微波功率對蛋清蛋白粉乳化特性的影響

劉麗莉，史勝娟，吳紅梅，丁 玥，程偉偉

(1河南科技大學(xué) a食品與生物工程學(xué)院，b 食品加工與安全國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，c 農(nóng)產(chǎn)品干燥技術(shù)河南省教育廳科技創(chuàng)新團(tuán)隊，河南 洛陽 471023；2洛陽正大食品有限公司，河南 洛陽 471023)

蛋清蛋白粉由鮮雞蛋清經(jīng)干燥加工制成，作為雞蛋清優(yōu)良的代替品，蛋清蛋白粉因具有較好的加工特性且貯存方便而被廣泛研究[1]。在蛋清蛋白粉生產(chǎn)加工過程中，干燥方式是影響其功能特性的重要因素之一，因此采用適當(dāng)?shù)母稍锓绞綄﹄u蛋清進(jìn)行干燥處理，開發(fā)出具有更高品質(zhì)的蛋清蛋白粉，對于拓展其應(yīng)用領(lǐng)域具有非常重要的市場價值。目前，已有較多學(xué)者采用不同的方法對雞蛋清進(jìn)行干燥處理[2-4]。代曉凝等[5]采用多種干燥方式對雞蛋清進(jìn)行干燥處理，探究了不同干燥方式對蛋清蛋白凝膠特性和結(jié)構(gòu)的影響；王潔等[6]采用真空冷凍技術(shù)干燥雞蛋清，并分析總結(jié)了影響干燥過程的重要因素；孫卓等[7]利用超聲處理輔助噴霧干燥技術(shù)制備速溶性蛋清蛋白粉，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲處理后的蛋清蛋白粉顆粒細(xì)小而且均勻性增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于無序，這些變化都有利于提高蛋清蛋白粉的速溶性。

因蛋清蛋白具有良好的功能特性，因此在食物的質(zhì)地和結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。目前關(guān)于蛋白的起泡性研究較多，張婷等[8]綜述了蛋白起泡特性的相關(guān)機(jī)理以及生物酶解對蛋白起泡特性的影響因素，胡潔芳[9]研究了利用微波糖基化改性提高蛋清蛋白的起泡性，Wouters等[10]研究了面筋水解物和蛋清混合蛋白溶液的起泡及空氣-水界面特征。而乳化活性作為蛋白質(zhì)的另一個重要加工特性，在食品加工過程中也起著重要的作用[11]。現(xiàn)階段關(guān)于乳化活性的研究多以蛋黃為主，但蛋黃中脂肪含量較多，相對于蛋黃而言，蛋白膽固醇含量較低，有利于預(yù)防心腦血管等疾病。因具有親水基和疏水基，因此蛋白分子可均勻地分布在油-水混合體系中，降低表面張力，使水和油形成穩(wěn)定的乳化液[12]。因此，蛋白的乳化活性是目前的研究熱點(diǎn)。

目前，關(guān)于蛋白的乳化活性研究主要集中在對蛋白質(zhì)的修飾及改性方面，而關(guān)于干燥處理對蛋清蛋白乳化活性的影響鮮見報道。劉麗莉等[13]對蛋白的功能特性有較多的研究，但大多集中在蛋白的凝膠性和起泡性等方面，關(guān)于乳化活性尚無較為全面的研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍干燥后的蛋清蛋白粉在溶解度和乳化活性方面有了明顯提高[14]。因此本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究微波真空冷凍干燥功率對蛋清蛋白粉乳化特性的影響，為高品質(zhì)干燥的蛋清蛋白粉應(yīng)用于食品加工業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋、大豆油，購于河南省洛陽市大張超市；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，美國Sigma公司；KBr(分析純)，天津市光復(fù)經(jīng)濟(jì)化工研究所；Na2HPO4(分析純)、NaH2PO4(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微波真空冷凍干燥機(jī)，實(shí)驗(yàn)室自制；UV2600型紫外分光光度儀，日本日立公司；TM3030Plus電子掃描顯微鏡，日本島津公司；VERTEX70傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker公司；Zetasizer Nano-ZS90 粒度儀及Zeta電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；Cary eclpise 熒光分光光度計，美國Aglient Cary elipse 公司；Leica DM2500型光學(xué)顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雞蛋預(yù)處理 將鮮雞蛋表面的污漬清洗干凈，帶殼消毒，晾干后分離蛋清蛋黃，攪拌蛋清液并在室溫下自然發(fā)酵48 h進(jìn)行脫糖，巴氏殺菌法殺菌后進(jìn)行干燥處理。

