基于血管內皮細胞代謝途徑探討莪蠶健胃方治療大鼠胃癌前病變的機制*

黃柳向, 廖小年,賀玉瓊

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

胃癌是來源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤[1]。據(jù)2015年癌癥統(tǒng)計報告顯示：中國胃癌的發(fā)病率及病死率位居腫瘤排行第2位，僅次于肺癌[2]。胃癌是我國癌癥防治的重點，其被認可的進展模式為：正常胃黏膜→慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌[3]。胃癌前病變(precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)是指胃黏膜具有惡性傾向的病理改變，主要包括腸上皮化生(intestinal metaplasia，IM)和異型增生(dysplasia，Dys)，是發(fā)展成胃癌的必經(jīng)階段。胃癌的發(fā)病機制尚不明確，盡早干預及治療PLGC以阻止其進展，甚至使異常的胃黏膜逆轉為正常的胃黏膜對降低胃癌發(fā)病率至關重要。腫瘤的生長、轉移加速了腫瘤患者的死亡，而腫瘤細胞不斷生長的能量來源依靠新血管的生成。腫瘤的一個重要特點是血管新生[4]，腫瘤的生長、轉移均離不開新生血管的生成[5]。近年來，抗新生血管生成藥物的研究日漸興起，新生血管形成的相關因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)成為研究熱點。目前，抗VEGF藥物的有效性仍有待考察[6]。新血管生成是胃癌發(fā)展的關鍵，而血管內皮細胞代謝通過各個方式影響著血管的生成。血管內皮細胞代謝途徑與腫瘤血管的形成密不可分，學者們試圖從途徑方面研制新藥運用于臨床抗腫瘤，但目前PLGC與血管內皮細胞代謝的關系研究尚未涉及。前期實驗研究[7-8]表明，PLGC胃黏膜組織中血管生成活躍，莪蠶健胃方可通過降低VEGF、缺氧誘導因子-1a(hypoxia inducible factor-1ɑ，HIF-1ɑ)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)在蛋白和信使核糖核酸(mRNA)上的表達量影響新血管生成，從而逆轉PLGC。本研究在前期研究的基礎上，通過觀察莪蠶健胃方對PLGC模型大鼠胃黏膜磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3,PFKFB3)、肉堿脂酰轉移酶1A(carnitine palmityl transferase A，CPT1A)及谷氨酰胺酶1(glutaminase1，GLS1)蛋白表達的影響，探討莪蠶健胃方對PLGC可能的作用機制，為莪蠶健胃方的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

Wistar雄性大鼠60只，SPF級，4周齡，體質量100～120 g，購于湖南長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘) 2014-0011。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心實驗室，適應性喂養(yǎng)1周，室溫20～25 ℃，濕度50 %～65 %，自然采光，通風安靜?；\具及墊料每2天更換1次，籠具清洗消毒。

1.2 藥品、試劑與儀器

莪蠶健胃方處方組成：黃芪 30 g，莪術10 g，僵蠶10 g，太子參30 g，炮山甲 3 g，百合15 g，白芍20 g，茯苓10 g，當歸 10 g，枳殼10 g，雞內金15 g，佛手10 g，炙甘草6 g。中藥均購自湖南老百姓大藥房，均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院專業(yè)藥師鑒定，符合《中國藥典》標準。飲片先浸泡40 min，頭煎加5倍水，先放炮山甲，大火先煎15 min，再下其他藥材，大火煮沸后改文火煎40 min；第二次煎加3倍水，水沸后文火煎25 min；兩次藥汁混勻并過濾，使用旋轉蒸發(fā)儀將藥物濃縮至2 g/mL以備高劑量組使用，藥液于4 ℃冰箱中存放。該藥液稀釋，待后即為低劑量組藥液。胃復春片，0.36 g/片，60片/盒，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。按照動物與人體的體質量比例折算，大鼠劑量為0.06 g/kg體質量，配制為0.1 g/mL的溶液，于4 ℃冰箱中備用。鹽酸雷尼替丁膠囊，0.15 g/片，30粒/盒，上?，F(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，按照0.3 g/kg雷尼替丁的標準配制造模組鼠料。N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG),5 g/瓶，由梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供，批號CFFC-M0527-5G。MNNG溶液的配制：將蒸餾水175 mL和40 ℃ 體積分數(shù)為500 mL/L的乙醇75 mL充分攪勻,配成12 g/L的MNNG母液250 mL(每周配1次)。于4 ℃冰箱保存，使用前將母液稀釋為120 mg/L的MNNG溶液，避光。氯化鈉溶液的配置：用60 ℃蒸餾水將氯化鈉液配成150 g/L的溶液10 μL/g，用以灌胃。蘇木素-伊紅(HE)染液、EDTA(pH值8.0)抗原修復液、EDTA(pH值9.0)抗原修復液、檸檬酸(pH值6.0)抗原修復液，均由武漢谷歌生物科技有限公司提供，批號分別為G1004、G1206、G1203、G1202。Hei-vap Advantage型旋轉蒸發(fā)儀，德國海道夫公司產(chǎn)品；Nikon Eclipse E100型正置光學顯微鏡、 Nikon DS-U3型成像系統(tǒng)，均來自日本尼康。

