菰黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系啟動子的篩選

卞加慧,胡映莉,湯近天,夏文強,葉子弘,張雅芬

(中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量與檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 310018)

黑粉菌(smut fungi)是黑粉菌目寄生真菌的總稱,因其孢子成熟時呈黑色粉末狀孢子而得名。黑粉菌是一類重要的植物病原菌,也是重要的資源真菌。對黑粉菌的研究主要包括其致病機理及其作為微生物資源的開發(fā)利用,如黑粉菌生活史及致病因子、次生代謝物的合成、生物催化酶的鑒定、在生物質(zhì)降解中的應(yīng)用、作為蛋白質(zhì)表達平臺，等等[1]。由于菌種的差異,特異性啟動子的篩選是開展上述分子機理研究及功能開發(fā)應(yīng)用的關(guān)鍵。

玉米黑粉菌(UstilagoMaydis)是玉米上的重要病原真菌,并且也是研究寄主-病原物互作關(guān)系的模式生物[2],其啟動子的研究比較深入。已發(fā)現(xiàn)啟動子Padi1和Pitp1非常適合于誘導(dǎo)基因表達以響應(yīng)氮素的限制,與衣康酸生產(chǎn)階段相結(jié)合,這有助于進一步提高玉米黑粉菌的有機酸產(chǎn)量[3]。在玉米黑粉菌中,匹配型基因的調(diào)控對于二態(tài)轉(zhuǎn)換和隨后的致病發(fā)展至關(guān)重要,啟動子Prf1的中心區(qū)域含兩個不同的磷酸化位點,并且根據(jù)其磷酸化狀態(tài),能夠激活不同交配型基因[4]。啟動子Pmig2～5活性依賴于多種作用元件,這可能為可能的轉(zhuǎn)錄激活因子的協(xié)同作用提供了一個平臺[5],劉芬利用Pmig2～5啟動znf9基因過表達,獲得znf9基因過表達玉米黑粉菌株,發(fā)現(xiàn)菌株的孢子形態(tài)發(fā)生改變,孢子的分裂增殖受到阻滯,推測znf9蛋白在細胞分裂過程中發(fā)揮一定的作用[6]。同源啟動子也可用于黑粉菌遺傳研究,顏梅新利用玉米黑粉菌啟動子Pgdp構(gòu)建了甘蔗鞭黑粉菌含GFP與RFP的雙色成像系統(tǒng)[7]。除此之外,異源啟動子也可用于構(gòu)建黑粉菌遺傳表達載體,Vijayakrishnapillai L等人利用異源啟動子Potef驅(qū)動Ptn1在玉米黑粉菌中過表達,發(fā)現(xiàn)其過表達對致病力沒有實質(zhì)性影響[8]。但真菌是一個高度多樣化的微生物種群,雖然存在不同類型的基因表達工具,但通常它們充其量只能在一個或幾個密切相關(guān)的物種中發(fā)揮作用,并且隨著新的宿主被引入研究和工業(yè)應(yīng)用,它們的內(nèi)源強啟動子往往是建立功能性基因表達系統(tǒng)的第一候選者[9]。隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)為我們研究啟動子提供了一個非常有價值的寶盒,可用來識別具有所需表達動力學(xué)的啟動子,從理論上講,這使得能夠建立量身定制的表達系統(tǒng)[10]。

菰黑粉菌(UstilagoesculentaP. Henn.)是黑粉菌屬專性寄生的二態(tài)性真菌,侵染菰(Zizanialatifolia)后,在菰莖部形成的可食用肉質(zhì)莖茭白[11],同時由于菌群分化,田間出現(xiàn)了肉質(zhì)莖白嫩可食用的“正常茭白”以及肉質(zhì)莖布滿褐色孢子的不可食用的“灰茭”[12-13]。茭白是我國重要水生蔬菜,分布廣泛,主要集中在長江中下游一帶的浙江、江蘇、上海、安徽等省,其中浙江省是全國茭白最大優(yōu)勢產(chǎn)區(qū),近幾年種植面積穩(wěn)定在2.7萬公頃左右,年產(chǎn)量約80萬噸[14]。目前,菰黑粉菌菌群的差異性及其對茭白表型的影響機制、菰黑粉菌與茭白植株互作機理等尚不明確,從而導(dǎo)致茭白的生產(chǎn)、品質(zhì)調(diào)控及育種等全靠經(jīng)驗指導(dǎo),出現(xiàn)了品種退化、產(chǎn)量不穩(wěn)定、品質(zhì)差異大等問題,因此對“茭白”產(chǎn)生過程中植株與菰黑粉菌互作的分子機制研究迫在眉睫。其中,一個高效的基因表達系統(tǒng)是有效地研究目標基因功能的基本保障。目前主要采用的是異源啟動子Potef構(gòu)建的表達系統(tǒng)[15],雖然其驅(qū)動的eGFP能夠在菰黑粉菌菌株內(nèi)正常表達,但表達量不高,熒光信號不穩(wěn)定,因此需要篩選出一個高效穩(wěn)定表達的內(nèi)源強啟動子,為菰黑粉菌功能性基因研究及其與茭白互作機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

