miR-181a調(diào)控sirt1對缺氧條件下大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

陸明佳 王成鳳 景燕 仲婷 李紅燕

缺血性中風(fēng)是由大腦血流供應(yīng)減少導(dǎo)致氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)不足，引起血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞，從而導(dǎo)致腦組織壞死的一類疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率，且預(yù)后較差，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。盡管在醫(yī)學(xué)和血管內(nèi)再通方面取得了進(jìn)展，但缺血性中風(fēng)的治療選擇仍然非常有限[2]。因此，迫切需要深入了解其發(fā)病機(jī)制，尋找新穎有效的治療方法。已知許多機(jī)制與缺血性中風(fēng)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。而由缺血/再灌注損傷引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)死亡是BBB破壞的初始階段，可導(dǎo)致缺血性中風(fēng)患者的不良預(yù)后[3]。miRNA已被證明在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如中風(fēng)和腦外傷)中起作用[4,5]。miR-181a是miR-181家族中的一個(gè)成員，神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達(dá)，與海突觸可塑性[6]、血管生成[7]、腫瘤轉(zhuǎn)移[8]等有密切關(guān)系。近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在腦缺血組織中過表達(dá)，可以促進(jìn)腦組織細(xì)胞凋亡和炎癥的發(fā)生，加重神經(jīng)損傷[9,10]。Qi等[11]發(fā)現(xiàn)在缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中，下調(diào)miR-181a的表達(dá)，可上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence information regulator 1,SIRT1)的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，并增加SOD水平。但是，在缺氧誘導(dǎo)的BMEC中，miR-181a的作用仍然未知。SIRT1在抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，并且是miR-181a的靶基因[12,13]。因此，本研究以缺氧誘導(dǎo)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rBMECs)為對象，探究miR-181a對rBMECs增殖、凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rBMECs)由上海晅科生物科技有限公司從大鼠腦中分離、培養(yǎng)并提供；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、IMEM(無酚紅)培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Gbico公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(FITC-Dextran)購自美國Sigma-Aldrich；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；miR-181a inhibitor和miR-181a inhibitor陰性對照(NC inhibitor)、si-SIRT1和si-NC以及PCR引物序列由上海GenePharma公司設(shè)計(jì)合成；MTT試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)均購自碧云天生物科技公司；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)活性氧(ROS)檢測試劑盒(CA1410-500)購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(WST-1法)(A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(TBA法)(A003-1-2)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)測定試劑盒(微板法)(A006-2-1)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Transwell小室(美國Corning公司，批號3413)；TRIzol RNA分離試劑、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購自日本TaKaRa公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific；兔抗血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(VE-cadherin)(ab231227)、SIRT1(ab189494)、Bcl-2(ab196495)、Bax(ab32503)、Caspase-3(ab184787)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)均購自英國abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；ABI Prism 7300型熒光定量PCR系統(tǒng)(美國)；倒置熒光顯微鏡(IX73，購自日本Olympus公司)；iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto II)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與模型制備:將rBMECs接種于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，在細(xì)胞達(dá)到指數(shù)增長期時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染:將對數(shù)生長期的rBMECs分為6個(gè)處理組：①對照組：正常培養(yǎng)的rBMECs；②模型組：將rBMECs于厭氧培養(yǎng)箱(95%N2、5%CO2)中培養(yǎng)12 h[14,15]；③NC inhibitor組：用Lipofectamine 2000將50 nmol/L miR-181a inhibitor陰性對照(NC)轉(zhuǎn)染rBMECs，轉(zhuǎn)染24 h后，于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；④miR-181a inhibitor組：用Lipofectamine 2000將50 nmol/L miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染rBMECs，轉(zhuǎn)染24 h后，于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；⑤miR-181a inhibitor+si-NC組：將miR-181a inhibitor和si-NC共轉(zhuǎn)染rBMECs，再于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；⑥miR-181a inhibitor+si-SIRT1組：將miR-181a inhibitor和si-SIRT1共轉(zhuǎn)染rBMECs，再于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。隨后在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 RT-qPCR檢測細(xì)胞中miR-181a和SIRT1 mRNA的表達(dá):培養(yǎng)48 h后，使用TRIzol從培養(yǎng)的rBMECs細(xì)胞中提取總RNA，按照試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μl)：cDNA(200 ng/μl)2 μl，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，上下游引物各0.4 μl，ddH2O 7.2 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，75℃延伸20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用U6或β-actin作為對照，相對miR-181a和SIRT1 mRNA的表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活力:取對數(shù)期生長的rBMECs，以1×104細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔板中，將細(xì)胞按照1.2.2項(xiàng)下步驟進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48 h 后，每孔中加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去上層清液后加入150 μl的DMSO，490 nm波長處測定各孔吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。以培養(yǎng)基為空白孔調(diào)零。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:取對數(shù)期生長的rBMECs，按照1.2.2項(xiàng)下步驟進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48 h后，將rBMECs用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，離心，去除上清液，PBS洗滌后將細(xì)胞以1×106/ml的密度重懸，加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI避光孵育15 min，按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書步驟，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 細(xì)胞屏障功能檢測:將1.2.2中6組rBMECs以1×105細(xì)胞/cm2的密度和37℃的溫度接種到培養(yǎng)箱中的Transwell小室中。進(jìn)行低氧處理后，除去原始培養(yǎng)基，將100 μl含有FITC-Dextran(1 mg/ml)的無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基添加到上室中，下室加入500 μl 不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，從下室中取出100 μl液體，酶標(biāo)儀在494 nm激發(fā)波長、520 nm發(fā)射波長下檢測熒光強(qiáng)度。用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配置不同濃度的FITC-dextran，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算透過Transwell小室的FITC-Dextran的濃度(μg/ml)；FITC-Dextran濃度越大，表示rBMECs屏障功能越弱。

