雙丁注射液和魚腥草注射液聯(lián)合應(yīng)用對青海地區(qū)奶牛隱性乳房炎的防治效果

姜現(xiàn)壘，蘇建民*，張成圖

(1.西寧市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海西寧 810016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

奶牛隱性乳房炎是奶牛業(yè)中易發(fā)生、危害大、防控難的一種疾病，會(huì)造成奶牛乳品質(zhì)下降、產(chǎn)奶量降低和過早淘汰等問題，給奶牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。在發(fā)達(dá)國家，奶牛隱性乳房炎的發(fā)病率達(dá)到30%～70%[1]。奶牛隱性乳房炎的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨床型乳房炎，對奶牛的健康問題和危害也更大。奶牛乳房炎是由多種病原微生物和環(huán)境的多重影響引起的，尤其是黃金葡萄球菌、大腸埃希氏菌和無乳鏈球菌等[2]。目前，抗生素作為治療大多數(shù)疾病和奶牛乳房炎的主要藥物，但不規(guī)范使用抗生素也造成了耐藥問題。我國畜牧業(yè)長期無節(jié)制地大劑量使用抗生素已經(jīng)造成了耐藥株的增加，很多廣譜抗生素已經(jīng)不是治療乳房炎的首選藥物。

中草藥具有毒性低、殘留少療效好等優(yōu)點(diǎn)，還具有不易造成細(xì)菌耐藥和不易導(dǎo)致抗生素殘留等優(yōu)點(diǎn)。在獸醫(yī)臨床治療中，中草藥已廣泛用于奶牛乳房炎的防治工作并取得較好的治療價(jià)值。其中，魚腥草、蒲公英和紫花地丁具有較強(qiáng)的抗菌活性，對黃金葡萄球菌和大腸埃希氏菌等具有較好的抗菌效果[3,4]。因此，探究中草藥對奶牛隱性乳房炎的防控和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 試驗(yàn)中的乳汁和血液均采自青海省圣亞高原牧場的荷斯坦奶牛。

1.1.2 主要試劑 雙丁注射液、魚腥草注射液，西鄉(xiāng)長江動(dòng)物藥品有限責(zé)任公司產(chǎn)品；注射用氨芐西林鈉，河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；加州乳房炎測試液(CMT)，南京茂捷微生物科技有限公司產(chǎn)品；髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；N-乙?；?β-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase,NAG)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)測定試劑盒、丙谷轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)測定試劑盒、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)測定試劑盒、總膽紅素(Total bilirubin,TBIL)測定試劑盒、直接膽紅素(direct Bilirubin,DBIL)測定試劑盒、間接膽紅素(indirect Bilirubin,IDBIL)測定試劑盒、葡萄糖(glucose,GLU)測定試劑盒、總膽固醇(total cholesterol,T-CHOL)測定試劑盒、甘油三酯(triglyceride,TG)測定試劑盒，湖南永和陽光生物科技股份有限公司產(chǎn)品；AccuStain Solution、Accuchip、體細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒，韓國NanoEnTek公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 全自動(dòng)血液生化分析儀(AFS4000)，湖南永和陽光生物科技股份有限公司產(chǎn)品；乳品質(zhì)快速分析儀(MilkoScan FT120)，丹麥福斯集團(tuán)公司產(chǎn)品；Adam全自動(dòng)活細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力分析儀(ADAM MC Auto Cell Counter)，韓國NanoEnTek公司產(chǎn)品；超微量微孔板分光光度計(jì)(Epoch)，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)(Micro21R)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究以青海省圣亞高原牧場中泌乳正常且無臨床型乳房炎癥狀的20頭荷斯坦奶牛為研究對象。采用加州乳房炎診斷液進(jìn)行檢測，共篩選出9頭陽性牛，將9頭陽性牛隨機(jī)分為2組分別用中藥和抗生素進(jìn)行治療。中藥治療組(TCM group)為5頭(雙丁注射液：肌肉注射，0.1 mL/kg，一日1次，連用8 d；魚腥草注射液：肌肉注射，20 mL，一日1次，連用8 d)；抗生素治療組(antibiotic group)為4頭(氨芐西林鈉注射液：肌肉注射，20 mg/kg，一日2次，連用8 d)；健康對照組(healthy control group)為5頭(正常飼喂)。將試驗(yàn)?zāi)膛７謩e進(jìn)行編號，通過測定不同組別奶牛在1 d、3 d、6 d、12 d時(shí)的治療效果、體細(xì)胞數(shù)變化、產(chǎn)奶量、血清生化指標(biāo)、乳品質(zhì)和乳酶活性進(jìn)行綜合評價(jià)。