1.3.2 微波真空冷凍干燥蛋清蛋白粉的制備 本研究所用的微波真空冷凍干燥機(jī)自制，設(shè)備原理參照段柳柳等[15]的研究。將蛋清液平鋪于物料盤內(nèi)，先在冰箱冷凍室預(yù)凍3 h。打開設(shè)備的制冷系統(tǒng)，待冷阱溫度降至-40 ℃后放入物料，開啟微波和真空泵。固定真空度為300 Pa，裝載量為120 g，改變微波功率(100，200，300，400，500 W)，干燥至絕干。

1.3.3 蛋清蛋白粉乳液的制備 參考Wang等[16]的方法略作修改。稱取0.2 g干燥蛋清蛋白粉樣品，溶解于100 mL水中，25 ℃下1 000 r/min攪拌1 h。然后取攪拌好的蛋白溶液15 mL與5 mL大豆油混合，在高速乳化均質(zhì)機(jī)下以13 500 r/min乳化2 min，得到蛋清蛋白粉乳液。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)測定 在燒杯底部取20 μL蛋清蛋白粉乳液，與5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液均勻混合，分別于混合后0，10 min在500 nm處測定吸光度值。以0.1% SDS作空白對照。乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(emulsifying stability index,ESI)計算公式為:

(1)

(2)

式中：EAI為乳化活性指數(shù)，m2/g；T=2.303，為固定常數(shù)；A0為混合0 min的吸光度值；N為稀釋倍數(shù)，取250；C為蛋清蛋白粉乳液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/mL；φ為乳液中油相的體積分?jǐn)?shù)，φ=0.25；ESI為乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min；A10為混合10 min的吸光度值。

1.4.2 Zeta電位測定 先將樣品用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)稀釋50倍，乳液的相對折射率設(shè)置為1.450，采用Zeta電位分析儀在室溫下測定3次。

1.4.3 粒徑測定 利用激光粒度儀測定樣品的粒徑。取乳液100 μL用蒸餾水稀釋50倍，在25 ℃下平衡2 min后開始測試，每個樣品平行測定3次。

1.4.4 濁度測定 采用Kurganov等[17]的方法，將處理后的蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)進(jìn)行稀釋，使其質(zhì)量濃度為2 mg/mL，用旋渦振蕩器將其混合，在400 nm處測定其吸光度(OD400)，用所得OD400值表示濁度。

1.4.5 內(nèi)源熒光光譜 根據(jù)Ye等[18]的方法，取120 μL乳液樣品溶于8 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中，充分振蕩，設(shè)定激發(fā)波長為290 nm，采用高電壓800 V，掃描發(fā)散光譜范圍310～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。

1.4.6 掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)分析 取微量待測樣，用導(dǎo)電銀膠粘到掃描電鏡樣品臺上，置于掃描電鏡下觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4.7 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析 將處理后的蛋白樣品進(jìn)行冷凍干燥，取1 mg樣品和少量溴化鉀粉末混合磨粉并壓制成片，用傅里葉變換紅外光譜進(jìn)行全波段掃描，設(shè)定參數(shù)為掃描次數(shù)32，測量波數(shù)4 000～500 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.4.8 光學(xué)顯微鏡觀察 取一滴制備好的新鮮乳液樣品，滴在載玻片上，然后蓋上蓋玻片放置于顯微鏡載物臺上，用10倍光學(xué)顯微鏡觀察，采集的圖像由連接到電腦的數(shù)字圖像處理軟件獲得。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)測定結(jié)果均做3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Origin 8.5軟件繪圖，用DPS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波功率對蛋清蛋白粉乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

