陸地棉UDPGP 基因家族的鑒定及抗旱性分析

陳琴，李多露，趙杰銀，高文舉，陳全家，曲延英

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 教育部棉花工程研究中心/ 新疆作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，烏魯木齊 830052）

新疆是我國最大的植棉區(qū)，相較于國內(nèi)其他棉區(qū)有著氣候干燥、晝夜溫差大、日照時間長等優(yōu)勢。 截至2020 年，新疆棉花種植面積和總產(chǎn)量已分別占全國的78.9%和87.3%[1]。 然而，水分蒸發(fā)量大、水資源匱乏，以及日益加重的土地鹽堿化， 致使新疆植棉面積和纖維品質(zhì)受到影響，嚴重制約了新疆棉花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2]。 植物遭受到干旱脅迫時， 往往會發(fā)生細胞膜通透性增加、葉綠體減少、 體內(nèi)活性氧積累量增加等現(xiàn)象，導(dǎo)致植物萎蔫、體內(nèi)細胞代謝水平紊亂[3-4]。 在長期的干旱脅迫下，植物會改變自身形態(tài)結(jié)構(gòu)和體內(nèi)生理生化水平以更好地適應(yīng)干旱環(huán)境。

蔗糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，是植物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成中不可或缺的成分[5]。 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（Uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase, UDPGP） 作為蔗糖代謝過程中次級代謝產(chǎn)物尿苷二磷酸葡萄糖（Uridine diphosphate glucose,UDPG）合成的關(guān)鍵酶之一，在植物的生長、發(fā)育、養(yǎng)分儲存、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和適應(yīng)環(huán)境脅迫中起著關(guān)鍵作用[6-8]。研究表明，一方面UDPGP 能夠催化葡萄糖活化，將1- 磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDPG，再通過蔗糖磷酸合成酶合成6-磷酸蔗糖， 之后6-磷酸蔗糖在蔗糖磷酸酶的作用下合成蔗糖[9-10]；另一方面，蔗糖能夠在蔗糖合酶或轉(zhuǎn)化酶作用下降解為UDPG，參與植物體內(nèi)的糖代謝調(diào)控[11-12]。

UDPGP 參與代謝調(diào)控以及糖原、 淀粉和纖維素等物質(zhì)的合成，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。 Flores-Diaz 等[13]研究表明，UDPGP基因的單點突變會導(dǎo)致細胞UDPG 缺乏；Meng 等[14]研究也顯示UDPGP 不是蔗糖、 淀粉和細胞壁合成的限速酶， 但它在擬南芥中必不可少，UDPGP缺失的擬南芥突變體種子產(chǎn)量下降高達50%；Long 等[7]利用水稻突變體研究發(fā)現(xiàn)，編碼UDPGP1的FLOURY ENDOSPERM 8 影響水稻胚乳中淀粉的合成；陳小敏等[15]證明小分子碳源和有機氮源能夠提高香菇菌絲胞內(nèi)UGP基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進多糖含量的增加；Wang 等[16]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)棉花UPGPG基因的擬南芥可溶性糖、 淀粉和纖維素含量增加，但木質(zhì)素含量未增加，表明該基因參與了擬南芥糖代謝和細胞壁的生物合成。 Zhang等[17]預(yù)測UPGPG基因的過表達可能增加黃麻的纖維素含量。 UDPGP 也參與了植物對非生物脅迫的響應(yīng)過程。 郭鑫[18]研究表明，興安落葉松中的LgUGPase1和LgUGPase2基因主要參與植物生長發(fā)育中的代謝調(diào)控，對光、逆境脅迫和植物激素有一定的響應(yīng)。 Deng 等[19]發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）的UPGPG突變體對十二烷基硫酸鈉和高濃度NaCl 敏感， 對棉花和煙草幼苗的毒力降低，突變孢子的萌發(fā)顯著延遲。 但目前關(guān)于陸地棉 （Gossypium hirsutumL.）UPGPG基因的系統(tǒng)鑒定和抗旱相關(guān)研究尚未見報道。本研究基于本課題組蛋白雙向電泳及質(zhì)譜分析篩選結(jié)果[20]，選擇棉花抗旱相關(guān)的GhUDPGP基因，并對其基因家族進行生物信息學(xué)分析，旨在解析UDPGP基因家族在棉花中的進化和擴增， 以及在棉花干旱脅迫應(yīng)答過程中的表達模式，為深入解析GhUDPGP基因在植物干旱脅迫響應(yīng)過程中的功能和作用機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