1.3 分組與模型的建立

將60只大鼠隨機分為正常對照組10只和造模組50只。正常對照組給予蒸餾水灌胃，1次/d，灌胃容積2 mL。造模組采用以MNNG為主的復合造模方法[9]。具體方法如下：每日自由飲用 質量分數(shù)為120 mg/L的MNNG溶液(飲水瓶用加厚黑色塑料袋包裹避光)，進食含0.03%雷尼替丁的標準鼠料，采取饑飽失常飼養(yǎng)方法(飽食1 d后禁食1 d),禁食當天下午用溫度60 ℃、質量分數(shù) 150 g/L 的鹽水10 μL/g灌胃。自16周開始，每周選取2只大鼠，取胃黏膜送病理檢查確定模型是否建立；至20周，確定造模成功后，隨機取造模組2只大鼠檢測以再次確認模型建立成功。將造模組剩余大鼠均分為模型對照組、胃復春組、莪蠶健胃方低劑量組、莪蠶健胃方高劑量組。

1.4 治療方法

自第21周起，正常對照組、模型對照組給予2 mL蒸餾水灌胃。莪蠶健胃方低、高劑量組依次按8.05，16.10 g/(kg·d)灌胃莪蠶健胃方湯劑，灌胃容積為2 mL。胃復春組按0.06 g/(kg·d)量給予胃復春湯劑灌胃，灌胃容積2 mL。各組均1次/d，連續(xù)10周。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 大鼠一般情況

仔細觀察并記錄各時期大鼠的精神狀態(tài)、體質量、毛色、活躍度、飲食情況、排泄物等。

1.5.2 取材及樣本處理

末次灌胃后，禁食24 h，不禁飲，稱量體質量，按5 μL/g的劑量予100 g /L水合氯醛腹腔注射麻醉，剖腹，快速取出胃組織，沿胃小彎剖開，生理鹽水沖洗。于胃竇、胃體處各取一小塊組織，以40 g/L多聚甲醛液固定，石蠟包埋、切片，于4 ℃冰箱中冷藏，用于病理檢測和免疫組化檢測。

1.5.3 胃黏膜組織病理學檢

將切片用HE染色，顯微鏡鏡檢，并進行圖像采集分析。

1.5.4 MVD、PFKFB3、CPT1A及GLS1表達

采用免疫組化法對CD31進行檢測，具體步驟：①石蠟切片脫蠟至水；②抗原修復；③阻斷內源性過氧化物酶；④血清封閉；⑤加一抗；⑥加二抗；⑦DAB顯色；⑧復染細胞核；⑨脫水封片；⑩顯微鏡鏡檢， 圖像采集分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況對比

正常對照組大鼠活潑好動，對外界刺激反應較敏感，食欲良好，體格健碩，皮毛有光澤，尾色淡紅，體質量正常增長，糞便顆粒狀，軟硬適中。與正常對照組大鼠對比，模型對照組大鼠精神狀態(tài)較差，懶動嗜臥，扎堆，對外界刺激反應較遲鈍，皮毛粗糙、無光澤，食欲欠佳，形體瘦弱，大便多不成形，墊料異味較正常對照組重。與模型對照組對比，胃復春組、莪蠶健胃方高劑量組大鼠的一般情況有所好轉，精神狀態(tài)可，活動度增加，食欲改善，體質量增加，糞便逐漸轉為成形，墊料異味減輕。莪蠶健胃方低劑量組大鼠的一般情況改善不明顯。

2.2 各組大鼠胃黏膜形態(tài)及組織病理學變化

肉眼下：正常對照組大鼠胃黏膜光滑柔軟，色澤粉紅，皺襞排列規(guī)則，可見黏液附著。模型對照組大鼠胃黏膜顏色變淺，胃壁增厚，伸展性差，黏膜皺襞紊亂，部分可見糜爛。各治療組大鼠胃黏膜色澤灰白，皺襞不規(guī)則，伸展性較差，少量黏液附著。

