Mi R-32-3p在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及其臨床意義

石 林，張帥帥，任翠愛

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一種好發(fā)于中老年人的惡性漿細(xì)胞腫瘤，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%，發(fā)病率僅次于非霍奇金淋巴瘤。隨著新型藥物的引入，患者的總體生存率得到明顯改善，5年相對存活率從1973-1982年的28%增加到2003-2013的41%[1]，但由于耐藥性的存在，大多數(shù)骨髓瘤患者仍無法擺脫復(fù)發(fā)的厄運(yùn)[2]。

MicroRNA（miRNA）是長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以通過靶向mRNA沉默mRNA的翻譯或促進(jìn)mRNA降解[3]。miRNA可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)約30%～80%的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)控制細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及凋亡[4]。miR-32-5p已被證實(shí)在多種腫瘤中高表達(dá)，在多發(fā)性骨髓瘤中，過表達(dá)miR-32-5p的骨髓瘤細(xì)胞系，細(xì)胞周期蛋白c-Jun,c-Myc表達(dá)也隨之增高[5]，表明miR-32-5p在多發(fā)性骨髓瘤中作為致癌因子發(fā)揮作用[6]。但是對于miR-32-3p在多發(fā)性骨髓瘤中作用幾乎沒有相關(guān)報(bào)道。miR-32-3p作為染色體不穩(wěn)定相關(guān)micRNA，可能會影響MM的發(fā)生發(fā)展。為了研究miR-32-3P在MM患者中發(fā)揮的作用以及對藥物的敏感性的影響，本次實(shí)驗(yàn)收集了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院淋巴瘤診治中心就診的26例骨髓瘤患者標(biāo)本，8例健康供者的骨髓標(biāo)本，與健康患者比較，miR-32-3p在骨髓瘤患者中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，提示miR-32-3p可能在骨髓瘤中發(fā)揮著抑癌作用。

1 材料和方法

1.1 骨髓瘤樣本收集及處理 收集中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院淋巴瘤診治中心2014年6月-2014年12月就診的26例骨髓瘤患者標(biāo)本（實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)后廢棄樣本），8例健康供者的骨髓標(biāo)本（實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)后廢棄的骨髓移植的健康供者標(biāo)本），兩組標(biāo)本年齡、性別具有可比性。所有樣本經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，使用80μL PBS-AB重懸2×107/mL的細(xì)胞懸液，加入20μL CD138磁珠，4℃孵育5 min，過柱分離出CD138+細(xì)胞，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 骨髓瘤細(xì)胞系（ARP1）培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將生長狀態(tài)良好的ARP1細(xì)胞以2×106/孔接種于10 cm培養(yǎng)皿中，使用Lenti-PacTM HIV慢病毒包裝試劑盒（Genecopia，LT001-01,LT001-03），使用miR-32模擬物和miR-control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ARP1野生型細(xì)胞,分別記做ARP1-miR-32 OE和ARP1-EV，同時(shí)加入polybrene 3μg/mL，轉(zhuǎn)染24 h后換液，用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%FBS+1%雙抗）培養(yǎng)2 d后，在熒光顯微鏡下觀察熒光情況，使用嘌呤霉素（puro）1μg/mL篩選細(xì)胞，流式檢測陽性率，陽性率在90%以上為最佳。

1.3 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-32-3p的表達(dá)豐度 使用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒（Genecopia，QP015），以U6（Genecopia，HmiRQP9001）為內(nèi)參,用實(shí)時(shí)定量PCR檢測ARP1-miR-32OE和ARP1-EV2個(gè)細(xì)胞系miR-32-3p（Genecopia，HmiRQP0403）的表達(dá)豐度。以2-ΔΔCt計(jì)算miR-32-3p的相對表達(dá)量，重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的ARP1-EV和ARP1-miR-32 OE細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×105/mL，在12孔板中鋪板，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，使每孔起始細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別在d 2、3、4、5、6、7記錄細(xì)胞數(shù)據(jù)。

1.5 藥敏試驗(yàn) CCK8檢測miR-32-3p對細(xì)胞化療耐藥性影響，取對數(shù)期生長的ARP1-miR-32-3P-OE與ARP1-EV細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/mL，每孔取100μL，接種于6孔板中；設(shè)置化療藥物硼替佐米濃度為5 nmol/L，每孔加如10μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,分別孵育24、48、72 h，加CCK8溶液10μL/孔，2 h后使用用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)孔平均吸光度/對照孔平均吸光×100%,。

1.6 Western blot驗(yàn)證細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量將ARP1-EV細(xì)胞以及ARP1-miR-32 OE的細(xì)胞裂解，BSA定量法測定蛋白濃度，上樣量調(diào)整為每孔20μL進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜；用5%的脫脂奶粉封閉1 h，洗膜，分別用c-Myc（Proteintech，10828-1-AP），Aurka（Abcam，ab13824），p53（Abcam，ab131442），p-H2AX（CST,#9718）等細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)抗體，4℃冰箱孵育過夜，洗膜，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h后洗膜，在化學(xué)發(fā)光成像儀（Biorad，chemiDoc）中進(jìn)行顯色，用灰度值表示個(gè)蛋白相對表達(dá)量。

