貓傳染性腹膜炎的診斷

郝振宇，蘭道亮，李成燚，李 鍵

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041)

貓傳染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，F(xiàn)IP)是一種貓科動(dòng)物致死性疫病。病原體是貓冠狀病毒(Feline coronavirus，F(xiàn)CoV)，有兩種不同的致病類型，根據(jù)生物型可區(qū)分為無癥狀或輕微腹瀉的貓腸道冠狀病毒(feline enteric coronavirus，F(xiàn)ECV)[1]和致命的貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV)[2]。

FCoV屬于尼多病毒目(Nidovirale)、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。FCoV基因組大小約為29 kb，由11個(gè)開放閱讀框(open reading frames，ORFs)組成，4個(gè)ORFs編碼結(jié)構(gòu)蛋白刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M、核衣殼蛋白N；5個(gè)ORFs編碼非結(jié)構(gòu)蛋白3a、3b、3c、7a、7b；2個(gè)ORFs編碼復(fù)制酶1a和1ab。根據(jù)血清型，F(xiàn)CoV可分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型FCoV被認(rèn)為是貓?zhí)禺愋远局?，但難以在體外培養(yǎng)；Ⅱ型FCoV是由Ⅰ型FCoV與犬冠狀病毒重組產(chǎn)生，容易在體外培養(yǎng)。

有研究表明，在持續(xù)感染FECV的貓中，大約有5%可能出現(xiàn)FIP[3,17]。在同一窩貓中收集到的FIPV和FECV毒株的序列相似性遠(yuǎn)高于不同窩的FCoV序列，經(jīng)過大量試驗(yàn)分析，科學(xué)家們提出目前普遍能接受的內(nèi)部變異理論為FIPV是由FECV持續(xù)感染過程中內(nèi)部突變而產(chǎn)生的。目前尚不清楚病毒具體的變異時(shí)間、部位以及變異方式[1-2]，已知FIPV變異與ORF3c基因[17]、S基因[19]、M基因[21]等一系列基因有關(guān)。

通過免疫組織化學(xué)染色的方法是確診貓傳染性腹膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)，然而該方法卻缺乏一定的操作性。又因?yàn)閱渭儥z出FCoV無法確診FIP，因此現(xiàn)階段對(duì)FIP的診斷往往是結(jié)合臨床檢查與實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果做出的綜合判斷。本綜述羅列出目前常見的FIP診斷方法，為臨床對(duì)FIP的診斷提供參考。

1 臨床檢查

由于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcrip-tion-polymerase chain reaction，RT-PCR)只能檢測(cè)出患貓?bào)w內(nèi)存在FCoV，卻無法區(qū)分到底是FECV還是FIPV，結(jié)合臨床檢查能更好的將普通的貓腹瀉與貓傳染性腹膜炎加以區(qū)分，對(duì)確診FIP提供臨床依據(jù)。

1.1 臨床癥狀檢查

FIP根據(jù)臨床癥狀有無滲出液可分為干性FIP、濕性FIP和混合性FIP。干性FIP主要表現(xiàn)為葡萄膜炎，葡萄膜顏色發(fā)生改變，房水閃輝[3]甚至是眼前房出血，另外伴隨共濟(jì)失調(diào)、癲癇、跛行甚至癱瘓等神經(jīng)癥狀；濕性FIP主要表現(xiàn)為腹腔積液，其腹腔積液抽出顏色往往偏黃色、澄清，部分較混濁，也有少數(shù)濕性FIP貓會(huì)出現(xiàn)胸腔積液，極少數(shù)出現(xiàn)心包積液；混合性FIP較為罕見，多數(shù)是干性到濕性或者濕性到干性的過渡階段，因此，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)濕性FIP發(fā)生神經(jīng)癥狀，而干性FIP出現(xiàn)腹腔積液[4]。

1.2 血常規(guī)和生化檢查

FIP患貓往往出現(xiàn)紅細(xì)胞、紅細(xì)胞比容、血紅蛋白的同步降低，部分患貓會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重貧血，這是因?yàn)椴《菊T導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡[5]。除此之外，淋巴細(xì)胞減少，單核細(xì)胞增加，同時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞會(huì)下降。

生化檢查中總蛋白含量會(huì)出現(xiàn)上升，并伴隨丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸(aspartic acid ，AST)同步上升。白蛋白與球蛋白的比值(A/G比)對(duì)于FIP有診斷價(jià)值， A/G比小于0.4時(shí)，高度懷疑FIP；而大于0.8時(shí)基本可以排除[6]。

FIP作為病毒感染的疾病，其引起的急性炎癥會(huì)導(dǎo)致血清淀粉樣蛋白(serum amyloid A，SAA)水平升高，另外α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein，AGP)同樣作為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，它的升高相較于SAA對(duì)FIP更具有診斷價(jià)值[7]。

1.3 影像學(xué)檢查

FIP患貓超聲檢查主要表現(xiàn)為肝臟出現(xiàn)膿腫，并呈現(xiàn)彌漫樣或局灶性低回聲；淋巴結(jié)腫大，出現(xiàn)低回聲；雙腎出現(xiàn)髓緣征[8]，皮髓質(zhì)分界不清，皮質(zhì)回聲增強(qiáng)，血清信號(hào)弱；腸系膜處可能存在高回聲團(tuán)塊；若為濕性FIP，胸/腹腔可能出現(xiàn)無回聲或者低回聲的胸/腹腔積液。

