Shine i2900 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血栓分子標(biāo)志物的性能評(píng)價(jià)

孫 聰，梅燕萍，崔薇薇，王一杉

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，南京市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，南京 210006）

0 引言

血栓分子標(biāo)志物包含血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物（TAT）、組織型纖溶酶原激活物-纖溶酶原激活抑制物-1 復(fù)合物（t-PAIC）及纖溶酶-α2 纖溶酶抑制物復(fù)合物（PIC），臨床上常簡(jiǎn)稱為血栓四項(xiàng)。TM 是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的跨膜糖蛋白，生理情況下，TM 通過抑制凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶、捕獲凝血酶使其失去活性并有效激活蛋白C（PC），放大PC 的抗凝效應(yīng)來發(fā)揮抗凝作用。TM 分為固定型（膜型）和溶解型（血液型），固定型存在于細(xì)胞表面，而溶解型游離于血漿和尿液中[1]。TAT 為血液中凝血酶（相對(duì)不活躍）與抗凝血酶Ⅲ按1∶1 比例結(jié)合形成的復(fù)合物，在血液中半衰期較短，為3～15 min。TAT的顯著增加說明機(jī)體內(nèi)凝血系統(tǒng)被激活且處于高水平，提示血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，可以較早反映人體凝血功能。t-PAIC 為組織型纖溶酶原激活物（t-PA）與纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）以1∶1 比例結(jié)合形成的復(fù)合物，是用于反映纖溶系統(tǒng)的標(biāo)志物，其血漿濃度增高提示PAI-1 活性增加，主要反映內(nèi)皮系統(tǒng)損傷（器官損傷性質(zhì)）。PIC 是纖溶酶生成后與α2 纖溶酶抑制物以1∶1 比例結(jié)合形成的復(fù)合物，其半衰期為6 h，可以直接測(cè)量并間接反映纖溶酶的生成，彌補(bǔ)了纖溶酶半衰期短、不易檢測(cè)的缺陷。在過去的幾十年中，由于檢測(cè)手段的局限，這些血栓分子標(biāo)志物未能廣泛應(yīng)用于臨床。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用于分子標(biāo)志物的檢測(cè)后，這些分子標(biāo)志物在血栓性疾病的診斷、治療及預(yù)后判斷中具有更為廣闊的臨床應(yīng)用前景。

我科于2021 年9月引進(jìn)了一臺(tái)廣州萬孚公司研發(fā)生產(chǎn)的Shine i2900 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用于檢測(cè)血栓四項(xiàng)。CNAS CL02：2012 文件要求，新的檢測(cè)系統(tǒng)在投入使用前必須進(jìn)行性能驗(yàn)證。本研究依據(jù)中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)制定的CNAS-GL037：2019《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》，同時(shí)參考WS/T 492—2016[2]、WS/T 408—2012[3]、WS/T 402—2012[4]相關(guān)文件對(duì)該儀器檢測(cè)血栓四項(xiàng)進(jìn)行性能驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 一般資料

5 例高值血漿樣品來源于本院經(jīng)影像學(xué)診斷有血栓形成的臨床患者，健康人群的血漿樣品來源于本院進(jìn)行健康體檢的人群。參考WS/T 402—2012 標(biāo)準(zhǔn)篩選參加體檢人群，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：（1）無各種急慢性疾?。唬?）6 個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行手術(shù)，4 個(gè)月內(nèi)未獻(xiàn)血、輸血或大量失血，2 周內(nèi)未服用藥物；（3）無營養(yǎng)不良、素食、酗酒、嗜煙；（4）近期無劇烈運(yùn)動(dòng)或重體力勞動(dòng)；（5）未處于妊娠或哺乳期；（6）實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果正常。

1.2 儀器與試劑

儀器：廣州萬孚公司Shine i2900 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法試劑盒及質(zhì)控品均為廣州萬孚公司生產(chǎn)，主要包括：TM 測(cè)定試劑盒（批號(hào)：W39121501F2900），TAT 測(cè)定試劑盒（批號(hào)：W39221601F2900），t-PAIC 測(cè)定試劑盒（批號(hào)：W39421601F2900），PIC 測(cè)定試劑盒（批號(hào)：W39321601F2900）；TM 質(zhì)控品（批號(hào)：W85421601F2900），TAT 質(zhì)控品（批號(hào)：W85521601F2900），t-PAIC 質(zhì)控品（批號(hào)：W85721501F2900），PIC 質(zhì)控品（批號(hào)：W85621501F2900）；TM、TAT、t-PAIC、PIC 校準(zhǔn)品（批號(hào)：W39121601F2900、W39121501F2900）。