供試菌株:栽培茭白品種“龍茭2號”的灰茭中分離的性親和單倍體菌株UeT55(a2b2 CCTCC AF 2015015),由本課題組分離,保藏[16],在YEPS培養(yǎng)基(酵母抽提物1%、蛋白胨2%、蔗糖2%、pH自然)中28 ℃進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化菌株在山梨醇再生培養(yǎng)基(酵母抽提物1%、蛋白胨0.4%、蔗糖0.4%、山梨醇18.22%、5 μg/mL萎銹靈)上進行篩選。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α(TaKaRa,日本),在LB培養(yǎng)基(酵母抽提物0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉1%、pH自然)中37 ℃進行培養(yǎng)。若上述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基,則另外加入瓊脂1.5%。載體質(zhì)粒:實驗室前期改造的沒有核定位序列的pUMa932-eGFP質(zhì)粒,含有(Amp抗性);萎銹靈(Cbx抗性);eGFP綠色熒光蛋白報告基因(由德國杜塞爾多夫大學(xué)惠贈)[17]。

1.1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、KpnⅠ、NcoI、PvuI(NEB);ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit(C112-01,Vazyme,南京);Max Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1,Vazyme,南京);柱式真菌RNA抽提純化試劑盒(Sangon Biotech,上海);HiPure Plasmid EF Mini Kit去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量中提試劑盒(Magen,上海);HiPureGel Pure DNA Kits凝膠DNA小量回收試劑盒(Magen,上海);HiScript?IIQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R223-01,Vazyme,南京);ChamQ SYBR qPCR Master Mix(q711,Vazyme,南京)。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

提取菰黑粉菌UeT55 DNA作為模板,設(shè)計特異性引物,并在各連接片段的5′端與3′端加20 bp同源臂(表1),進行不同長度啟動子的靶標基因擴增。PCR采用50 μL反應(yīng)體系,包括引物F/R(10 μmol)各自1 μL,2×Phanta Max Buffera25 μL,dNTP Mix(10 mmol each)模板DNA 100 ng,1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase,加ddH2O補齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 15 s,退火15 s,延伸72 ℃ 30 kb·min-1,35個循環(huán);徹底延伸72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,呈現(xiàn)單一條帶,用HiPure Gel Pure DNA Kits凝膠DNA小量回收試劑盒清潔回收,回收產(chǎn)物待用。

表1 載體構(gòu)建和基因表達引物及其序列Table 1 Primer sequences for plasmid construction and gene expression

使用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI與KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒pUMa932-eGFP,切除原有啟動子Potef,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,使用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit凝膠DNA小量回收試劑盒對酶切后的大片段進行回收。

使用ClonExpress II One Step Cloning Kit C112無縫連接克隆試劑盒將獲得的不同啟動子目標條帶與酶切后的載體大片段進行連接(圖1)。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細胞中,在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子,陽性轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng),并用特異性通用引物pUe-F/pUe-R(表1)對質(zhì)粒進行菌液PCR驗證,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果無誤的質(zhì)粒送測序公司測序,由此獲得菰黑粉菌轉(zhuǎn)化表達載體pUe-hsp-egfp、pUe-ef-egfp,pUe-cox12-egfp、pUe-mdh1-egfp、pUe-mix17-egfp、pUe-eno-egfp、pUe-qcr8-egfp、pUe-mia40-egfp、pUe-sti1-egfp、pUe-odc2-egfp。

