件，采用Design Expert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖，并對其數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面如圖1～圖3 所示。當(dāng)固定pH、發(fā)酵轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫度任意一個因素為固定水平時，顯示其余兩個因素的交互作用以及對應(yīng)的多糖產(chǎn)量。其產(chǎn)量初期隨著任意兩個變量的增加而增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)某一固定值后（此時多糖產(chǎn)量為最高點(diǎn)），多糖產(chǎn)量隨著變量的增加而降低，呈不對稱拋物線形狀。由圖1～圖3及回歸方程方差分析可知，pH與溫度、pH與轉(zhuǎn)速、溫度與轉(zhuǎn)速均有顯著的交互作用。

圖1 溫度和pH交互作用對多糖產(chǎn)量的影響

圖2 轉(zhuǎn)速和pH交互作用對多糖產(chǎn)量的影響

圖3 轉(zhuǎn)速和溫度交互作用對多糖產(chǎn)量的影響

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對回歸模型方程求解，得出布拉氏酵母產(chǎn)細(xì)胞壁多糖最佳發(fā)酵條件為pH 5.93、溫度29.71 ℃、轉(zhuǎn)速426.81 r/min，此條件下的多糖預(yù)計(jì)產(chǎn)量為590.48 mg/100 mL。為方便試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)的發(fā)酵條件調(diào)整如下：pH 6.0、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速420 r/min，進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，最終在此條件下的多糖產(chǎn)量分別為：565.10、571.60 mg/100 mL 和584.40 mg/100 mL，其平均產(chǎn)量為573.70 mg/100 mL，與預(yù)計(jì)產(chǎn)量的相對誤差為2.84%，證明該方程可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。如圖4所示，優(yōu)化前后布拉氏酵母壁多糖產(chǎn)量分別為357.92 mg/100 mL 和573.70 mg/100 mL，優(yōu)化后多糖產(chǎn)量是優(yōu)化前1.6倍。

圖4 優(yōu)化前后酵母壁多糖產(chǎn)量變化

2.6 布拉氏酵母壁多糖的分子量測定（見圖5～圖7）

圖5 純化壁多糖的梯度洗脫圖

圖6 BLC1和BLC2的凝膠滲透色譜

圖7 標(biāo)準(zhǔn)分子量多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖5所示，純化后的多糖經(jīng)過DEAE-52陰離子交換層析柱分段洗脫后，分離出了2 個主要組分，并命名為BLC1和BLC2。收集各管中多糖組分，透析除鹽后濃縮凍干，計(jì)算各組分的比重。BLC1和BLC2組分為白色粉末狀，分別占比多糖總量的63.12%和28.70%。將BLC1 和BLC2 組分別通過高效凝膠滲透色譜（HPGPC）進(jìn)行檢測，并用分子量標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)已知分子量的出峰時間推算BLC1和BLC2多糖的分子量。如圖6 所示，BLC1 和BLC2 均呈現(xiàn)單一對稱峰，證明其多糖組分純度較高，可進(jìn)行下一步分析。BLC1 和BLC2 的出峰時間分別代入右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7）的公式中，計(jì)算得出BLC1和BLC2的分子質(zhì)量分別為22.76 ku和9.09 ku。

2.7 布拉氏酵母壁多糖的單糖組成測定（見圖8～圖11）

圖8 標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與其峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 所示的是葡萄糖和甘露糖的濃度與其液相色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖9和圖10所示葡萄糖與甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品在液相色譜中的出峰時間，分別為13.584 min和15.710 min。圖11表示布拉氏酵母壁多糖組分BLC1 的液相色譜圖，通過校正公式和回歸方程計(jì)算得出葡聚糖和甘露糖濃度分別為864 μg/mL和591 μg/mL，分別占BLC1 多糖組分的43.20%和29.55%。

圖9 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖10 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖11 待測樣品的液相色譜圖

