小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化

楊群，肖文濤，李韋

九江市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心藥品分中心，江西 九江 332000

小兒咳喘靈顆粒配方源自經(jīng)典名方-麻杏石甘湯，是由張仲景所創(chuàng)，由七味藥材組成，分別是金銀花、麻黃、板藍(lán)根、甘草、瓜蔞等，味甜、辛、微苦，能夠清宣肺熱、止咳祛痰［1］，多用于治療上呼吸道感染引發(fā)的咳嗽，能夠有效改善支氣管炎、肺炎、哮喘患兒的肺功能及臨床癥狀［2-6］，主要不良反應(yīng)為嘔吐及腹瀉［7］。市售小兒咳喘靈顆粒的質(zhì)量一致性相對(duì)較差［8］，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究有利于提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制。目前小兒咳喘靈顆粒有批準(zhǔn)文號(hào)100 多個(gè)，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)有部頒標(biāo)準(zhǔn)及不同企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，存在不同程度內(nèi)容不完善、指標(biāo)不合理、限度差異大等情況［8-11］。對(duì)小兒咳喘靈配方進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，方中麻黃為君藥，能夠宣肺、平喘、散寒［8,12］。麻黃堿是小兒咳喘靈制劑里面有明確藥效的一種主要成分，量化控制較好。金銀花味甘、性寒，能夠消炎、清熱、解毒，可治熱毒血痢，感染性疾病，其活性成分為綠原酸［13-16］。甘草味甘、性平，能夠補(bǔ)脾、祛痰、益氣、止痛，可治脾胃虛弱，心悸氣短［17-18］。瓜蔞在此前小兒咳喘靈顆粒的研究中未見報(bào)道。故本研究對(duì)瓜蔞、甘草進(jìn)行薄層色譜鑒別研究，并采用高效液相色譜同時(shí)測定麻黃中鹽酸麻黃堿和金銀花中綠原酸含量，為進(jìn)一步制定和完善小兒咳喘靈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀［沃特世公司E2695，帶紫外檢測器（沃特世公司2489）］；電子天平（賽多利斯公司BSA 124S、BP 211D）；超聲波清洗機(jī)（上海藝源超聲設(shè)備有限公司YIY-UL300W-C）；薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司TLC Visualizer）。

1.2 對(duì)照品

鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-201007,含量以99.7%計(jì)）；綠原酸（批號(hào)：110753-201716，含量以98.0%計(jì)）；甘草苷（批號(hào)：111610-201106）；甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-201620）；瓜蔞對(duì)照藥材（批號(hào)：121596-201903）。均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 樣品

小兒咳喘靈顆粒［葵花藥業(yè)集團(tuán)（襄陽）隆中有限公司，批號(hào)：191103，191204，191206］。

1.4 試劑

硅膠G（德國默克公司，批號(hào)：1056260001）；薄層色譜板（德國默克公司）；乙腈（色譜純）；水為超純水；石油醚、乙酸乙酯、甲酸、冰醋酸、正丁醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 瓜蔞的薄層鑒別分別取樣品各2 g 于50 mL離心管中，加入40 mL 甲醇，混勻，超聲處理20 min，收集濾液，蒸干后加20 mL 水復(fù)溶，提取復(fù)溶液時(shí)分4 次加入40 mL 正丁醇，收集正丁醇液、蒸干得殘?jiān)?，再? mL 正丁醇溶解得供試品溶液。取瓜蔞對(duì)照藥材，相同方法制成對(duì)照藥材溶液。使用不含瓜蔞的模擬處方制成不含瓜蔞的空白樣品，取空白樣品，相同方法制成陰性樣品對(duì)照溶液。吸取5 μL 供試品、對(duì)照藥材、陰性樣品對(duì)照溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，展開劑為甲酸：乙酸乙酯：石油醚（60～90 ℃）（0.1∶1∶4），先展開條帶，再取出，將展開后的薄層板晾干，均勻噴上10%的硫酸乙醇，加熱顯色至明晰（105 ℃），于365 nm 波長的紫外光燈下進(jìn)行比對(duì)。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖1。

圖1 瓜蔞鑒別圖譜

2.1.2 甘草的薄層鑒別分別取樣品各2 g于回流瓶中，加入40 mL 甲醇，混勻，加熱回流30 min，濾過，收集濾液，蒸干后加20 mL 水復(fù)溶，提取復(fù)溶液時(shí)，分3 次加入60 mL 正丁醇，收集合并提取液，用20 mL水洗滌3 次，蒸干正丁醇液，得殘?jiān)?，再? mL 甲醇溶解得供試品溶液。取0.5 g 甘草對(duì)照藥材于回流瓶中，相同方法制得對(duì)照藥材溶液。取甘草苷對(duì)照品，加甲醇溶解稀釋得1 mg/mL 甘草苷對(duì)照品溶液。使用不含甘草的模擬處方制成不含甘草的空白樣品，取空白樣品，相同方法制成陰性樣品對(duì)照液。吸取2 μL上述六種溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板（1%氫氧化鈉溶液制成）上，展開劑為乙酸乙酯∶水∶冰醋酸∶甲酸（15∶2∶1∶1），先展開條帶，再取出，將展開后的薄層板晾干，均勻噴上10%的硫酸乙醇，加熱顯色至明晰（105 ℃），于365 nm 波長的紫外光燈下進(jìn)行比對(duì)。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖2。

圖2 甘草及甘草苷鑒別圖譜

2.2 含量測定

2.2.1 高效液相法色譜條件色譜柱：Venusil MP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，見表1；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～15 min，207 nm；15～25 min，327 nm；25～40 min，207 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.2.2 對(duì)照品制備精密稱取15.79 mg 鹽酸麻黃堿對(duì)照品，置25 mL 的容量瓶中，超聲15 min，加甲醇定容，得629.7 μg/mL 的鹽酸麻黃堿儲(chǔ)備液。精密稱取綠原酸對(duì)照品9.32 mg，置25 mL 的容量瓶中，超聲15 min，加甲醇定容，得365.3 μg/mL 的綠原酸儲(chǔ)備液。