圖1 載體構(gòu)建示意圖Figure 1 Schematic diagram of plasmid construction

對構(gòu)好的菰黑粉菌轉(zhuǎn)化表達載體以及pUMa932-eGFP質(zhì)粒進行單酶切線性化,除pUe-hsp-egfp使用NdeI,其余載體均使用PvuI進行單酶切,酶切產(chǎn)物純化回收,回收片段通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)進菌株UeT55的原生質(zhì)體,涂布于含5 μg/mL萎銹靈的再生培養(yǎng)基上,將其置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后,挑取轉(zhuǎn)化子后在含5 μg/mL萎銹靈的YEPS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),然后在熒光顯微鏡下觀察eGFP綠色熒光蛋白是否表達,篩選獲得轉(zhuǎn)化子[15],挑取轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下觀察熒光進行篩選,鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.2eGFP基因的熒光定量PCR檢測

用柱式真菌RNA抽提純化試劑盒提取陽性轉(zhuǎn)化子總RNA,用PrimeScriptTM 1 st Strand cDNASynthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到樣品的cDNA。使用Clone Manager設(shè)計eGFP熒光定量引物Qegfp-F/R,以β-actin為內(nèi)參[18],利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行檢測,測定基因表達。熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照[19],每個樣品設(shè)置三個重復(fù)。相對基因表達量采用2-ΔΔCt的方法[20]計算,并使用相關(guān)軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3eGFP熒光強度評價

挑取陽性轉(zhuǎn)化子單菌落于20 mL YEPS液體培養(yǎng)基,28 ℃,180 r/min小搖24 h,按照1∶100的比例吸取500 μL小搖菌液至50 mL YEPS液體培養(yǎng)基,28 ℃,180 r/min擴搖12 h[21],吸取5 μL陽性轉(zhuǎn)化子擴搖產(chǎn)物于載玻片上,利用熒光顯微Leica DM6 B,在白光和熒光雙通道固定拍照參數(shù)條件下進行拍照,每個陽性轉(zhuǎn)化子隨機拍三張圖,利用Image J軟件打開圖片進行分析,計算每個細胞的熒光強度[22]。

2 結(jié)果

2.1 啟動子基因片段的獲得

根據(jù)實驗室前期對T型菌株融合及侵染過程的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,通過基因組比對后的序列文件進行轉(zhuǎn)錄本定量,使用每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片即FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)為基因表達的標準,對基因進行定量分析?；赗NA-Seq的轉(zhuǎn)錄水平FPKM值,T型菌融合0 h、24 h、36 h、48 h、60 h 5個時間點基因的FPKM,以及T型菌侵染茭白植株1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 5個時間點莖尖內(nèi)菰黑粉菌基因的FPKM,結(jié)合真核生物啟動子數(shù)據(jù)庫(EPD)中已報道的啟動子進行篩選,篩選10個啟動子作為研究對象(表2),包括Phsp、Pef、Pcox12、Pmdh1、Pmix17、Peno、Pqcr8、Pmia40、Psti1、Podc2。

表2 根據(jù)FPKM值篩選的高強度啟動子基因Table 2 High intensity promoter genes screened according to FPKM value

其中Phsp(hsp70編碼熱休克蛋白70),Pef(ef1α編碼延伸因子1-α)的FPKM均值較高,為高表達基因,Pcox12(cox12編碼細胞色素c氧化酶Ⅵ b亞基),Pmdh1(mdh1編碼線粒體蘋果酸脫氫酶),Pmix17(mix17編碼線粒體膜間隙蛋白),Peno(eno編碼烯醇化酶),Pqcr8(qcr8編碼泛醇細胞色素c還原亞基8),Pmia40(mia40編碼線粒體氧化還原酶),Psti1(sti1編碼Hsp90輔助伴侶),Podc2(odc2編碼線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白)。所選取的10個啟動子大多數(shù)是管家基因,參UeT55基因組的序列信息,并使用真核生物基因預(yù)測軟件FGENESH(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh & group=programs & subgroup=gfind),選擇Ustilago(smuts)作為基因組特異性參數(shù),對基因結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,確定挑選的10個基因的啟動子片段區(qū)域。

選取10個啟動子長度分別為928 bp(Phsp)、1 314 bp(Pef)、350 bp(Pcox12)、397 bp(Pmdh1)、445 bp(Pmix17)、507 bp(Pqcr8)、666 bp(Pmia40)、644 bp(Psti1)、338 bp(Podc2)。根據(jù)(表1)各啟動子特異性引物擴增出10個啟動子,通過凝膠電泳檢測,各啟動子片段長度與預(yù)期相符(圖2)。后續(xù)構(gòu)建菰黑粉菌轉(zhuǎn)化表達載體,經(jīng)測序驗證,啟動子片段測序結(jié)果與原序列一致。