1.3 方法

1.3.1 精密度測(cè)試

精密度是保證所有性能驗(yàn)證試驗(yàn)正確進(jìn)行的前提，因此精密度驗(yàn)證應(yīng)放在其他性能驗(yàn)證之前，否則無法保證后續(xù)性能驗(yàn)證結(jié)果的可靠性[5]。選用廣州萬孚公司生產(chǎn)的血栓四項(xiàng)質(zhì)控品，參考WS/T 492—2016行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精密度的評(píng)價(jià)。每天開機(jī)后確認(rèn)儀器性能符合要求后進(jìn)行測(cè)試。每天測(cè)定一批含2 個(gè)濃度的質(zhì)控品，每個(gè)濃度連續(xù)測(cè)定3 次，由同一名工作人員連續(xù)測(cè)定5 d。分別計(jì)算出總均值、批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差、批間標(biāo)準(zhǔn)差、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差，并據(jù)此計(jì)算實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

1.3.2 正確度測(cè)試

在精密度測(cè)試滿足要求的前提下，根據(jù)GL-037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》的要求，通過測(cè)定參考物質(zhì)進(jìn)行正確度驗(yàn)證，可通過計(jì)算與參考物質(zhì)的偏倚來判斷是否通過。本次測(cè)試通過測(cè)量2個(gè)濃度的廠商校準(zhǔn)品來進(jìn)行驗(yàn)證。

先使用批號(hào)為W39121601F2900 的校準(zhǔn)品進(jìn)行各檢測(cè)項(xiàng)目的定標(biāo)，再測(cè)定批號(hào)為W39121501 F2900的校準(zhǔn)品進(jìn)行正確度的驗(yàn)證。參考CNAS-GL039：2019 的要求，每天測(cè)定2 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品4 次，連續(xù)測(cè)定5 d。計(jì)算出均值，再通過公式：偏倚（%）=，計(jì)算出各項(xiàng)目測(cè)定均值與校準(zhǔn)品參考值之間的偏倚。

1.3.3 線性范圍測(cè)試

以WS/T 408—2012 為參考標(biāo)準(zhǔn)，采用多項(xiàng)式回歸分析法進(jìn)行線性范圍驗(yàn)證，選擇低濃度（L）和高濃度（H）患者標(biāo)本各一份，按5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H 混合成6 個(gè)樣本。每份混合樣本測(cè)定3 次，取平均值作為測(cè)定值。將測(cè)定值用Grubbs 法進(jìn)行離群點(diǎn)檢查。如無離群點(diǎn)則采用SPSS 軟件進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析。如計(jì)算出的方程為線性方程時(shí)，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密度檢查，檢查公式為

1.3.4 臨床可報(bào)告范圍測(cè)試

選取線性范圍附近的高濃度樣本，用生理鹽水分別按1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40 比例進(jìn)行稀釋，將配制好的樣本重復(fù)檢測(cè)2 次取平均值，同時(shí)計(jì)算出對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)下的理論值。按回收率=（測(cè)定值-理論值）/理論值×100%的公式計(jì)算回收率，以回收率＜10%作為該稀釋倍數(shù)下的測(cè)定結(jié)果可靠的判斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床可報(bào)告范圍的上限為線性范圍上限乘以最大稀釋倍數(shù)，下限為線性范圍的下限。

1.3.5 參考區(qū)間驗(yàn)證

參考WS/T 402—2012 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證，篩選本院體檢健康人群，按性別分成2 組，每組各20 名，其中男性組22～78 歲，女性組19～84 歲。每組數(shù)據(jù)先用Dixon 法進(jìn)行離群點(diǎn)檢查，如有90%的測(cè)量值落在參考區(qū)間內(nèi)，則通過驗(yàn)證，否則應(yīng)重新進(jìn)行參考區(qū)間的確立測(cè)試。

1.3.6 穩(wěn)定性測(cè)試

選取10 個(gè)不同濃度的樣品，設(shè)置即刻檢測(cè)、常溫放置8 h 及2～4 ℃放置24 h 3 個(gè)條件分別對(duì)這10個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)試。通過計(jì)算每個(gè)樣本常溫放置8 h結(jié)果、2～4 ℃放置24 h 結(jié)果與即刻檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差來驗(yàn)證其穩(wěn)定性。以相對(duì)偏差＜10%、總符合率≥90%為驗(yàn)證通過。

2 結(jié)果

2.1 精密度測(cè)試結(jié)果

2 個(gè)濃度質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果顯示，TM、TAT、PIC、t-PAIC 4 個(gè)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV 均小于2%，滿足廠商宣稱的（CV≤8%）要求，精密度較好。詳見表1。