1.2.2 隱性乳房炎的檢測 采集乳樣時(shí)，棄去前3把奶，取不同乳區(qū)奶樣，分別加入2 mL奶樣于白色檢驗(yàn)皿的4個(gè)小盤內(nèi)，每個(gè)小盤內(nèi)再加入CMT檢驗(yàn)液2 mL，平穩(wěn)做同心圓搖動(dòng)檢驗(yàn)皿，約10 s后觀察混合物性狀，根據(jù)說明書判定結(jié)果。采集檢出結(jié)果為陽性的奶樣，置于經(jīng)高壓滅菌的10 mL離心管中，標(biāo)明所采樣品的編號、日期等，冷藏并盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2.3 體細(xì)胞數(shù)的測定 采用牛博士 Ⅲ 型體細(xì)胞檢測儀進(jìn)行檢測，將采集的乳汁樣品用紗布過濾后，分別加入100 μL乳汁和100 μL染色液于同一個(gè)離心管中，充分搖勻10 s以上?；旌响o置1 min后開始檢測，將混合液緩慢勻速注入檢測芯片中，此時(shí)避免注入氣泡防止影響試驗(yàn)結(jié)果。最后，將芯片按照箭頭方向插入芯片槽，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 治療效果的統(tǒng)計(jì) 對患病奶牛治療1 d、3 d、6 d、12 d后，在同一時(shí)刻記錄奶牛進(jìn)食狀況、乳房外觀變化情況。分別采集患病牛的奶樣，記錄體細(xì)胞變化并評估治療效果。具體治療情況判定標(biāo)準(zhǔn)如下：乳區(qū)無明顯臨床癥狀，乳汁顏色和產(chǎn)奶量正常，體細(xì)胞數(shù)小于50萬/mL，停藥后2周內(nèi)仍處于正常狀態(tài)，記為痊愈；乳區(qū)仍有輕微癥狀，體細(xì)胞明顯降低，但是大于50萬/mL，記為好轉(zhuǎn)；相比治療前沒有區(qū)別甚至更加嚴(yán)重，體細(xì)胞數(shù)變化不大甚至升高，記為無效。

1.2.5 產(chǎn)奶量的測定 采集乳汁前，對奶牛乳房、乳頭及擠奶人員的手部進(jìn)行清洗，用熱毛巾和酒精對奶牛乳房進(jìn)行擦拭和消毒。對3組奶牛產(chǎn)奶量的統(tǒng)計(jì)分別定于每天的上午8點(diǎn)進(jìn)行。

1.2.6 血清生化指標(biāo)的測定 奶牛于早晨飼喂前采集血樣，分別用負(fù)壓采血管在奶牛的尾靜脈進(jìn)行采血，之后將收集的血液置于37℃樣品箱中放置30 min，待其凝固后3 000 r/min離心10 min，收集血清置于-20℃冰箱用于后續(xù)檢測。血液生化指標(biāo)采用全自動(dòng)血液生化分析儀進(jìn)行分析，測定程序根據(jù)說明書進(jìn)行操作。

1.2.7 乳品質(zhì)的測定 乳品質(zhì)用FOSS FT-120乳品質(zhì)快速分析儀進(jìn)行測定。測定前用紗布濾去牛乳中的雜質(zhì)并置于37℃水浴鍋中加熱5 min。將乳品質(zhì)快速分析儀進(jìn)行調(diào)零和清洗過后進(jìn)行測定，完成測定后讀取各成分?jǐn)?shù)據(jù)。

1.2.8 乳酶活性的測定 將帶回的牛乳在4℃下3 000 r/min離心5 min，去除乳脂后在4℃下16 000 r/min離心30 min，收集到的乳清保存在-80℃冰箱備用。乳酶活性的測定根據(jù)說明書要求進(jìn)行操作。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件(SPSS Inc.，美國)分析評估。結(jié)果圖片使用GraphPad Prism6軟件進(jìn)行繪制。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。當(dāng)進(jìn)行多次比較時(shí)，使用單因素方差分析ANOVA檢測；P<0.05為數(shù)據(jù)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱性乳房炎的檢出率

使用加州乳房炎測試液對無臨床型乳房炎癥狀的20頭奶牛進(jìn)行檢測，陽性檢測盤中出現(xiàn)沉淀物和凝集物，液體有一定黏附性；陰性檢測盤中液體流動(dòng)正常，無沉淀物和凝集物出現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞數(shù)大于50萬/mL的奶牛有9頭，隱性乳房炎檢出率達(dá)到45%。

2.2 體細(xì)胞的測定

經(jīng)過不同方案治療后，體細(xì)胞數(shù)變化如表1所示。發(fā)現(xiàn)患病奶牛每毫升乳汁的體細(xì)胞數(shù)在80萬/mL～100萬/mL之間。經(jīng)過不同方案治療后，兩組的體細(xì)胞數(shù)均明顯下降。經(jīng)中藥治療12 d后的奶牛乳汁中的體細(xì)胞數(shù)基本趨于正常，顯著低于抗生素組(P<0.05)。

