寧夏地區(qū)羊源大腸埃希氏菌的分離鑒定及耐藥性檢測

馮 杰，馬劍鋼，張 新，劉晨陽，楊增岐

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院，楊陵 712100)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，E.coli)是動物腸道共棲菌和條件性致病菌，可引起多種動物的大腸埃希氏菌病，尤其是幼齡動物多發(fā)[1-2]。近年來，隨著養(yǎng)羊業(yè)的不斷發(fā)展，我國羊的養(yǎng)殖量不斷增加，疾病的發(fā)生率也隨之不斷增長，特別是羊腹瀉病的發(fā)生，而引起羊腹瀉病主要病原菌之一為大腸埃希氏菌。大腸埃希氏菌引起的羊腹瀉病多見于羔羊，病死率高達50%，對養(yǎng)羊業(yè)造成了極大損失[3-4]。羊腹瀉病在國內外均長期存在，已成為影響?zhàn)B羊業(yè)的世界性疾病，其嚴重性已經對養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成了不可忽視的威脅。

在羊養(yǎng)殖的過程中，越來越多的抗菌藥物被用于治療臨床疾病或作為飼料添加劑，造成羊源大腸埃希氏菌耐藥菌株不斷增多，耐藥機制也日漸復雜，給羊疾病的防治帶來了嚴峻挑戰(zhàn)[5]。有文獻報道，動物源耐藥菌和耐藥基因可通過食物鏈、質粒、轉座子、整合子、噬菌體、插入序列共同區(qū)等傳遞給人類，危害人類健康[6-9]。

目前，我國尚未報道對寧夏地區(qū)羊源大腸埃希氏菌耐藥性的研究，羊源大腸埃希氏菌的臨床用藥缺乏理論參考[10]。本研究旨在通過開展寧夏地區(qū)羊源性大腸埃希氏菌的分離鑒定與耐藥性檢測，闡明該地區(qū)羊源性大腸埃希氏菌的耐藥現(xiàn)狀，為養(yǎng)羊業(yè)的臨床合理用藥、預防和治療羊腹瀉病提供依據(jù)，同時對于監(jiān)測寧夏地區(qū)羊源性細菌的耐藥性也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2018年4月17日至2018年4月29日，在寧夏某兩個屠宰場采集動物臟器及腸道拭子108份。

1.1.2 菌株 標準菌株大腸埃希氏菌ATCC25922由西北農林科技大學動物醫(yī)院院獸醫(yī)傳染病學實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、肉湯、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂(EMB)、大腸埃希氏菌科生化鑒定管、甲基紅指示劑、VP指示劑、吲哚指示劑，杭州天和微生物試劑有限公司產品；含有氨芐西林(AM)、阿莫西林/克拉維酸(A/C)、頭孢他啶(CTD)、頭孢噻呋(CFT)、美羅培南(IPM)、慶大霉素(GM)、大觀霉素(SPT)、四環(huán)素(TE)、氟苯尼考(FFC)、黏菌素(COL)、磺胺異噁唑(SF)、復方新諾明(SXT)、氧氟沙星(OFX)、恩諾沙星(ENR)、乙酰甲喹(MEQ)、安普霉素(AP)16種抗菌標準藥品的耐藥性監(jiān)測板，天津金章科技發(fā)展有限公司產品。

1.1.4 主要儀器 高壓滅菌箱(YXQ-50SⅡ)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產品；冰箱2℃～4℃和-20℃(BCD-315NGS)，青島海爾股份有限公司產品；電子天平感量0.1g(CP124C)，奧豪斯儀器有限公司產品；生物安全柜(SW-CJ-1C)，蘇州安泰空氣凈化技術有限公司產品；超純水機(Advanced-IV-08)，艾柯水處理設備有限公司產品；微量加樣器(10 μL、100 μL、1000 μL和八道排槍)，艾本德中國有限公司產品；恒溫水浴鍋(CF1524R)，上海世澤生物科技有限公司產品；恒溫振蕩器(HZP-250)，上海精宏實驗設備有限公司產品；高速低溫離心機(Micro17R)，賽默飛世爾科技公司產品；PCR儀(C1000)，安諾倫(北京)生物科技有限公司產品；核酸電泳儀(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產品；凝膠成像系統(tǒng)(Syngene GeneGenius)，北京百晶生物技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 羊源大腸埃希氏菌分離與純化