本研究所用陸地棉耐旱品種KK1543 和干旱敏感品種新陸早26 號[21]均由新疆作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室保存。 采用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液水培法將棉花幼苗培養(yǎng)至兩葉一心， 用15%（質(zhì)量分數(shù)） 聚乙醇（Polyethylene glycol,PEG）6000 模擬干旱脅迫， 分別于處理后0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 對棉花根、莖、葉進行取樣，每個樣品3 次生物學(xué)重復(fù)，置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 GhUDPGP 家族基因鑒定與蛋白理化性質(zhì)分析

從CottonGen 數(shù)據(jù)庫（https://www.cottongen.org/）中下載陸地棉基因組（ZJU,TM-1,2.1）和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。借助UDPGP 蛋白結(jié)構(gòu)域（PF01704）的隱馬爾可夫模型， 基于Hmmsearch 搜索結(jié)果，通過本地Blast 獲取陸地棉全基因組UDPGP 蛋白序列，進一步利用在線數(shù)據(jù)庫CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）、Pfam（http://pfam.xfam.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）鑒定含有完整UDPGP 結(jié)構(gòu)域的蛋白。 利用ExPASy（http://cn.expasy.org/tools）在線工具和ProtComp Version 9.0 軟件分析陸地棉UDPGP 蛋白的氨基酸殘基數(shù)量、分子質(zhì)量、理論等電點及亞細胞定位等。

1.3 進化樹分析

利用MEGA 7 軟件中的Clustal W 對陸地棉的UDPGP 蛋白序列進行多序列比對， 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其中自展值（Bootstrap）設(shè)定為1 000[22]，利用在線網(wǎng)站Evolview （https://evolgenius.info//evolview-v2/）對結(jié)果進行可視化展示。

1.4 染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析

利用TBtools 軟件提取GhUDPGP基因在染色體上的位置信息。 通過MEME 程序[23]對UDPGP家族成員進行基序分析（最大發(fā)現(xiàn)數(shù)設(shè)為15）。通過CottonGen 下載基因組注釋文件，利用TBtools軟件進行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.5 順式作用元件預(yù)測

通過TBtools 提取陸地棉UDPGP基因起始密碼子上游2 000 bp 序列作為啟動子區(qū)， 利用Plant CARE 數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測GhUDPGP基因啟動子區(qū)可能存在的順式作用元件。

1.6 RNA-seq 分析

從NCBI SAR 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載陸地棉不同器官（根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托）和干旱脅迫處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) （基因組測序計劃編號：PRJNA248163）。 對原始數(shù)據(jù)進行標準分析，得到表達量數(shù)據(jù)。 基于TPM（Transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads）對表達量數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2（TPM＋1）標準化處理，并利用R 4.0.2 軟件進行表達量熱圖的繪制。

1.7 基因表達分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果， 利用Premier 5.0 和DNAMAN 軟件設(shè)計GhUDPGP10和GhUDPGP26的特異性引物（表1），通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 檢測1.1 中各材料中2 個基因的表達情況。以GhUbq7基因作為內(nèi)參基因，在ABI 7500 fast 實時熒光定量PCR 儀上進行qRT-PCR 分析。 反應(yīng)體系為20.0 μL， 包括Eva Green2×qPCRMasterMix910.0 μL、ddH2O6.8 μL、正反向引物各0.6 μL、cDNA 模板2.0 μL。 PCR擴增條件為94 ℃30 s；94 ℃5 s；60 ℃30 s，40個循環(huán)后增加熔解曲線。 每個樣品進行3 次重復(fù)， 采用2－ΔΔCt法進行基因表達量的相對定量分析。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉UDPGP 基因的鑒定和分析

本研究在陸地棉基因組中共鑒定出31 個GhUDPGP基因。根據(jù)GhUDPGP基因在染色體上的位置依次命名為GhUDPGP01～GhUDPGP31。如表2 所示，經(jīng)預(yù)測，UDPGP基因家族成員的開放閱讀框 （Open reading frame, ORF） 長度為186～2 628 bp，UDPGP 蛋白質(zhì)含有61～875 個氨基酸殘基，其分子質(zhì)量為6.88～96.66 ku，等電點為4.91～9.91。 31 個基因不均等地分布在18條染色體上， 其中A 亞組有12 個，D 亞組有19個。亞細胞定位預(yù)測顯示，陸地棉中UDPGP 家族成員定位于細胞質(zhì)或細胞間隙。