2.3 對治療效果的影響

經(jīng)過不同方案治療后，兩組的治療效果如表2所示。抗生素組治療的乳區(qū)為16個(gè)，治愈13個(gè)，有效為1個(gè)，無效為2個(gè)，治愈率為81.33%，有效率87.5%，無效率12.5%；中藥組治療乳區(qū)為20個(gè)，治愈數(shù)為18個(gè)，有效為1個(gè)，無效為1個(gè)，治愈率為90%，有效率95%，無效率5%。

2.4 對產(chǎn)奶量的影響

如表3所示，患病奶牛的產(chǎn)奶量顯著低于健康奶牛(P<0.05)；抗生素組在治療前的平均產(chǎn)奶量為14.37 kg/頭，治療后的平均產(chǎn)奶量增加至18.23 kg/頭，平均產(chǎn)奶量凈增加3.86 kg/頭；中藥組在治療前，平均產(chǎn)奶量為15.07 kg/頭，治療后的平均產(chǎn)奶量增加至23.53 kg/頭，平均產(chǎn)奶凈增加8.46 kg/頭。

2.5 對血清酶理化性質(zhì)的影響

患病奶牛血清中的ALT、AST、ALP和GGT活性明顯高于健康奶牛，并且隨著治療天數(shù)的增加而降低。在治療12 d后，中藥組在ALT、AST、ALP和GGT的活性總體與抗生素組無顯著性差異；在12 d時(shí)，中藥組的AST活性顯著低于健康組(P<0.05)，而抗生素組與健康組無明顯差異。患病奶牛血清中TBIL、DBIL、IDBIL的濃度和GLU、T-CHOL、TG的含量明顯高于健康奶牛，并且隨著治療天數(shù)的增加而降低。在治療12 d后，中藥組在TBIL、DBIL、IDBIL的濃度和GLU、T-CHOL、TG的含量總體與抗生素組無顯著性差異；在12 d時(shí)，中藥組的TBIL濃度顯著高于抗生素組(P<0.05)。在3 d時(shí)，中藥組的TG的濃度顯著高于抗生素組(P<0.05)；在6 d時(shí)，中藥組的TG的濃度顯著高于健康組(P<0.05)，而抗生素組與健康組無顯著性差異。

表1 治療后體細(xì)胞數(shù)變化

表2 治療效果的影響

表3 治療后產(chǎn)奶量的變化

2.6 對乳品質(zhì)的影響

患病奶牛的乳脂、乳糖和非脂固體含量明顯低于健康奶牛，并且隨著治療天數(shù)的增加而升高；而患病奶牛的乳蛋白含量明顯高于健康奶牛，并且隨著治療天數(shù)的增加而降低。在12 d時(shí)，抗生素組的乳脂含量顯著低于健康組(P<0.05)，而中藥組與健康組無顯著性差異。在6 d和12 d時(shí)，抗生素組的乳糖含量顯著低于健康組(P<0.05)，而中藥組與健康組無顯著性差異。在治療6 d后，中藥組的乳蛋白含量顯著低于抗生素組(P<0.05)。

2.7 對乳酶的影響

患病奶牛的N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶、髓過氧化物酶、乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶的活性明顯高于健康組，并且隨著治療天數(shù)的增加而降低。在治療12 d后，中藥組和抗生素組對ALP的活性無顯著性差異。在3 d和6 d時(shí)，抗生素組的NAG活性顯著高于中藥組(P<0.05)。在3 d、6 d和12 d時(shí)，抗生素組的LDH活性顯著高于中藥組(P<0.05)。在3 d時(shí)，抗生素組的MPO活性顯著高于中藥組(P<0.05)；在12 d時(shí)，抗生素組的MPO活性顯著高于健康組(P<0.05)，而中藥組與健康組無顯著性差異。