1.7 動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 小鼠(NOD-SCID)雌性小鼠（10只），購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（動物質(zhì)量合格證號SCXK（京）2016-0006），在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所SPF級動物合格環(huán)境下飼養(yǎng)（合格證號SYXK（津）2020-0003），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后（6周齡，體重為18～20 g），隨機(jī)分為2組，每組5只，共10只小鼠，將對數(shù)生長期的ARP1-EV細(xì)胞、ARP1-miR-32OE細(xì)胞離心，PBS清洗兩遍，重懸，細(xì)胞濃度調(diào)制1×107/mL，小鼠腋下注射100μL細(xì)胞懸液（1×106個(gè)細(xì)胞），對照組接種ARP1-EV細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組注射ARP1-miR-32OE細(xì)胞，成瘤后使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（a），短徑（b），計(jì)算腫瘤體積V（cm3）=a×b2／2，當(dāng)腫瘤長徑超過2 cm時(shí)脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism8.0.1進(jìn)行圖片繪制。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量資料使用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓瘤患者與健康供者miR-32-3p的相對表達(dá)水平 骨髓瘤患者26例，男15例，女11例，年齡（53.1±9.7）歲，健康供者8例，男5例，女3例，年齡（43±6）歲。骨髓瘤患者骨髓CD138+細(xì)胞miR-32-3p的表達(dá)水平（7.33±6.17）低于健康供者骨髓CD138+細(xì)胞miR-3-3p的表達(dá)水平（40.49±27.97，P＜0.001）（圖1）。

圖1 Mir-32-3p在健康供者與骨髓瘤患者樣本中的表達(dá)水平

2.2 RT-PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 RT-PCR檢測miR-32-3p過表達(dá)水平為（12.11±0.32）倍（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)法檢測ARP1-miR-32OE/EV細(xì)胞的增殖情況，與對照組比較，過表達(dá)miR-32-3p的MM細(xì)胞系能明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0.01，圖3）。

2.3過表達(dá)miR-32-3p對MM細(xì)胞增殖的影響 用

圖3 過表達(dá)miR-32-3p對MM細(xì)胞增殖的影響

2.4 ARP1-miR-32-3p-OE細(xì)胞系對化療藥物耐藥性的影響 在抗癌藥物硼替佐米的作用下，ARP1-EV細(xì)胞系存活率均高于同時(shí)點(diǎn)的ARP1-32-3p-OE細(xì)胞系（P＜0.05)。表1。

表1 ARP1-miR-32-3p-OE細(xì)胞系對化療藥物耐藥性的影響（±s）

表1 ARP1-miR-32-3p-OE細(xì)胞系對化療藥物耐藥性的影響（±s）

與同時(shí)點(diǎn)ARP1-EV細(xì)胞比較，*P＜0.05

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2.5 WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-32-3p在蛋白水平下調(diào)c-Myc，Aurka，Bcl2，Notch1的表達(dá)，上調(diào)p-53，p-H2AX表達(dá)（圖4,表2）。

表2 Mir-32-3p對ARP1細(xì)胞系相關(guān)蛋白的影響

圖4 WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 MiR-32-3p表達(dá)水平對MM細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響 ARP1-miR-32-3p OE組小鼠腫瘤體積（V3=5.33±2.13cm3）與ARP1-EV組腫瘤體積（V3=9.40±4.29cm3）比較，增殖受抑制，（P＜0.05，圖5）。

圖5 MiR-32-3p表達(dá)水平對MM細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響(A)ARP1-miR-32-3pOE細(xì)胞系腫瘤生長速度；(B)小鼠腫瘤體積大小直觀圖

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)中發(fā)病率僅次于非霍奇金淋巴瘤的惡性腫瘤[7]，由于復(fù)雜的骨髓微環(huán)境以及高度的侵襲性，多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制至今未被完全了解，隨著新藥的不斷開發(fā)，多發(fā)性骨髓瘤患者的5年相對生存率得到明顯改善，然而，頻繁的復(fù)發(fā)與耐藥仍然是大多數(shù)患者無法避免的結(jié)局[8]。因此，尋找MM潛在靶向因子，有望為臨床疾病治療提供新的思路與靶標(biāo)。