圖2 啟動子基因片段擴增Figure 2 Amplification fragments of promoters

注: —正義鏈上CAAT-box; —反義鏈上CAAT-box; —正義鏈上TATA-box; —反義鏈上TATA-box圖3 啟動子序列元件特征Figure 3 Characterization of promoter sequences and elements

2.2 啟動子序列與元件分析

在真核生物啟動子元件中,TATA-box是RNA聚合酶結(jié)合處之一,與取向無關(guān),幫助RNA聚合酶識別啟動子,與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān);CAAT-box控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率,正反取向都能發(fā)揮作用。通過啟動子在線分析軟件PlantCARE(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),對擴增獲得的啟動子序列中作用元件TATA-box和CAAT-box進行分析。結(jié)果如圖3:在啟動子Phsp中存在7個CAAT-box和1個TATA-box;在啟動子Pef中存在15個CAAT-box;在啟動子Pcox12中存在5個CAAT-box;在啟動子Pmdh1中存在3個CAAT-box,1 TATA-box;在啟動子Pmix17中存在6個CAAT-box;在啟動子Peno中存在1個CAAT-box,1個TATA-box;在啟動子Pqcr8中存在5個CAAT-box,1 TATA-box;在啟動子Pmia40中存在4個CAAT-box,2個TATA-box;在啟動子Psti1中存在4個CAAT-box,1 TATA-box;在啟動子Podc2中存在5個CAAT-box。

2.3 菰黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,在含有cbx抗生素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子,然后在熒光顯微鏡下觀察eGFP的熒光蛋白是否表達,篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。成功獲得UeT55-Potef-eGFP,UeT55-Phsp-eGFP,UeT55-Pef-eGFP,UeT55-Pcox12-eGFP,UeT55-Pmdh1-eGFP,UeT55-Pmix17-eGFP,UeT55-Peno-eGFP,UeT55-Pqcr8-eGFP,UeT55-Pmia40-eGFP,UeT55-Psti1-eGFP,UeT55-Podc2-eGFP轉(zhuǎn)化菌株各5株,將獲得的轉(zhuǎn)化菌株在不含萎銹靈的YEPS固體培養(yǎng)基上連續(xù)繼代5次,再轉(zhuǎn)接至含有5 μg/mL萎銹靈的YEPS固體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)48 h后,轉(zhuǎn)化菌株仍能正常生長,保持了和野生型UeT55相似的菌落形態(tài),熒光觀察穩(wěn)定(圖4),說明插入到菰黑粉菌基因組中的各啟動子與eGFP基因均能夠穩(wěn)定遺傳。

2.4 不同啟動子驅(qū)動eGFP基因表達水平

以UeT55中β-actin作為內(nèi)參基因,通過熒光定量PCR來檢測eGFP基因的表達量。并使用SAS軟件進行數(shù)據(jù)分析,采用單因素方差分析分析數(shù)據(jù),不同字母表示不同啟動子驅(qū)動eGFP表達能力存在顯著性差異(p<0.05)。結(jié)果如圖5所示,啟動子Phsp,Pef,Pcox12驅(qū)動eGFP基因表達能力顯著高于外源啟動子Potef,分別高于對照9倍,5倍,2倍以上,啟動子Pmdh1、Pmix17、Peno、Pqcr8驅(qū)動eGFP基因表達能力與外源Potef無顯著差異,而啟動子Pmia40、Psti1、Podc2驅(qū)動eGFP基因表達能力顯著低于Potef。

注:Bright:白光通道下拍攝;Green:綠色熒光通道下拍攝;Merged:所有通道重疊,Bar=49.4 μm圖4 11個啟動子驅(qū)動eGFP在UeT55菌株內(nèi)表達的熒光觀測Figure 4 Fluorescence observation of eleven promoters driving eGFP expression in UeT55

注:圖中誤差線表示標準誤差,不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同。圖5 各啟動子控制的eGFP基因表達水平Figure 5 Expression levels of eGFP gene controlled by each promoter