1.2.7 熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平:取對數(shù)期生長的rBMECs，按照1.2.2項(xiàng)下步驟進(jìn)行分組及處理，rBMECs用PBS洗滌3次，與10 mmol/L的DCFH-DA于37℃避光孵育30 min。然后使用酶標(biāo)儀分別在488和525 nm的激發(fā)和發(fā)射波長下檢測二氯熒光素(DCF)熒光。ROS的水平通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度來確定。

1.2.8 生化法檢測SOD活性、MDA和GSH水平:按照1.2.2項(xiàng)下步驟進(jìn)行分組和處理rBMECs，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書的操作檢測SOD活性、MDA和GSH水平。

1.2.9 Western blot檢測SIRT1和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá):使用RIPA裂解液提取rBMECs中蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣(30 μg/泳道)，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(VE-cadherin、SIRT1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin按1∶1 000的比例稀釋)，4℃下孵育過夜，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的條帶的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 6組rBMECs中miR-181a和SIRT1 mRNA的表達(dá) 與對照組相比，模型組rBMECs中miR-181a的表達(dá)顯著升高，SIRT1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，miR-181a inhibitor組和miR-181a inhibitor+si-NC組細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)明顯降低，SIRT1 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與miR-181a inhibitor組相比，miR-181a inhibitor+si-SIRT1組細(xì)胞中SIRT1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 6組細(xì)胞中miR-181a和SIRT1 mRNA的表達(dá)

2.2 6組rBMECs增殖能力比較 與對照組比較，模型組rBMECs增殖率顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，miR-181a inhibitor組和miR-181a inhibitor+si-NC組細(xì)胞增殖率明顯升高(P<0.05)；與miR-181a inhibitor組比較，miR-181a inhibitor+si-SIRT1組細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 6組rBMECs的增殖率比較

2.3 6組rBMECs凋亡比較 與對照組比較，模型組rBMECs凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，miR-181a inhibitor組和miR-181a inhibitor+si-NC組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與miR-181a inhibitor組比較，miR-181a inhibitor+si-SIRT1組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 6組rBMECs的凋亡率比較

圖1 6組rBMECs的凋亡情況；A 對照組；B 模型組；C NC inhibitor組；D miR-181a inhibitor組；E miR-181a inhibitor+si-NC組；F miR-181a inhibitor+si-SIRT1組

2.4 6組rBMECs屏障功能比較 與對照組比較，模型組透過rBMECs的FITC-Dextran的濃度顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，miR-181a inhibitor組和miR-181a inhibitor+si-NC組FITC-Dextran濃度明顯降低(P<0.05)；與miR-181a inhibitor組比較，miR-181a inhibitor+si-SIRT1組FITC-Dextran濃度明顯升高(P<0.05)。見表5。

表5 6組透過rBMECs的FITC-Dextran濃度比較

2.5 6組rBMECs內(nèi)VE-cadherin、SIRT1和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 與對照組比較，模型組rBMECs內(nèi)VE-cadherin、SIRT1、Bcl-2表達(dá)顯著降低，Bax、Caspase-3的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，miR-181a inhibitor組和miR-181a inhibitor+si-NC組細(xì)胞內(nèi)VE-cadherin、SIRT1、Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax、Caspase-3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與miR-181a inhibitor組比較，miR-181a inhibitor+si-SIRT1組Bax、Caspase-3表達(dá)明顯升高，VE-cadherin、SIRT1、Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖2，表6。

圖2 6組VE-cadherin、SIRT1和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；A 對照組；B 模型組；C NC inhibitor組；D miR-181a inhibitor組；E miR-181a inhibitor+si-NC組；F miR-181a inhibitor+si-SIRT1組