乳化活性和乳化穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)重要的加工特性，具有形成乳化液和維持乳化狀態(tài)的能力[19]。圖1為不同功率微波對蛋清蛋白粉乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響。由圖1可知，蛋清蛋白粉的EAI和ESI均隨微波功率的增高呈先上升后下降的變化趨勢(P<0.05)，當(dāng)微波功率為100 W時，蛋清蛋白粉的EAI和ESI分別為34.40 m2/g和26.92 min；在微波功率為300 W時，蛋清蛋白粉的EAI和ESI均達(dá)到最大值，分別為62.35 m2/g和33.53 min；隨后隨著微波功率的增加蛋清蛋白粉EAI和ESI開始下降。這是因?yàn)檫m度的微波作用導(dǎo)致蛋清蛋白之間的氫鍵和范德華力受到破壞，蛋清蛋白結(jié)構(gòu)變得更加松散，內(nèi)部包埋的基團(tuán)暴露，提高了蛋白質(zhì)對脂肪的吸附能力[20]。Yalcin[21]等研究發(fā)現(xiàn)，微波處理小麥面筋蛋白的乳化活性也得到了提高，這與本研究結(jié)果相一致。

圖中不同小寫字母表示不同功率樣品間差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters show the significant difference among samples (P<0.05).The same below圖1 微波功率對蛋清蛋白粉乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of microwave power on emulsification and emulsification stability of egg white protein powder

2.2 微波功率對蛋清蛋白粉Zeta電位的影響

Zeta電位可以反映蛋清蛋白粉乳液的穩(wěn)定性，液滴表面的電荷可以在液滴之間產(chǎn)生較大的排斥力以維持乳液穩(wěn)定。圖2為不同功率微波下蛋清蛋白粉乳液的Zeta電位。由圖2可知，隨著微波功率的增加，蛋清蛋白粉乳液的Zeta電位絕對值先增加后減小(P<0.05)。當(dāng)微波功率為300 W時，蛋清蛋白粉乳液Zeta電位的絕對值最大，為41.35 mV。當(dāng)微波功率高于300 W時，蛋清蛋白粉乳液Zeta電位的絕對值開始減?。晃⒉üβ蕿?00 W時，Zeta電位絕對值最小，為29.57 mV。這可能是因?yàn)檫m度的微波處理導(dǎo)致乳液界面處吸附的蛋白質(zhì)含量增加所致。Sun等[22]研究表明，增大蛋白質(zhì)濃度會導(dǎo)致其表面負(fù)電荷更多，即Zeta電位絕對值更大。綜上所述，適度的微波輻照可增加蛋清蛋白粉乳液的Zeta電位，提高乳液的穩(wěn)定性；過高的微波輻照可減小乳液的Zeta電位，進(jìn)而降低其穩(wěn)定性。

圖2 微波功率對蛋清蛋白粉乳液Zeta電位的影響Fig.2 Effect of microwave power on Zeta potential of egg white protein powder

2.3 微波功率對蛋清蛋白粉平均粒徑及粒徑分布的影響

粒徑是間接反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的指標(biāo)，粒徑分布可以充分反映樣品溶液中粒子的大小和均勻性[23]。一般來說，液滴粒徑越小乳液體系穩(wěn)定性越好[24]。圖3為不同功率微波處理下蛋清蛋白粉的平均粒徑和粒徑分布。

圖3 微波功率對蛋清蛋白粉平均粒徑及粒徑分布的影響Fig.3 Effects of microwave power on average particle size and particle size distribution of egg white protein powder

由圖3-A可知，蛋清蛋白粉乳液的平均粒徑隨微波功率增加呈先降低后增加的變化趨勢，在微波功率為300 W時，蛋清蛋白粉乳液的平均粒徑最小，為1 203.67 nm；當(dāng)微波功率進(jìn)一步增大后，蛋清蛋白粉乳液的平均粒徑顯著增加，這可能是過高的微波功率使蛋白質(zhì)聚集形成聚集體，蛋白分子粒徑變大[25]，導(dǎo)致其平均粒徑增加，EAI和ESI降低。