2.8 布拉氏酵母壁多糖抗氧化活性的測定（見圖12）

圖12 布拉氏酵母壁多糖分別對DPPH·、·OH、·O清除作用

由圖12所示，布拉氏酵母壁多糖具有一定的抗氧化性，并有明顯的量效關(guān)系，但清除不同自由基的能力存在差異?？傮w來看，布拉氏酵母壁多糖對DPPH·的清除能力最強(qiáng)，清除率為36.38%，而對·OH和·O的清除效率較低，分別為28.55%和18.60%。

2.9 布拉氏酵母壁多糖的抑菌結(jié)果分析（見表8）

表8 布拉氏酵母壁多糖對3種常見微生物的抑菌效果

由表8所示，布拉氏酵母壁多糖在480 μg/mg時，對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均產(chǎn)生了一定的抑菌效果，其中對大腸桿菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直徑為（14.61±1.69）mm，對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較弱，分別為（11.20±1.41）mm 和（9.61±0.80）mm；其多糖濃度在240 μg/mg時，只對大腸桿菌表現(xiàn)出抑菌效果，其抑菌圈為（9.92±0.81）mm，對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌無抑制作用，陽性對照組頭孢類抗生素對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯，其抑菌圈直徑分別達(dá)到（24.74±2.36）、（24.67±2.43）mm和（24.43±2.44）mm。布拉氏酵母壁多糖對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度（MIC）分別為240 μg/mg和480 μg/mg。

2.10 布拉氏酵母壁多糖對早期斷奶羔羊盲腸微生物的影響（見表9）

表9 布拉氏酵母壁多糖對羔羊盲腸微生物的影響(lg CFU/g)

由表9可知，各組羔羊盲腸中雙歧桿菌、乳酸菌、沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量差異顯著（P＜0.05）。Ⅲ組的雙歧桿菌數(shù)量為6.88 lg CFU/g，顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組和Ⅳ組較Ⅰ組顯著提高了9.90%和9.26%（P＜0.05）；Ⅲ組的乳酸菌數(shù)量最高為7.48 lg CFU/g，顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組和Ⅳ組較Ⅰ組顯著提高了4.76%和4.06%（P＜0.05）；Ⅲ組的沙門氏菌數(shù)量最低為5.13 lg CFU/g，其次為Ⅳ組5.20 lg CFU/g，Ⅲ組和Ⅳ組較Ⅰ組顯著降低了5.87%和4.59%（P＜0.05）。Ⅳ組的大腸桿菌數(shù)量最低為4.61 lg CFU/g，顯著低于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組和Ⅳ組較Ⅰ組顯著降低了6.37%和8.17%（P＜0.05）。各組產(chǎn)氣莢膜梭菌和總需氧數(shù)量的差異不顯著（P>0.05），Ⅲ組和Ⅳ組的產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量和總需氧菌數(shù)量較Ⅰ組分別降低7.23%、7.96%和1.79%、4.69%（P>0.05）。