1.2.1.1 菌株初步分離 將采集樣品無菌接種于普通平皿，37℃培養(yǎng)24 h，記錄菌落生長特征，挑取單個菌落進行革蘭氏染色并鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.2.1.2 菌株分離培養(yǎng) 將初步分離的可疑菌落接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長狀況，記錄菌落生長特征，挑取單菌落，革蘭氏染色、鏡檢，觀察記錄菌體形態(tài)。

1.2.1.3 菌株的純化培養(yǎng) 挑取上述分離培養(yǎng)得到的紅色單菌落接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結果，再挑取帶有金屬光澤的菌落進行純化培養(yǎng)，接種于肉湯中，在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，保菌備用。

1.2.2 羊源大腸埃希氏菌鑒定 將保存的疑似菌株的菌液接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，分別挑取單個菌落接種于微量生化管內進行生化鑒定，結果判定依據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》。

1.2.3 羊源大腸埃希氏菌藥敏試驗 通過微量肉湯稀釋法測定大腸埃希氏菌對選用抗生素的最小抑菌濃度(MIC)，在細菌用96孔板每孔加入50 μL CAHMB，并將氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢噻呋、美羅培南、慶大霉素、大觀霉素、安普霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、復方新諾明、恩諾沙星、氧氟沙星、乙酰甲喹、黏菌素進行梯度稀釋。血平板上刮取大腸埃希氏菌菌落，生理鹽水稀釋為麥氏濁度為0.5的菌液。每60 μL菌液與5 mL藥敏接種培養(yǎng)液混合均勻后，按照每孔50 μL加入96孔細菌培養(yǎng)板，置于厭氧培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。通過觀察96孔細菌培養(yǎng)板內大腸埃希氏菌生長情況統(tǒng)計試驗菌株對所選抗生素的MIC值并根據(jù)CLSI抗微生物藥物敏感性試驗判斷標準判斷試驗菌株對所選抗生素耐藥性。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定結果

2.1.1 細菌分離結果 革蘭氏染色鏡檢，其中有略深染、兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿狀菌。對采集的樣品進行培養(yǎng)，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色、邊緣光滑整齊、濕潤的圓型菌落；在伊紅美藍培養(yǎng)基上長出帶金屬光澤、深紫黑色的圓形菌落；在普通瓊脂斜面上的菌落為灰白色; 在普通肉湯中可見管底有灰白色沉淀，肉湯渾濁，并有不愉快氣味。與大腸埃希氏菌的培養(yǎng)特性一致，共分離出58株，分離率達53.70%。

2.2 生化試驗結果

58株分離菌均對葡萄糖、乳糖、麥芽糖，不分解蔗糖，甲基紅(MR) 試驗陽性，乙酰甲基甲醇(VP) 試驗、硫化氫試驗、枸櫞酸鹽試驗均為陰性，結果判定為大腸埃希氏菌，參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》中大腸埃希氏菌的生化特性，結果吻合。

2.3 藥敏試驗結果

2.3.1 細菌的耐藥性 58株大腸埃希氏菌對16種臨床常用抗菌藥物的耐藥情況見表2。由表2可知，分離菌株對除對安普霉素完全不耐藥以外，對其他15種抗菌藥物均具有不同程度的耐藥性。其中對氟苯尼考、四環(huán)素、復方新諾明、磺胺異噁唑耐藥率最高，耐藥率均達到28%；其次，對恩諾沙星、慶大霉素、黏菌素也有耐藥性。