MicroRNA顯示出了其在生命過程中的調(diào)控能力[9]，研究顯示，miRNA多出現(xiàn)在染色體缺失或擴(kuò)增的不穩(wěn)定區(qū)域，與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，已被證實(shí)多種miRNA可以調(diào)控MM的發(fā)展，miR-15a與miR-16在MM顯著低表達(dá)，并與Bcl2和Cyclin E的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[10]，通過影響CDC25A和Cyclin D1/D2表達(dá)，靶向Bcl2并抑制AKT3和NF-kB途徑來抑制細(xì)胞增殖；miR-221和222通過靶向腫瘤抑制基因PTEN和與促凋亡基因PUMA，發(fā)揮致癌作用[11]；miR-138可以抑制TRPS1和SULF2的表達(dá)，抑制miR-138的表達(dá)增強(qiáng)了MM的骨生成[12]。本研究結(jié)果顯示，miR-32-3p相較于正常樣本，在骨髓瘤患者體內(nèi)顯著低表達(dá)，并且能夠下調(diào)c-Myc，Bcl2等蛋白的表達(dá)，抑制MM細(xì)胞的增殖。

為了探索ARP1-miR-32-3p在藥物敏感性方面發(fā)揮作用的機(jī)制，本研究檢測了與耐藥增殖等相關(guān)的蛋白。c-Myc基因是位于染色體8q24.21的原癌基因，編碼一種核磷蛋白，在細(xì)胞周期，凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起到作用，編碼的蛋白質(zhì)與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MAX形成異源二聚體結(jié)構(gòu)[13]。該基因的易位常發(fā)生在伯基特淋巴瘤[14]和多發(fā)性骨髓瘤[15]。研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc過表達(dá)會激活相關(guān)下游基因的表達(dá)，促進(jìn)DNA合成，介導(dǎo)細(xì)胞周期延長，增加染色體畸變率，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定并產(chǎn)生化療藥物抵性?，F(xiàn)有研究證實(shí)，c-Myc在急性髓系白血病等多種腫瘤中過表達(dá)，并與細(xì)胞的耐藥性有關(guān)。Aurka編碼的蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一種激酶，在染色體分離過程中參與紡錘體極的形成與穩(wěn)定過程[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在MM中影響染色體不穩(wěn)定與DNA損傷，并參與腫瘤細(xì)胞耐藥[17]。Bcl2蛋白是調(diào)節(jié)蛋白Bcl2家族成員，Bcl2的異常表達(dá)可以破壞MM中的正常的凋亡途徑，且為MM患者耐藥的重要[18]；Notch通路是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖，分化與凋亡。研究表明，Notch信號通路與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病與進(jìn)展密切相關(guān)，Notch1的激活可以促進(jìn)MM細(xì)胞增殖[19]，抑制MM細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥性[20]。本研究結(jié)果顯示，miR-32-3p均可明顯下調(diào)上述蛋白的表達(dá)，表明miR-32-3p可以抑制MM細(xì)胞的增殖，促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡，加強(qiáng)了對硼替佐米的敏感性。

早期有關(guān)microRNA命名較為混亂，許多實(shí)驗(yàn)并未明確指出所研究miR-32的是來自miR-32前體（pre-miR-32）的5’端還是3’端，由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和所處微環(huán)境的不同，不同腫瘤中microRNA的5’端和3’端表達(dá)豐度可能會存在差異。目前有關(guān)miR-32的報(bào)道多數(shù)集中于肝癌[21]，結(jié)腸癌[22]（miR-32），前列腺癌[23]，腎癌[24]（pre-miR-32）等。MiR-32在這些癌細(xì)胞中均表現(xiàn)出高表達(dá)。而對于miR-32-3p報(bào)道，在一項(xiàng)胸膜間皮瘤的研究中明確顯示miR-32-3p表達(dá)升高，在鼻粘膜息肉的研究中miR-32-3p的表達(dá)下調(diào)[25]，而有關(guān)卵巢癌的研究中顯示出miR-32的下調(diào)，且高表達(dá)miR-32能明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[26]。

miR-32位于染色體9q31.3，越來越多的研究顯示MM疾病的發(fā)生與9號染色體異常有關(guān)[27]，因此可以推測可能是9號染色體的異常使得miR-32-3p的表達(dá)降低。此次實(shí)驗(yàn)，miR-32-3p在多發(fā)性骨髓瘤中抑制腫瘤生長的作用已得到驗(yàn)證，然而miR-32-3p的具體作用機(jī)制尚不明確，miR-32-3p是否受其他蛋白或LncRNA調(diào)節(jié)，是否參與了MM經(jīng)典通路，miR-32-3p的靶基因都有哪些等還需做進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。

目前對miR-32-3p的研究較少，尚未有關(guān)于miR-32-3p在多發(fā)性骨髓瘤中研究的相關(guān)報(bào)道，此次對miR-32-3p的研究顯示出了較好的陽性結(jié)果，提示miR-32-3p可能是多發(fā)性骨髓瘤的一個(gè)潛在抑癌因子，可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞衰老，增加對抗癌藥物的敏感性，來抑制多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展。有望成為治療多發(fā)性骨髓瘤的新的靶點(diǎn)，同時(shí)為研究多發(fā)性骨髓瘤提供新的方向。