表2 陸地棉UDPGP 基因信息Table 2 Information of UDPGP genes in G. hirsutum

2.2 陸地棉UDPGP 蛋白的進化分析

陸地棉31 個UDPGP 蛋白的系統(tǒng)進化樹（圖1）顯示，陸地棉UDPGP 蛋白可分為5 個亞族Ⅰ～Ⅴ， 其中A 亞組的8 個蛋白與D 亞組的同源蛋白（圖1 中☆標記）分別聚在一起，這個結(jié)果也證實了約150 萬年前棉屬A 和D 亞基因組發(fā)生的多倍化事件[24]。 此外，來自D 亞組3 對蛋白（圖1中△標記）間相似性為81%～99%，推測它們可能在長期的進化過程中發(fā)生了分化；還有9 個蛋白（圖1 中○標記）沒有發(fā)現(xiàn)同源蛋白，說明編碼這些蛋白的基因可能在進化過程中發(fā)生了突變或者其同源基因丟失。

圖1 陸地棉31 個UDPGP 蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of 31 UDPGP proteins from G. hirsutum

2.3 陸地棉UDPGP 基因的結(jié)構(gòu)特征分析

利用MEME 分析UDPGP 蛋白保守基序發(fā)現(xiàn)，相同亞族的成員含有相同的基序（圖2 A），第Ⅰ亞族的基序最多（15 個），而第Ⅳ亞族的2 個蛋白僅有2 個基序。 基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該家族基因成員含有2～21 個外顯子 （圖2 B），其中GhUDPGP06、GhUDPGP10、GhUDPGP20和GhUDPGP26基因的外顯子數(shù)目最多 （21 個），GhUDPGP18、GhUDPGP27和GhUDPGP29基因的外顯子數(shù)目最少（2 個）。從基因長度來看，不同長度的基因具有相似的編碼區(qū)序列， 說明UDPGP基因在進化過程中內(nèi)含子長度存在較大的變異，可能導(dǎo)致其功能多樣化。

圖2 陸地棉UDPGP 蛋白保守基序（A）及基因結(jié)構(gòu)（B）特征分析Fig. 2 Analysis of conserved motif (A) and gene structure (B) of UDPGP family in G. hirsutum

2.4 陸地棉UDPGP 家族基因的順式作用元件分析

啟動子區(qū)順式作用元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在陸地棉UDPGP家族基因啟動子序列中，有19 個基因含有響應(yīng)脫落酸的ABRE 元件、17 個基因含有響應(yīng)赤霉素的GARE 元件、14 個基因含有響應(yīng)水楊酸的TCA 順式作用元件。 此外，還發(fā)現(xiàn)11 個基因含有響應(yīng)生長素的TGA 元件、14 個基因含有響應(yīng)干旱的MYB 結(jié)合位點、14 個基因包含響應(yīng)茉莉酸甲酯的TGACG 元件。 這些發(fā)現(xiàn)暗示陸地棉UDPGP基因除參與植物生長代謝調(diào)控外，還與植物的逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

2.5 陸地棉UDPGP 家族基因表達分析

為明確UDPGP基因的組織表達特異性及其在干旱脅迫下的表達模式，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對31個GhUDPGP基因在棉花根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托及干旱脅迫處理后不同時間點的表達量進行聚類分析。 組織特異性表達分析顯示（圖3A），正常生長條件下，不同GhUDPGP基因呈現(xiàn)不同的表達模式， 其中GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在陸地棉各個器官中均存在不同程度高表達，其余基因則呈現(xiàn)低表達甚至不表達趨勢，暗示GhUDPGP10和GhUDPGP26基因可能在陸地棉生長發(fā)育過程中扮演重要角色。 同時， 分析干旱脅迫處理下UDPGP基因在棉花根部的表達情況，發(fā)現(xiàn)GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在受干旱脅迫時上調(diào)表達且表達量較高（圖3B）， 推測GhUDPGP10和GhUDPGP26基因可能參與了棉花干旱脅迫響應(yīng)過程。

圖3 陸地棉UDPGP 基因的表達分析Fig. 3 Expression analysis of UDPGP genes in G. hirsutum

為進一步研究GhUDPGP10和GhUDPGP26基因的功能，對抗旱棉花品種KK1543 和干旱敏感型品種新陸早26 號分別進行了干旱脅迫處理。 利用qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，抗旱材料KK1543經(jīng)干旱處理后12 h，GhUDPGP10基因在根中顯著高表達，在葉和莖中表達量相對較低（圖4A）；干旱敏感型材料新陸早26 經(jīng)干旱脅迫后48 h，GhUDPGP10基因在葉中較高水平表達， 在根和莖中表達相對較低（圖4C）。 總體上，GhUDPGP26基因也表現(xiàn)出在抗旱材料根中高表達（圖4B），在干旱敏感型品種葉中高表達的模式（圖4D），推測GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在陸地棉不同部位發(fā)揮作用，可能通過不同的調(diào)控通路參與棉花抗旱響應(yīng)過程。