2.5 轉(zhuǎn)化子菌體的熒光檢測

使用熒光顯微鏡對陽性轉(zhuǎn)化子進行拍照,利用Image J測量每個轉(zhuǎn)化子細胞平均熒光強度,結(jié)果如圖6所示,結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果一致,啟動子Phsp,Pef,Pcox12驅(qū)動eGFP基因表達熒光強度顯著高于外源啟動子Potef,分別高于對照6倍,4倍,1.5倍以上,Phsp啟動子驅(qū)動表達的eGFP的熒光強度范圍是36.79～42.14,平均強度為39.73;Pef啟動子驅(qū)動表達的eGFP熒光強度范圍是23.67～27.98,平均強度為25.14;Pcox12啟動子驅(qū)動表達的eGFP的熒光強度范圍是11.07～14.22,平均強度為12.16;異源啟動子Potef啟動子驅(qū)動表達eGFP熒光強度范圍是4.12～8.15,平均強度為6.15;啟動子Pmdh1、Pmix17、Peno、Pqcr8驅(qū)動eGFP基因表達熒光強度與外源Potef無顯著差異,而啟動子Pmia40、Psti1、Podc2驅(qū)動eGFP基因表達熒光強度顯著低于Potef。

圖6 各啟動子驅(qū)動eGFP表達的熒光強度Figure 6 Fluorescence intensity of eGFP expression driven by each promoter

3 討 論

近年來對黑粉菌的研究側(cè)重于基礎(chǔ)研究與應(yīng)用科學(xué)相結(jié)合,為未來的生物技術(shù)應(yīng)用提供了堅實的理論基礎(chǔ)。隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展,和越來越多黑粉菌測序工作的完成,2006年完成玉米黑粉菌測序[23],2010年完成玉米絲孢堆黑粉菌測序[24],2012年完成大麥堅黑粉菌測序[25],2014年完成甘蔗鞭黑粉菌測序等[26]。并逐漸開始基因組數(shù)據(jù)挖掘和比對基因組學(xué)研究,對黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的研究也更深入[27],為后續(xù)基因功能基礎(chǔ)研究奠定了重要的基礎(chǔ)。啟動子是控制基因轉(zhuǎn)錄的重要元件,是功能基因正常表達的重要前提,使用合適的啟動子是提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵,是建立高效穩(wěn)定分子轉(zhuǎn)化體系過程中的關(guān)鍵組成部分。

在前期研究中,我們利用異源啟動子Potef構(gòu)建菰黑粉菌遺傳表達體系,雖然能夠啟動基因表達,但其啟動能力一般,遺傳效率低,遺傳穩(wěn)定性不高。目前,國內(nèi)外有關(guān)菰黑粉菌啟動子的研究未見報道,因此,菰黑粉菌啟動子的研究十分必要?；赗NA-seq結(jié)果,使用FPKM可以系統(tǒng)的定量基因的表達水平,近年來已被用于系統(tǒng)篩選強啟動子元件[28-29]。胡于東從工業(yè)菌株G.oxydansWSH-003全基因組水平上進行篩選,得到一系列梯度強度組成型啟動子[30]。2017年本課題組完成對菰黑粉菌整個基因組的測序,并對該真菌及其宿主的轉(zhuǎn)錄本進行測序和分析[31]。后續(xù),我們課題組對菰黑粉菌生活史的多個時間點進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,可以反映每個基因不同時期的轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄模式,從而可以幫助篩選各類所需的啟動子元件。本研究基于以上基礎(chǔ),篩選出10個啟動子,以pUMa932為基礎(chǔ)載體,將啟動子Potef替換成篩選出的10個啟動子構(gòu)建相關(guān)載體,通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化構(gòu)建UeT55表達eGFP菌株,基于qRT-PCR和Image J分析結(jié)果,進一步篩選出三個內(nèi)源強啟動子,Phsp、Pef、Pcox12驅(qū)動eGFP表達能力和穩(wěn)定性均高于異源啟動子Potef,意味著菰黑粉菌的內(nèi)源啟動子具有巨大的開發(fā)潛力。其中Phsp啟動能力最強,遺傳轉(zhuǎn)化效率最高,易于操作,適用于后期基因功能研究,也為后期菰黑粉菌高效表達外源蛋白提供了可能性。

4 結(jié) 論

本研究得到的菰黑粉菌內(nèi)源啟動子Phsp,Pef,Pcox12表達能力強,表達穩(wěn)定,具有較好的應(yīng)用前景,從而豐富了菰黑粉菌內(nèi)源啟動子研究。其中利用Phsp啟動子構(gòu)建的遺傳表達載體,表達能力最強,穩(wěn)定性最高,插入的eGFP能夠穩(wěn)定遺傳,適用于后期的基因功能分析研究。