3 討論

提高發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物的得率通常需要對多種發(fā)酵因素相結(jié)合進(jìn)行試驗(yàn)，同時還要考慮各因素（例如培養(yǎng)基、溫度、pH以及溶氧量）之間的相互作用。本試驗(yàn)確定自配2培養(yǎng)基為布拉氏酵母壁多糖的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，最適發(fā)酵條件為pH 5.93、溫度29.71 ℃、轉(zhuǎn)速426.81 r/min，其多糖的實(shí)際產(chǎn)量為573.70 mg/100 mL，為優(yōu)化前產(chǎn)量的1.6 倍。據(jù)報(bào)道，裴芳藝等[24]通過單因素、Plackett-Burman（PB）和中心組合設(shè)計(jì)（CCD）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，近粉紅鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）產(chǎn)胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為：自配培養(yǎng)基、28 ℃、轉(zhuǎn)速210 r/min、pH 5.1、6 h，其胞外多糖產(chǎn)量為（4.60±0.13）g/L，是優(yōu)化前的1.40倍。王宏濤[25]發(fā)現(xiàn)，鎖擲酵母在pH 6.0、28 ℃、接種量10%、72 h 的發(fā)酵條件下，其胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)到（8.9±0.3）g/L。后續(xù)研究可以通過對高產(chǎn)多糖布拉氏酵母菌株進(jìn)行篩選或通過生物分子技術(shù)對菌種進(jìn)行工程改造以達(dá)到更高產(chǎn)量。一般情況下分子量小于50 ku的多糖基本無生物學(xué)活性，而具有生物活性的酵母壁多糖分子量一般介于100～500 ku之間[26]。在本研究發(fā)現(xiàn)，布拉氏酵母壁多糖兩個主要的多糖組分分子量分別為22.76 ku 和9.09 ku，分別占總量的63.12%和28.70%，其中葡聚糖和甘露糖分別占其中一種多糖組分中的43.20%和29.55%。張鑫等[27]在枸杞多糖分子量分布測定與抗炎活性關(guān)聯(lián)研究的研究中發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖分子質(zhì)量分布2～106 ku 之間，其中分子質(zhì)量為34.6 ku 的多糖與抗炎活性關(guān)聯(lián)較強(qiáng)。有些酵母壁多糖具有一定的抗氧化作用。在本試驗(yàn)的抗氧化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，布拉氏酵母壁多糖的抗氧化能力有限，對DPPH·、·OH和·O2-的清除效率分別為36.38%、28.55%和18.60%。據(jù)報(bào)道，在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，多糖組分為7.125×106u的膠紅酵母多糖組分對DPPH·清除率為49.1%，ABTS 自由基清除率為51.2%，還原力為0.352[28]。一些酵母壁多糖能改變腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)并影響微生物在小腸黏膜上皮細(xì)胞的黏附能力，從而有效地改善動物腸道內(nèi)菌群的平衡。在本研究中發(fā)現(xiàn)，布拉氏酵母壁多糖的體外抑菌能力較強(qiáng)，特別是對于大腸桿菌，其濃度達(dá)到240 μg/mg 就能抑制其生長；在體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加了0.3%～0.5%的布拉氏酵母壁多糖能顯著提高早期斷奶羔羊盲腸中雙歧桿菌和乳酸菌等益生菌的數(shù)量，并顯著降低沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量，賀琴等[29]在酵母壁多糖對斷奶仔豬腸道揮發(fā)性脂肪酸和微生物菌群的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，添加0.3%的酵母壁多糖能顯著降低仔豬腸道中大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量，顯著提高雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)確定了自配2 培養(yǎng)基作為布拉氏酵母壁多糖的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵因素對酵母壁多糖產(chǎn)量影響由大到小的順序?yàn)檗D(zhuǎn)速>pH>溫度，其最佳發(fā)酵條件為pH 5.93、溫度29.71 ℃、轉(zhuǎn)速426.81 r/min，其多糖理論產(chǎn)量為590.48 mg/100 mL、實(shí)際產(chǎn)量為573.70 mg/100 mL，相對誤差為2.84%，優(yōu)化后壁多糖產(chǎn)量是優(yōu)化前1.6倍。

布拉氏酵母壁多糖的主要組分為BLC1和BLC2，分別占總量的63.12%和28.70%、其分子量分別為22.76 ku 和9.09 ku，其中葡聚糖和甘露糖分別占BLC1多糖組分中的43.20%和29.55%。

布拉氏酵母壁多糖對DPPH·、·OH和·O2-的清除效率分別為36.38%、28.55%和18.60%；布拉氏酵母壁多糖對大腸桿菌的抑制能力較強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為240 μg/mg可抑制大腸桿菌的生長，當(dāng)質(zhì)量濃度為480 μg/mg可抑制金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的生長。

以布拉氏酵母壁多糖的添加比例0.3%～0.5%飼喂早期斷奶羔羊，能顯著提高早期斷奶羔羊盲腸中雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量，同時顯著降低沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量。