圖4 干旱脅迫下不同材料中GhUDPGP10 和GhUDPGP26 的表達分析Fig. 4 Expression analysis of GhUDPGP10 and GhUDPGP26 under drought stress in different cotton materials

3 討論

亞細胞定位預(yù)測顯示，陸地棉GhUDPGP 家族蛋白位于細胞質(zhì)或者細胞間隙， 這與賀望興等[25]、Muchut 等[26]的研究結(jié)果一致。 組織特異性表達分析顯示，31 個GhUDPGP基因在陸地棉根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托中呈現(xiàn)不同的表達模式， 表明UDPGP 作為植物體內(nèi)蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在植物不同部位發(fā)揮著不 同 的 作 用。 Park 等[27]將atugp1/atugp2雙 突 變后，花粉發(fā)育異常，導(dǎo)致雄性不育。 Chivasa 等[28]明確UGP1 是一種新型植物細胞死亡調(diào)節(jié)劑。Yi等[29]發(fā)現(xiàn)Ugp1 在釀酒酵母中可以調(diào)節(jié)各種碳水化合物的含量，進而影響蛋白激酶活性，從而參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持菌體長期存活。呂楠等[30]研究表明， 鐵皮石斛中DoUGPase1基因的表達水平與植株體內(nèi)多糖物質(zhì)的積累成正比，可促進植物的生長發(fā)育。

陸地棉UDPGP家族基因啟動子區(qū)含有多個逆境響應(yīng)調(diào)控元件，推測GhUDPGP基因在植物抵抗逆境脅迫的過程中也發(fā)揮重要作用。 自然光條件下，擬南芥受到冷脅迫和蔗糖處理，AtUGPase基因呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達趨勢[31]。 擬南芥中UGPase基因的表達能夠維持植物體內(nèi)營養(yǎng)狀態(tài)的穩(wěn)定，增強其對鹽脅迫的耐受性[32]。在受到干旱脅迫和鹽脅迫時， 青杄USP1基因通過增強植物的活性氧清除能力及抑制膜脂氧化損傷來提高植物對非生物脅迫的耐受性[33]。 胡楊中UGP1/UGP2基因的協(xié)同作用有助于促進胡楊的生長發(fā)育及提高對鹽脅迫的耐受能力[34]。最近，Liu 等[35]從76 個物種中鑒定了454 個UDPGP 蛋白，并通過表達譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)， 水稻UDPGP基因受茉莉酸、脫落酸、鎘和冷脅迫誘導(dǎo)。 以上研究均暗示UDPGP 可能在植物發(fā)育和逆境響應(yīng)中起重要作用。

本研究分析了GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在干旱脅迫條件下的表達特性， 發(fā)現(xiàn)GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在不同抗旱性棉花材料間的表達存在差異。 在15%PEG 6000脅迫處理條件下，GhUDPGP10基因主要在抗旱棉花材料的根中高表達，顯著高于其在莖和葉中的表達（干旱處理后3～24 h），但是在干旱敏感材料中葉中表達量較高；GhUDPGP26基因在抗旱材料的根部高表達，在干旱敏感型材料的葉片中表達上調(diào)，推測GhUDPGP10基因作為關(guān)鍵基因在棉花根部發(fā)揮重要作用，而GhUDPGP26基因在棉花葉片和根部均能發(fā)揮一定的功能，UDPGP基因可能通過不同的途徑參與了陸地棉對逆境脅迫的響應(yīng)， 但GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在棉花干旱脅迫響應(yīng)中的功能和作用機理仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過基因家族分析，在陸地棉中鑒定出31 個具有UGPDP 保守結(jié)構(gòu)域的家族成員，系統(tǒng)進化分析將其分為5 個亞族。 啟動子區(qū)順式作用元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)， 該家族基因含有響應(yīng)脫落酸、赤霉素、水楊酸等的順式作用元件，暗示該家族基因在干旱脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。 RNA-seq和表達分析表明，GhUDPGP10和GhUDPGP26可能作為主要基因參與棉花干旱脅迫響應(yīng)。 本研究為進一步解析棉花UDPGP基因的抗旱機理奠定基礎(chǔ)，為進一步提高棉花的逆境適應(yīng)性提供了潛在的基因資源。