2.2.3 樣品制備取樣品研細(xì)，精密稱取2 g，加入甲醇25 mL，稱重，超聲20 min（功率300 W，頻率25 kHz），放冷后再次稱重，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，先搖勻，再濾過，然后取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

按照顆粒處方比例和制備工藝制備出缺麻黃和金銀花的陰性對(duì)照制劑，同樣使用“樣品制備”的方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察取綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入適量甲醇稀釋，制得1mL 中含18.3、36.6、73.2、183.0、366.0 μg 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以其質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：回歸方程Y=21 084.595 2X+28.329 1，相關(guān)系數(shù)為0.999，說明綠原酸在18.3～366.0 μg/mL 范圍內(nèi)符合線性要求。

取鹽酸麻黃堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入適量甲醇稀釋，制得1 mL 中含6.3、12.6、25.2、63.0、126.0 μg鹽酸麻黃堿的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以其質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：回歸方程Y=25 351.509X-5 999.754 3，相關(guān)系數(shù)為0.999，說明鹽酸麻黃堿在6.3～126 μg/mL 范圍內(nèi)線性條件良好。

2.2.5 精密度考察取濃度為182.7 μg/mL 的綠原酸對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6 次峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.38%。取濃度為62.97 μg/mL 的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6 次峰面積，RSD 為0.38%，符合精密度要求。

2.2.6 穩(wěn)定性考察取樣品2 g，精密稱定，按“2.2.3”的方法制備樣品溶液，分別放置0，2，4，8，12，24 h 后進(jìn)樣測定，綠原酸峰面積RSD 為1.2%，鹽酸麻黃堿峰面積RSD 為1.1%，24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取六份樣品，每份2.0 g，精密稱定，分別置25 mL 量瓶中，各加入含鹽酸麻黃堿對(duì)照品（0.113 mg/mL）、綠原酸對(duì)照品（3.024 mg/mL）0.8、0.8、1.0、1.0、1.2、1.2 mL，加入 甲醇15 mL，超聲（功率300 W，頻率25 kHz）處理20 min，先定容，再搖勻，然后濾過，按色譜條件來測定含量，計(jì)算回收率。見表2，表3。

表2 綠原酸回收率

表3 鹽酸麻黃堿回收率

2.2.8 檢出限測定經(jīng)測定鹽酸麻黃堿的檢出限0.006 3 μg/mL，綠原酸的檢出限為0.000 36 μg/mL。

2.2.9 樣品含量測定精密稱取適量小兒咳喘靈顆粒樣品，按“2.2.3”的方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定4 次，計(jì)算樣品中2 種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定含量（mg/g）

3 討論

查閱文獻(xiàn)，小兒咳喘靈顆粒中有檢測麻黃、金銀花等［19-23］的相關(guān)報(bào)道，但尚未見對(duì)瓜蔞有任何研究，對(duì)樣品質(zhì)量控制存在空白。本研究對(duì)瓜蔞進(jìn)行TLC 鑒別研究，曾選用乙酸乙酯:甲酸:甲醇:水（12∶0.1∶1∶0.1）作為展開劑，但效果不好，有陰性樣品干擾，易造成假陰性。通過反復(fù)多次試驗(yàn)，最終確定使用甲酸:乙酸乙酯:石油醚（60～90 ℃）（0.1∶1∶4）作為展開劑，展開效果良好，陰性無干擾。通過對(duì)18 家企業(yè)18 批樣品檢驗(yàn)，結(jié)果有2 家樣品未檢出與瓜蔞對(duì)照藥材相同顏色的斑點(diǎn)，由于目前尚未見有任何標(biāo)準(zhǔn)對(duì)此有規(guī)定，提示是否存在投料風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于甘草鑒別，參考文獻(xiàn)，比較了甲醇超聲和甲醇回流后再用飽和正丁醇提取兩種方法，前種方法陰性樣品有一定的干擾，后種方法特異性強(qiáng)，陰性無干擾。

測定木犀草苷、綠原酸大多使用高效液相色譜法［15,22］，本研究將綠原酸和鹽酸麻黃堿兩個(gè)成分在一個(gè)系統(tǒng)中檢測出來，曾選用甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸和乙腈-水溶液（15∶85，用磷酸調(diào)節(jié)至pH3.0），最后確定的流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液，用梯度洗脫的方式，取得較好分離效果，做到了檢測效率的提高和試驗(yàn)成本的降低。

通過多批次樣品的調(diào)研檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部頒標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行覆蓋面最廣，但項(xiàng)目設(shè)置不完善，僅有兩個(gè)理化鑒別項(xiàng)目，無法有效控制藥品質(zhì)量。各注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目設(shè)置差異大，項(xiàng)目設(shè)置不完善，相同指標(biāo)方法及規(guī)定限度差別較大。為進(jìn)一步完善統(tǒng)一現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究增加制劑中瓜蔞、甘草的薄層鑒別，增加麻黃、金銀花的有效成分指標(biāo)控制，望能幫助企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量。

對(duì)18 家企業(yè)50 批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，其中綠原酸、麻黃堿最高含量分別為5.056、0.519 mg/g，最低含量分別為0.114、0.041 mg/g，分別相差了44 倍和12 倍。不同廠家乃至同一廠家不同批次生產(chǎn)的樣品中各成分含有量均有較大差異，質(zhì)量參差不齊，可能與藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究，提示相關(guān)監(jiān)管研究部門引起重視。