表1 精密度測(cè)試結(jié)果

2.2 正確度測(cè)試結(jié)果

通過測(cè)試計(jì)算出Shine i2900 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)TM、TAT、PIC、t-PAIC 4 個(gè)項(xiàng)目的偏倚范圍為-7.04%～-2.07%，滿足廠商要求（10%以內(nèi)），正確度符合要求。詳見表2。

表2 正確度測(cè)試結(jié)果

2.3 線性范圍測(cè)試結(jié)果

根據(jù)WS/T 408—2012 要求，首先對(duì)Shine i2900全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)每個(gè)項(xiàng)目得到的18 個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行離群點(diǎn)檢查，結(jié)果見表3。

以顯著水平σ=0.05，樣本重復(fù)測(cè)定次數(shù)為3次，查Grubbs 臨界值表得臨界值為1.153[3]，而表3 中t1、t2均≤1.153，故判斷數(shù)據(jù)無離群點(diǎn)，可用于進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析。

表3 離群點(diǎn)檢查結(jié)果

通過表4～7 的數(shù)據(jù)分析，4 個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的非線性系數(shù)二次回歸多項(xiàng)式的b2、三次回歸多項(xiàng)式的b2和b3與0 之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故拒絕二次多項(xiàng)式及三次多項(xiàng)式，最適合的多項(xiàng)式均為一次多項(xiàng)式。按前述方法進(jìn)行精密度檢查結(jié)果均通過，證明本次線性范圍測(cè)試精密度符合要求，且得出的線性范圍與廠商宣稱值基本一致。詳見表8。

表4 TM 多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果

表8 精密度檢查及線性范圍結(jié)果

2.4 臨床可報(bào)告范圍測(cè)試結(jié)果

對(duì)高濃度樣本進(jìn)行稀釋，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示TAT、TM、PIC、t-PAIC 4 個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的最大稀釋倍數(shù)均為40 倍。詳見表9。

表9 最大稀釋倍數(shù)結(jié)果

結(jié)合最大稀釋倍數(shù)與線性范圍結(jié)果可計(jì)算出血栓四項(xiàng)的可報(bào)告范圍，即TM 為1.02～8001.20TU/mL，TAT為0.50～4800.00 ng/mL，PIC 為0.06～1617.20 μg/mL，t-PAIC 為0.50～4000.00 ng/mL。

表5 TAT 多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果

表6 PIC 多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果

2.5 參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

本次驗(yàn)證采用Dixon 法進(jìn)行離群點(diǎn)檢查，未發(fā)現(xiàn)存在離群點(diǎn)。TAT（女性）、PIC（女性）驗(yàn)證的符合率為90%，TAT（男性）、t-PAIC（女性）驗(yàn)證的符合率為95%，其余檢測(cè)項(xiàng)目的符合率為100%，所有檢測(cè)項(xiàng)目參考區(qū)間驗(yàn)證均符合要求。詳見表10。

表10 參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

表7 t-PAIC 多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

10 份樣本在常溫8 h 和2～4 ℃24 h 下放置后，檢測(cè)結(jié)果與即刻檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較，相對(duì)偏差均在10%以內(nèi)，符合率為100%。詳見表11～14。

表11 TM 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

3 討論

近年來，血栓性疾病的發(fā)病率越來越高，而血栓性疾病中，靜脈血栓占有較高的比例。大部分的靜脈血栓發(fā)病前都沒有明顯的癥狀，但靜脈血栓常會(huì)引起肺栓塞，導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。據(jù)《中國血栓性疾病防治指南》要求，預(yù)防靜脈血栓的工作尤為重要[6]。當(dāng)血漿TAT、PIC、TM、t-PAIC 水平升高時(shí)，可反映早期深靜脈血栓形成發(fā)生時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凝血纖溶系統(tǒng)失衡情況，這4項(xiàng)指標(biāo)可作為影響孕中晚期靜脈血栓發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，聯(lián)合檢測(cè)可為臨床早期診斷提供參考。血栓四項(xiàng)也可用于彌散性血管內(nèi)凝血的早期檢測(cè)。目前對(duì)彌散性血管內(nèi)凝血的檢測(cè)主要是以篩查為主，無法早期發(fā)現(xiàn)、分型。彌散性血管內(nèi)凝血治療效果判定的臨床指標(biāo)與原發(fā)性疾病癥狀是否改善很難區(qū)分，目前實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)主要是血小板計(jì)數(shù)、纖維蛋白原及纖維蛋白降解產(chǎn)物，這3 個(gè)指標(biāo)的恢復(fù)比較慢，無法實(shí)時(shí)反映疾病狀態(tài)。據(jù)多項(xiàng)研究表明，TM、PIC 和t-PAIC的水平升高可以早期預(yù)測(cè)膿毒癥患者彌散性血管內(nèi)凝血的發(fā)生，聯(lián)合預(yù)測(cè)的價(jià)值優(yōu)于單個(gè)檢測(cè)，其中當(dāng)TM＞11.5 TU/mL 時(shí)膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)升高，聯(lián)合序貫性器官衰竭評(píng)分（sequential organ failure assessment，SOFA）≥1 分可為診斷膿毒癥相關(guān)性凝血病提供參考[7-8]。