光鏡下：正常對照組、胃復春組及莪蠶健胃方高劑量組胃底腺呈管狀，排列緊密；組織形態(tài)結構基本正常，未見明顯病理變化，部分組織纖維化區(qū)域內可見中性粒細胞彌散性浸潤(圖1白色箭頭所示)。莪蠶健胃方高劑量組個別可見萎縮及低級別異型增生。模型對照組、莪蠶健胃方低劑量組可見不同程度的異型增生，主要表現(xiàn)為胃底腺大部分呈現(xiàn)萎縮(圖1黑色箭頭所示)，腺管結構排列明顯紊亂或不規(guī)則，甚至共壁，形狀大小不規(guī)則、分支狀。細胞核增大、粗桿狀、深染、密集呈假復層腺體排列較亂、參差不齊，分泌明顯減少或消失，頂部可見核分裂(圖1虛線箭頭所示)。少部分可見不同程度萎縮。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理學變化(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠MVD表達對比

見圖2。染色位于血管內皮細胞，呈棕黃色。MVD計數(shù)方法[10]：呈現(xiàn)棕黃色的內皮細胞或細胞簇同時有別于周圍組織(剔除厚壁及管腔>8個紅細胞大小的血管)的計為1條微血管。先在低倍鏡下找血管高密集區(qū)，再以3個高倍鏡下微血管計數(shù)的平均值作為最后的MVD值。見表1。

圖2 各組CD31染色情況(免疫組織化學染色，×400)

表1 各組MVD值結果

2.4 各組大鼠PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達對比

PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達量見圖3、圖4和圖5。結果顯示：與正常對照組對比，模型對照組中CPT1A及GLS1蛋白表達量均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);PFKFB3蛋白表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，胃復春組、莪蠶健胃方高劑量組CPT1A及GLS1蛋白表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);PFKFB3蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而莪蠶健胃方低劑量組PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達量較之，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。胃復春組和莪蠶健胃方高劑量組之間的PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達量對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖3 各組PFKFB3的染色情況(免疫組織化學染色，×400)

圖4 各組CPT1A染色情況(免疫組織化學染色，×200)

圖5 各組GLS1的染色情況(免疫組織化學染色，×200)

表2 各組PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達對比

3 討 論

腫瘤生長、浸潤和轉移離不開新生血管的形成。腫瘤早期獲取營養(yǎng)和氧氣主要通過彌散作用；后期因腫瘤不斷增長，彌散方式所獲得的營養(yǎng)和氧氣相對匱乏，腫瘤便啟動新生血管形成以滿足自身需求[11]。血管內皮細胞(endothelial cell，EC)作為血管的組成之一，既能參與營養(yǎng)和氧氣的輸送又能釋放許多細胞因子，以滿足腫瘤不斷增長的需求[12]。在病理條件下，血管由靜止狀態(tài)轉變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，在多種促新生血管生成因子的作用下，血管內皮細胞分裂、遷移并分化成為莖細胞和頂端細胞，從而完成血管出芽新生過程。EC的代謝影響著血管的生成，三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid，TCA)是體內三大營養(yǎng)物質(糖類、脂類、蛋白質)進行代謝的通路。EC通過TCA進行代謝，釋放能量以滿足腫瘤血管的生長。其中PFKFB3作為糖酵解的關鍵限速酶，影響著內皮細胞的增殖與轉移，從而抑制血管出芽,影響腫瘤血管生成。CPT1A是脂肪酸β氧化(fatty acid β-oxidation，F(xiàn)AO)的關鍵酶。內皮細胞缺乏CPT1A則會影響細胞增殖和遷移，從而阻礙血管新生[13-14]。GLS1缺乏致使谷氨酰胺代謝受到抑制，進而損害頂端細胞的遷移和莖細胞增殖，導致體內血管萌芽缺陷[15]。