由圖3-B可知，微波功率為300 W時，蛋清蛋白粉乳液粒徑分布呈現(xiàn)單峰曲線，其余功率則呈現(xiàn)多峰分布，這表明微波功率為300 W時，蛋清蛋白質(zhì)更均勻地分散在溶液體系中[26]。

2.4 微波功率對蛋清蛋白粉濁度的影響

濁度是表征蛋白質(zhì)聚集程度的關(guān)鍵指標(biāo)，能從側(cè)面反映蛋白在溶液中的分散狀態(tài)[27]。為進(jìn)一步證明微波功率變化會引起蛋白質(zhì)分子聚集及粒徑大小的改變，對蛋清蛋白粉的濁度進(jìn)行測定。圖4為微波功率對蛋清蛋白粉濁度的影響。由圖4可知，當(dāng)微波功率較低時蛋清蛋白粉濁度較?。划?dāng)微波功率超過300 W后，蛋清蛋白粉濁度隨微波功率的增加呈顯著增大趨勢(P<0.05)。這可能是因?yàn)檫^高功率的微波輻射使蛋白質(zhì)在干燥過程中發(fā)生交聯(lián)和聚集，顆粒較大，導(dǎo)致濁度增加[28]。Cromwell等[29]研究表明，溶液中聚集體數(shù)量和大小會影響樣品的濁度。400和500 W處理后的蛋清蛋白粉乳液樣品的濁度顯著增加，這與其粒徑顯著增大的結(jié)果相互佐證，表明蛋清蛋白粉乳液經(jīng)較高微波功率處理后形成了聚集體，導(dǎo)致乳液的ESI降低。

圖4 微波功率對蛋清蛋白粉濁度的影響Fig.4 Effect of microwave power on turbidity of egg white protein powder

2.5 微波功率對蛋清蛋白粉內(nèi)源熒光光譜的影響

內(nèi)源熒光光譜可判斷蛋白構(gòu)象變化，通過分析光譜變化反映出側(cè)鏈的變化。蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來源于對微環(huán)境變化較為敏感的色氨酸(Trp)[30]。圖5為不同功率微波處理對蛋清蛋白粉乳液內(nèi)源熒光光譜的影響。

圖5 微波功率對蛋清蛋白粉內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.5 Effect of microwave power on endogenous fluorescence spectrum of egg white protein powder

由圖5可知，不同功率微波處理后,蛋清蛋白粉乳液的內(nèi)源熒光光譜形狀未發(fā)生改變，但熒光強(qiáng)度發(fā)生了明顯變化。隨微波功率的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，500 W微波功率處理的蛋清蛋白粉乳液λmax處的內(nèi)源熒光強(qiáng)度相比100 W微波處理降低20.67%，且λmax從338 nm移至334 nm。這可能是因?yàn)槲⒉üβ蔬^高，蛋白分子發(fā)生聚合沉淀，使暴露在蛋白分子表面的Trp殘基被包裹在蛋白分子內(nèi)部，導(dǎo)致蛋白熒光強(qiáng)度降低[31]，造成粒徑變大，濁度增加，從而導(dǎo)致蛋清蛋白粉乳液的EAI和ESI降低。

2.6 不同功率微波下蛋清蛋白粉乳液的掃描電鏡圖

從圖6可以看出，在2 000倍放大倍數(shù)下，100 W處理下的蛋清蛋白粉比較規(guī)整，結(jié)構(gòu)緊密，局部有細(xì)微的孔眼，質(zhì)地飽滿，顆粒的大小不均勻，表面有光澤；當(dāng)微波功率為200 W時，蛋清蛋白粉表面展開，孔眼增加且較深；微波功率為300 W時，蛋清蛋白粉表面展開程度增大，顆粒的大小均勻，質(zhì)地疏松。這可能是適度功率微波處理可使深埋在蛋白分子內(nèi)部的側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來，分子柔韌性增強(qiáng)，蛋白分子在界面上的展開與形態(tài)改變更容易些[32]。這使得微波適度功率輻照可提高蛋清蛋白粉乳化活性的微觀原因得到了很好的直觀說明。繼續(xù)增大微波功率(400～500 W)，蛋清蛋白粉表面的舒展程度較差，這可能是過高功率的微波處理，通過極性分子的摩擦作用加劇了蛋白間的相互作用，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)變得粗糙且更加不規(guī)則，乳液的EAI和ESI降低。