表6 6組rBMECs內(nèi)VE-cadherin、SIRT1和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.6 6組rBMECs內(nèi)ROS及SOD、MDA、GSH水平 與對照組比較，模型組rBMECs內(nèi)ROS、MDA水平顯著升高，SOD、GSH水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-181a inhibitor組和miR-181a inhibitor+si-NC組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平明顯降低，SOD、GSH水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-181a inhibitor組比較，miR-181a inhibitor+si-SIRT1組ROS、MDA水平明顯升高，SOD、GSH水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7，圖3。

表7 6組rBMECs內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

圖3 6組ROS生成量(熒光探針法×400)；A 對照組；B 模型組；C NC inhibitor組；D miR-181a inhibitor組；E miR-181a inhibitor+si-NC組；F miR-181a inhibitor+si-SIRT1組

3 討論

BBB完整性是中樞神經(jīng)系統(tǒng)動態(tài)平衡的重要元素之一。BMECs是腦微血管的主要組成部分，也是構(gòu)成BBB的主要元素，維持健康的BMECs對維持BBB的完整性和腦穩(wěn)態(tài)起主要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)在缺血性中風(fēng)期間，BMECs的凋亡增加，BBB被破壞，是缺血性中風(fēng)早期死亡的主要原因[17]。本項(xiàng)研究中，我們成功建立了由缺氧誘導(dǎo)的rBMECs模型，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞增殖減少，氧化應(yīng)激增加和細(xì)胞屏障功能障礙(FITC-Dextran濃度增加、VE-cadherin表達(dá)下降)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)rBMECs凋亡的增加伴隨著miR-181a的顯著上調(diào)；而下調(diào)miR-181a的表達(dá)有助于促進(jìn)rBMECs增殖，減少細(xì)胞凋亡，保持細(xì)胞屏障功能的完整。但其作用機(jī)制尚不清楚。

氧化應(yīng)激是缺血性中風(fēng)的重要事件，氧化應(yīng)激的特征在于ROS產(chǎn)生和抗氧化應(yīng)激之間的不平衡[18]。在缺血性中風(fēng)后，ROS的迅速增加使抗氧化防御能力不堪重負(fù)，這些ROS可以破壞細(xì)胞大分子，導(dǎo)致自噬、細(xì)胞凋亡和壞死。先前的研究表明，ROS是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損和隨后的內(nèi)皮功能障礙的關(guān)鍵因素[19]。因此，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致rBMECs凋亡的重要因素。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-181a的表達(dá)可以通過降低ROS和MDA水平并提高抗氧化劑(SOD和GSH)來減輕氧化應(yīng)激；提示下調(diào)miR-181a的表達(dá)可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)在miR-181a表達(dá)下調(diào)的同時(shí)SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)增加。SIRT1是NAD+依賴性脫乙?；?，已被證明是miR-181a的靶基因，在細(xì)胞分化、凋亡、氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用；研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有潛在的抗氧化應(yīng)激活性[20]；SIRT1的激活可減輕老年BMECs的氧化應(yīng)激并恢復(fù)血管生成能力[21]。體外和體內(nèi)研究表明在腦缺血/再灌注大鼠和氧糖剝奪(OGD)誘導(dǎo)人BMECs的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激中，激活SIRT1，可降低ROS的產(chǎn)生和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，增加抗氧化酶(SOD、GSH)的水平，對海馬神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[22,23]。Kong等[24]發(fā)現(xiàn)抑制miR-181a可上調(diào)SIRT1，減少神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)海馬免受癲癇病侵襲。本研究同樣顯示轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，miR-181a的表達(dá)下調(diào)，而SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)增加，且Bcl-2表達(dá)增加，Bax、Caspase-3表達(dá)、rBMECs凋亡明顯降低；為了進(jìn)一步明確miR-181a/SIRT1對rBMECs增殖、凋亡的影響，本研究將si-SIRT1與miR-181a inhibitor共轉(zhuǎn)染至rBMECs，結(jié)果顯示干擾SIRT1的表達(dá)能明顯逆轉(zhuǎn)miR-181a inhibitor對缺氧誘導(dǎo)的rBMECs增殖、凋亡的作用；提示下調(diào)miR-181a的表達(dá)可通過上調(diào)Sirt1的表達(dá)，進(jìn)而抑制缺氧誘導(dǎo)的rBMECs凋亡并促進(jìn)rBMECs增殖。

綜上所述，下調(diào)miR-181a的表達(dá)可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的rBMECs增殖、抑制rBMECs凋亡；其作用機(jī)制可能與與上調(diào)SIRT1的表達(dá)有關(guān)。此外本研究僅從體外細(xì)胞水平上進(jìn)行了初步探究，尚需要進(jìn)行體內(nèi)動物研究進(jìn)一步明確miR-181a對缺血性中風(fēng)的影響。