Shine i2900 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行血栓四項(xiàng)的檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室開展。根據(jù)ISO 15189：2012 要求，實(shí)驗(yàn)室在引入新的檢測(cè)系統(tǒng)前，需進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，應(yīng)通過獲取客觀數(shù)據(jù)證實(shí)檢驗(yàn)程序的性能與其聲明相符。

本次實(shí)驗(yàn)參考WS/T 492—2016，選用2 個(gè)濃度的質(zhì)控品進(jìn)行精密度測(cè)試，得出血栓四項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV 均小于2%。因該項(xiàng)目為新開展項(xiàng)目，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心尚未提供評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，故參考廠商說明書的聲明值（CV≤8%），該儀器的精密度良好。之后通過測(cè)量2 個(gè)濃度的廠商校準(zhǔn)品來進(jìn)行正確度驗(yàn)證，4 個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的偏倚為-7.04%～-2.07%，結(jié)果存在一定的負(fù)偏倚，偏倚度滿足廠商要求，正確度也符合要求。

表12 TAT 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

表13 PIC 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

線性是指在給定的范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果與檢測(cè)分析物的量直接成比例的能力，實(shí)驗(yàn)室正確評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)的線性范圍才能保證檢測(cè)結(jié)果的有效性。本次線性范圍測(cè)試在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無離群點(diǎn)存在的前提下，回歸分析顯示4 個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目均為一次多項(xiàng)式為最適多項(xiàng)式，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密度檢查也符合要求。本次驗(yàn)證的線性范圍TM 為1.02～200.03 TU/mL，TAT 為0.50～120.00 ng/mL，PIC 為0.06～40.43 μg/mL，t-PAIC為0.50～100.00 ng/mL，與廠商宣稱范圍基本一致，可滿足臨床要求。

表14 t-PAIC 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

可報(bào)告范圍是檢測(cè)方法所能定量報(bào)告的分析物值的范圍，允許對(duì)樣本進(jìn)行稀釋、濃縮或者其他預(yù)處理，擴(kuò)展了患者結(jié)果的可報(bào)告范圍，其上限的確定一般采用線性稀釋回收法[9-12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明血栓四項(xiàng)最大稀釋倍數(shù)均為40 倍，在最大稀釋倍數(shù)時(shí)的可回收率均＜10%。以線性范圍下限作為可報(bào)告范圍的下限，線性范圍上限和最大可稀釋倍數(shù)的乘積作為可報(bào)告范圍的上限，可得出Shine i2900 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血栓四項(xiàng)的臨床可報(bào)告范圍。

本次實(shí)驗(yàn)從健康體檢人群中按性別篩選出2組，每組20 人，進(jìn)行了參考區(qū)間的驗(yàn)證。在排除離群點(diǎn)干擾的可能性后，有大于90%的結(jié)果落在廠商提供的參考區(qū)間內(nèi)，證明廠商給出的參考區(qū)間在本實(shí)驗(yàn)室適用。

合格的血漿樣本是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提，其受血液樣本采集和處理的一系列環(huán)節(jié)（如采血器具的選擇、抗凝劑的使用、采血技術(shù)、血漿樣本的獲取和樣本的轉(zhuǎn)運(yùn)及保存等）影響。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)凝血項(xiàng)目，如凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）等檢測(cè)時(shí)均要求在常溫條件下分離血漿，4 h 內(nèi)完成檢測(cè)[13]。血栓四項(xiàng)作為新型的血栓檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)樣本穩(wěn)定性的要求未見相關(guān)報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)比對(duì)了常溫放置8 h、2～4 ℃放置24 h 后與即刻檢測(cè)的樣本，比對(duì)結(jié)果的偏差均在10%以內(nèi)。結(jié)果表明在上述存儲(chǔ)條件下，用于血栓四項(xiàng)檢測(cè)的樣本性狀穩(wěn)定。

綜上，本次性能評(píng)價(jià)從精密度、正確度、線性范圍、臨床可報(bào)告范圍、參考區(qū)間驗(yàn)證、穩(wěn)定性測(cè)試6個(gè)方面對(duì)Shine i2900 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血栓四項(xiàng)進(jìn)行了驗(yàn)證，綜合結(jié)果顯示該儀器檢測(cè)血栓四項(xiàng)的效能均達(dá)到廠商宣稱指標(biāo)，可滿足臨床使用要求。