3 討論

乳房炎的發(fā)生與飼養(yǎng)環(huán)境、遺傳因素、病原菌種類等都有很大關(guān)系，這也是該病頻發(fā)和難于防治的主要原因。我們的檢出率與遼西地區(qū)41.25%[5]和河南地區(qū)46.5%[6]基本一致。明顯高于張萬元等[7]曾報(bào)道的青海省西寧市互助縣東溝鄉(xiāng)29.72%、威遠(yuǎn)鎮(zhèn)54.10%、巴扎鄉(xiāng)26.45%、東和鄉(xiāng)31.86%、南門峽鎮(zhèn)29.34%和加定鎮(zhèn)22.72%的隱性乳房炎檢出率情況。奶牛隱性乳房炎檢出率的上升可能與飼養(yǎng)環(huán)境和病原菌的耐藥性有關(guān)。有研究證明[8]，甘草總黃酮混懸液注射液對奶牛乳房炎治療的治愈率和有效率分別高達(dá)87.17%和97.44%，而抗生素組的治愈率和有效率分別為86.84%和93.42%?？傮w來說，中藥組在治愈率上高于抗生素組，而抗生素較高的無效率可能與細(xì)菌耐藥有關(guān)。高蓉彬等研究發(fā)現(xiàn)[9]，高、中、低劑量組加減瓜蔞散和環(huán)丙沙星對治療奶牛乳房炎的有效率分別為94.44%、85.71%、69.44%和63.89%。奶牛隱性乳房炎發(fā)生后，乳腺上皮細(xì)胞和乳腺導(dǎo)管會(huì)遭到破壞，會(huì)導(dǎo)致血乳屏障的破壞和產(chǎn)奶量的下降。有研究報(bào)道[10]，患有乳房炎的奶牛經(jīng)過中藥治療后的產(chǎn)奶量遠(yuǎn)高于抗生素治療，可能與中草藥對乳腺上皮細(xì)胞和乳腺導(dǎo)管的修復(fù)作用有關(guān)。我們的結(jié)果表明，中藥組對治愈率、產(chǎn)奶量、體細(xì)胞數(shù)的恢復(fù)效果均好于抗生素組，抗生素組具有較高的無效率可能與致病菌產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。

肝臟功能評價(jià)是對藥物治療效果評價(jià)中的必要環(huán)節(jié)。血清酶是評價(jià)機(jī)體器官是否正常的指標(biāo)，其中ALT、AST、ALP、GGT是評價(jià)肝細(xì)胞損傷的主要血清酶。ALT和AST是主要存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷后被釋放到血液當(dāng)中。有研究表明，血液中AST活性與奶牛乳房炎的發(fā)生呈正相關(guān)，可作為預(yù)測奶牛發(fā)病的指標(biāo)[11]。ALP的活性變化與炎癥的程度是正相關(guān)的，可作為奶牛隱性乳房炎的早期診斷。GGT活性與谷胱甘肽的代謝有著密切關(guān)系，可反映肝臟脂肪變性的情況?；疾∧膛Ｑ逯械钠咸烟呛匡@著升高，說明奶牛隱性乳房炎引起了糖代謝異常，這可能與泌乳時(shí)期奶牛對能量的大量需求有關(guān)。體內(nèi)的膽固醇主要以轉(zhuǎn)化為膽汁酸的形式存在，總膽固醇的升高與血清中的膽紅素和總脂濃度有顯著相關(guān)性，因此膽紅素可作為評價(jià)肝代謝和損傷程度的指標(biāo)?；疾∧膛５目偰懝檀忌呖赡芘c甘油三酯的生成和脂肪動(dòng)員有關(guān)。血清中的膽紅素與肝臟中的總脂含量呈正相關(guān)，因此總膽紅素也可作為評價(jià)肝臟損傷程度的指標(biāo)。我們的結(jié)果表明，隱性乳房炎可提高血清酶的活性，也可導(dǎo)致血清中的TBIL、DBIL和IDBIL的明顯升高，但中藥與抗生素治療對肝代謝和肝損傷的影響無明顯差異。

乳蛋白含量的升高可能與乳腺上皮細(xì)胞被破壞和分泌細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松有關(guān)，這使血液中大量的蛋白質(zhì)進(jìn)入乳汁當(dāng)中，從而引起乳汁中的蛋白含量升高。血乳屏障的破壞往往使乳汁中的電導(dǎo)率增加，從而使檸檬酸和乳糖含量下降。有研究表明，在乳房炎感染期間，牛奶中的蛋白質(zhì)水解酶會(huì)破壞乳脂球膜并導(dǎo)致乳脂蛋白和脂肪酶脂肪變性，進(jìn)而引起乳脂濃度的降低[12]。乳酶的活性一定程度可以反映奶牛乳房炎的程度，乳房炎發(fā)生后會(huì)增加NAG、MPO、ALP和LDH等乳酶的生物活性。我們的結(jié)果表明，奶牛隱性乳房炎可導(dǎo)致乳酶活性顯著升高，這與前人的研究結(jié)果是一致的[13]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方案治療乳品質(zhì)均有改善作用，中藥組治療6 d后對乳品質(zhì)恢復(fù)和治療3 d后對乳酶活性恢復(fù)具有更好效果。

綜上所述，雙丁注射液和魚腥草注射液聯(lián)合應(yīng)用在治愈率、產(chǎn)奶量、體細(xì)胞數(shù)、乳品質(zhì)和乳酶活性均優(yōu)于抗生素組，對奶牛隱性乳房炎有更好的治療效果。