圖6 微波處理后蛋清蛋白粉乳液的掃描電鏡圖(×2 000)Fig.6 Scanning electron microscopy of egg white protein powder after different microwave treatments

2.7 不同功率微波下蛋清蛋白粉的紅外光譜分析

圖7為不同功率微波處理后的蛋清蛋白粉FT-IR圖譜。從峰位變化分析，300 W處理后蛋清蛋白粉的酰胺I帶為1 655.61 cm-1，相較于其他功率的蛋清蛋白酰胺I帶向高波數(shù)方向發(fā)生了紅移。說明微波干燥功率使蛋白質(zhì)分子中的二級結(jié)構(gòu)單元組成峰位發(fā)生了位移變化[33]。

圖7 不同功率微波處理后蛋清蛋白粉的紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of egg white protein powder under different microwave power

表1為通過紅外光譜分析得到的微波冷凍干燥處理后蛋清蛋白粉的二級結(jié)構(gòu)組成。由表1可知，隨著微波功率的增大，蛋清蛋白粉二級結(jié)構(gòu)中各組成的含量發(fā)生顯著變化，其中α-螺旋相對含量顯著降低(除200 W外)，β-轉(zhuǎn)角相對含量先增加后降低。

多肽鏈上羰基和氨基之間的氫鍵是維持α-螺旋穩(wěn)定的主要作用力[34]，微波功率為500 W時蛋清蛋白粉二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量降到最低，可能是因?yàn)槲⒉üβ蔬^高，輻射能較多，導(dǎo)致蛋清蛋白粉發(fā)生解螺旋現(xiàn)象，從而造成α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低[35]。300 W處理的蛋清蛋白粉二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加，可能是因?yàn)檫m當(dāng)功率的微波輻射，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加舒展，從而造成β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加[36]。蛋白結(jié)構(gòu)的展開有利于包裹在蛋白分子內(nèi)部的基團(tuán)暴露出來，表面活性增強(qiáng)，從而提高其乳化特性。

表1 不同功率微波處理后蛋清蛋白粉的二級結(jié)構(gòu)含量(紅外光譜)Table 1 Secondary structure fractions of egg white protein powder (FT-IR) under different microwave power

2.8 不同功率微波下蛋清蛋白粉顯微鏡觀察結(jié)果

利用光學(xué)顯微鏡可以明顯觀察到不同功率微波處理下樣品的微觀結(jié)構(gòu)變化。由圖8可知，在相同的放大倍數(shù)(×10)下，不同功率微波處理下蛋清蛋白粉乳液的液滴明顯不同。100～400 W處理下蛋清蛋白粉乳液的液滴直徑較小，均勻性相對較好。其中，300 W處理下蛋清蛋白粉乳液的液滴直徑最小，且分布最為均勻，這與上文提到的300 W處理下蛋清蛋白粉乳液的EAI和ESI較高，平均粒徑較小，濁度較小相一致。當(dāng)微波功率為500 W時，蛋清蛋白粉乳液的液滴直徑較大，液滴出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，因此其對應(yīng)的ESI較低，平均粒徑增大，濁度增加。

3 結(jié) 論

微波真空冷凍干燥功率對蛋清蛋白粉乳化特性影響顯著，隨著微波功率的增加,改變了蛋清蛋白粉中蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，進(jìn)而影響蛋清蛋白粉的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。當(dāng)微波功率為300 W時，蛋清蛋白粉乳液的EAI、ESI值和Zeta電位值最大，平均粒徑最小，且此時蛋清蛋白粉的微觀結(jié)構(gòu)疏松，乳液液滴大小均勻。但當(dāng)微波功率過高時，加劇了蛋白間的相互作用，蛋白的舒展程度較差，從而使蛋白結(jié)構(gòu)變得粗糙且更加不規(guī)則，并且乳液的液滴直徑較大，進(jìn)而引起乳液的EAI和ESI值較低。