胃癌前病變是胃癌形成前的一個重要過程，在此過程中，胃黏膜血管內皮細胞的增生起著重要的作用。研究[16-17]表明，胃癌前病變階段，血管生成就明顯增多。相關實驗[18]顯示，上皮內瘤變與萎縮性胃炎的胃黏膜、腸上皮化生組織相比，MVD顯著提高。當前有很多研究表明，PFKFB3在乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、肝癌中存在高表達，可通過抑制PFKFB3的表達、干預血管內皮細胞的增殖達到抗血管生成從而阻斷腫瘤的發(fā)生。有實驗研究[19-20]表明，使用PFKFB3的抑制劑3PO[3-(3-pyridinyl)-1-(4-pyridinyl)-2-propen-1-one]干預患有視網(wǎng)膜病理性增生疾病的小鼠后，小鼠視網(wǎng)膜病理性血管的增生明顯減少。CPT1A在許多惡性腫瘤中均出現(xiàn)異常高表達，CPT1A 轉錄水平的調控是其促腫瘤細胞增殖和轉移的重要機制[21]。11q13-q14 的擴增是雌激素受體陽性乳腺癌的標志性基因組改變[22]，而CPT1A基因是該擴增區(qū)重要的促增殖基因[23]。在卵巢癌中，異常高表達的CPT1A促使FAO和細胞內腺苷三磷酸水平增加，從而促進卵巢癌細胞的增殖[24]。在膠質母細胞瘤中，CPT1A表達水平與患者腫瘤細胞的高分化狀態(tài)呈明顯正相關[25]。有國外研究報道GLS1在肝癌、甲狀腺癌的表達量顯著上調[26-27]。另有研究[29]也發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中GLS1表達量上調，而 GLS2表達量下調，在肝癌進展過程中出現(xiàn)GLS2向GLS1表達的轉變[28]。乳腺癌基質細胞GLS1表達量亦顯著上調。在膠質母細胞瘤細胞中，敲除GLS1能夠降低腫瘤細胞的生存及增殖能力，證明GLS1具有“促癌效應”[30]。

莪蠶健胃方是湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院黃柳向教授治療胃癌前病變的經(jīng)驗方，該方由13味藥組成：黃芪 30 g，莪術10 g，太子參 30 g，僵蠶10 g，炮山甲 3 g，百合15 g，當歸 10 g，白芍 20 g，茯苓10 g，枳殼10 g，佛手10 g，雞內金 15 g，炙甘草 6 g。全方共奏益氣健脾、化痰祛瘀之功，恰中胃癌前病變本虛標實，以脾胃虛為本，氣滯、血瘀、痰瘀為標之病機。本方的前期實驗研究[7-8]表明，PLGC階段胃黏膜即存在新生血管生成，莪蠶健胃方可通過降低VEGF、HIF-1ɑ、MMP-2在蛋白和mRNA上的表達量，抑制新生血管生成，從而逆轉PLGC。而現(xiàn)代藥理學顯示：黃芪中的黃芪皂苷[31]、莪術中的莪術油[32]、僵蠶中的麥角甾醇、β-谷甾醇和棕櫚酸[33]，以及當歸與黃芪的配伍[34]等均可抑制腫瘤生長，具有抗腫瘤的作用。

本實驗中，莪蠶健胃方具有改善PLGC模型大鼠的一般情況及胃黏膜組織病理學改變的作用。與正常對照組對比，模型對照組中MVD蛋白表達明顯升高，說明在胃癌前病變中新生血管生成已明顯增多；且在模型大鼠胃黏膜組織中的PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白均呈現(xiàn)高表達，表明三者的高表達均參與了PLGC的發(fā)生。腫瘤發(fā)生、生長及轉移均離不開新生血管的生成，血管內皮細胞代謝影響著血管的生成，而PFKFB3、CPT1A及GLS1在血管生成中均起著關鍵作用。目前大多數(shù)研究顯示，PFKFB3、CPT1A、GLS1在惡性腫瘤細胞中高表達量。PLGC是胃癌轉化的關鍵步驟。本實驗研究顯示，PFKFB3、CPT1A及GLS1在PLGC模型大鼠胃黏膜組織中表達量均明顯增加。因此，可認為PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達量上調是PLGC轉化為胃癌的關鍵因素之一。

本實驗研究顯示，與模型對照組對比，莪蠶健胃方高劑量組可明顯降低MVD蛋白表達量，說明抑制血管生成可能是莪蠶健胃方改善甚至逆轉PLGC的治療機制之一。兩種劑量的莪蠶健胃方和胃復春在降低PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達量上效果各異：莪蠶健胃方低劑量組的降低效果不明顯；莪蠶健胃方高劑量組和胃富春組的降低效果明顯，且莪蠶健胃方高劑量組稍優(yōu)于胃復春組。這表明莪蠶健胃方可能通過降低PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達量進而抑制血管生成，從而達到改善甚至逆轉PLGC的治療作用，其治療作用與藥物劑量有關。

綜上所述，在胃癌前病變階段新生血管生成活躍，且此階段PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白均呈現(xiàn)高表達。莪蠶健胃方能明顯降低胃癌前病變胃黏膜組織中的MVD、PFKFB3、CPT1A及GLS1蛋白表達量。莪蠶健胃方能有效治療PLGC，可能通過下調PFKEB3、CPT1A及GLS1蛋白表達量來干預PLGC血管內皮細胞代謝，抑制血管生成，從而起到干預PLGC向胃癌發(fā)展的進程。