2.3.2 細菌的多重耐藥性 58株羊源大腸埃希氏菌對16種抗菌藥物的多重耐藥現(xiàn)象見表3。由表3可知，出現(xiàn)耐藥的菌株數(shù)共34株，占總菌數(shù)的58.62%，有15株大腸埃希氏菌對1種藥物存在耐藥性，耐藥率為44.12%，有3株大腸埃希氏菌對2種藥物存在耐藥性，耐藥率為8.82%，有16株大腸埃希氏菌對3種或3種以上的藥物存在耐藥性，耐藥率為47.05%。

2.3.3 羊源大腸埃希氏菌的耐藥譜型 58株羊源大腸埃希氏菌的耐藥譜型見表4。由表4可知，共有17種耐藥類型，其中單重耐藥、雙重耐藥的菌株有18株，其中主要的耐藥類型為耐氟苯尼考，多重耐藥的菌株主要耐慶大霉素、復方新諾明、四環(huán)素等。

3 討論

本研究調查了寧夏地區(qū)羊源大腸埃希氏菌的耐藥情況。從108份樣品中分離出58株大腸埃希氏菌，分離率達53.7%，說明大腸埃希氏菌在寧夏羊群體中具有一定程度的流行。藥敏試驗結果表明，分離菌株中共有34株耐藥株，耐藥率達58.6%。有研究顯示，中國東南地區(qū)的大腸埃希氏菌耐藥率高于西北地區(qū)[11]。這種現(xiàn)象的產生可能與中國東南部地區(qū)抗生素的大量使用有關[12-13]。其中，對氟苯尼考、四環(huán)素、復方新諾明、磺胺異噁唑耐藥率最高。氟苯尼考是氯霉素的一種氟化衍生物，1996年被批準用于治療牛的呼吸道感染，之后被引入畜牧業(yè)。四環(huán)素的高耐藥率在中國其他地區(qū)和國外也有記錄。在我國，四環(huán)素被廣泛用于治療細菌性疾病和提高飼料轉化效率[14-15]。大腸埃希氏菌對磺胺類藥物的高度抗藥性也曾在中國報道過[16-17]，因為磺胺類藥物已經廣泛和連續(xù)使用了80多年，早在1950年就已有耐藥性的報道。其次，對恩諾沙星、慶大霉素、黏菌素也有耐藥性。喹諾酮類藥物耐藥的主要機制是染色體編碼，這是由于分子靶標(DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ)的改變[18]。而大腸埃希氏菌對黏菌素的耐藥性可能與攜帶耐藥基因的質粒水平轉移有關。58株大腸埃希氏菌均對安普霉素敏感。

表1 羊源大腸埃希氏菌對16種藥的藥敏試驗結果

表2 羊源大腸埃希氏菌的多重耐藥性

表3 羊源大腸埃希氏菌耐藥譜型

本研究通過分析58株大腸埃希氏菌對16種抗菌藥物的耐藥譜得知，16株菌對至少3類抗菌藥物都有耐藥性，表現(xiàn)為多重耐藥，其中五株菌對7種抗生素都有耐藥性。表明寧夏羊源大腸埃希氏菌存在一定程度的多重耐藥現(xiàn)象，這對臨床上正確、合理地選用抗菌藥物有一定參考意義。

臨床上藥物選擇、用藥劑量大多數(shù)情況下沒有科學依據(jù)，部分養(yǎng)殖場在飼料和飲水中濫用抗生素，這些是導致很多細菌耐藥的根本原因。因此，防止細菌的多重耐藥，一方面要引導養(yǎng)殖戶科學選藥、合理用藥，另一方面要嚴格把關飼料企業(yè)，禁止濫用抗生素作為飼料添加劑。另外，尋找抗生素的替代物，如一些中藥提取物，加強動物自身抵抗病菌能力也不失為防止濫用抗生素的好對策。

本研究對從寧夏羊源樣品中分離得到的58株大腸埃希氏菌進行了耐藥性檢測，通過分析其對16種抗菌藥物的耐藥譜得出，寧夏羊源大腸埃希氏菌存在一定程度的多重耐藥現(xiàn)象，迫切需要科學指導和法律法規(guī)來限制和合理使用抗菌藥物。