FIP患貓DR數(shù)字化X射線攝影檢查主要表現(xiàn)有胸腔積液，心包積液導(dǎo)致的心臟輪廓變大，肺結(jié)節(jié)及支氣管處周圍出現(xiàn)浸潤(rùn)，腹部顯示肝臟、脾臟、腎臟腫大[9]。

1.4 滲出液分析

FIP患貓滲出液往往偏黃色、澄清，部分較混濁是由于血液中含有較高的蛋白含量所呈現(xiàn)的蛋白凝塊，另外滲出液若呈現(xiàn)紅色或橘紅色或帶膿，或呈極異常黏稠狀，有些腹水散發(fā)腥臭味或其他異味，往往FIP檢出極低。

Rivalta試驗(yàn)(李凡他試驗(yàn))可區(qū)別腹水為滲出液或漏出液：用10 mL試管裝8 mL蒸餾水并滴加一兩滴98%的乙酸，并將樣本滴入試管內(nèi)，若反應(yīng)迅速消失，液體再次變回透明澄澈的狀態(tài)則為陰性。若樣本滴入試管內(nèi)，樣本保持原本性狀，漂浮在液體表面亦或是緩慢沉降則為陽性[10]。這是由于FIP滲出液不僅蛋白含量高，并且纖維蛋白原和炎癥介質(zhì)濃度也高，其多糖和蛋白質(zhì)復(fù)合物為酸性糖蛋白，當(dāng)在大量稀醋酸中呈白色沉淀。滲出液是由炎癥引起，往往區(qū)別由血管內(nèi)壓或血漿滲透壓而導(dǎo)致的漏出液。

1.5 組織病理學(xué)

尸檢往往可見，胸腔積液或心包積液，心肌肥大，纖維蛋白滲出導(dǎo)致的黏連；腹腔中也存在大量積液，液體無色或淡黃色，卵白狀，腹膜上纖維蛋白樣附著；肝臟、脾臟、腎臟會(huì)出現(xiàn)不同程度的腫大并有蛋白樣附著。

1.6 腦脊液檢查

對(duì)于一些干性FIP患貓常常會(huì)對(duì)腦脊液進(jìn)行取樣，通常可見混合性或化膿性炎癥，F(xiàn)IP腦脊液中蛋白含量增加，細(xì)胞增多[11]，也可見單核細(xì)胞浸潤(rùn)，然而，這些變化也可能出現(xiàn)在患有其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的貓身上，也有部分FIP引起的神經(jīng)癥狀，腦脊液分析結(jié)果卻正常[12]。

1.7 房水檢查

有報(bào)道，在確診為FIP的患貓中，高達(dá)29%的貓眼受到房水的影響，包括化膿性肉芽腫葡萄膜炎、非化膿性肉芽腫性葡萄膜炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，伴隨混合葡萄膜炎癥細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)[13]。

2 實(shí)驗(yàn)室檢查

第一種檢測(cè)抗FCoV病毒抗體的方法是1976年建立起來的[14]。目前有多種不同的檢測(cè)方法，包括間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect fluorescence antibody test，IFAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)、免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry，ICC)、RT-PCR等，理想的檢測(cè)應(yīng)適用于不同的液體[15]，如血清、滲出液、腦脊液或房水，同時(shí)應(yīng)允許小樣本量，并且具有較高的靈敏度和特異性。

2.1 間接免疫熒光試驗(yàn)

通過將FCoV抗體進(jìn)行熒光素的標(biāo)記，然后進(jìn)一步將其作為分子探針檢查患貓?bào)w內(nèi)的對(duì)應(yīng)的抗原，抗原-抗體復(fù)合物中第一抗體結(jié)合，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光。IFAT比直接法敏感度提高5倍～10倍，缺點(diǎn)是易產(chǎn)生非特異性熒光[16]。

Sparkes A H等[17]的一項(xiàng)研究表明，血液中IFAT的敏感性為28%，特異性為64%，雖然在后面的研究[18]中 ，IFAT具有85%的敏感性和57%的特異性，但是顯然這個(gè)結(jié)果差強(qiáng)人意。隨著疾病的發(fā)展，血液中檢測(cè)出病毒滴度的可能升高，這也許是FECV的再度感染，而非FIP的指標(biāo)。積液中抗體檢測(cè)的敏感性為86%，特異性為65%[18]，相比血液對(duì)于FIP的診斷更具參考價(jià)值，但是無法作為確診FIP的依據(jù)。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

非保護(hù)性抗體的產(chǎn)生和免疫復(fù)合物的形成是FIP貓典型的免疫介導(dǎo)性病變形成的關(guān)鍵特征，在FCoV感染貓的血清和積液中均可檢測(cè)到循環(huán)免疫復(fù)合物。與組織病理學(xué)對(duì)照， ELISA檢測(cè)血清免疫復(fù)合物診斷FIP的敏感性為48%，特異性為91%[18]。其他研究證實(shí)，在沒有FIP的健康貓中存在FCoV特異性免疫復(fù)合物[14]。因此，有人認(rèn)為在感染FECV的貓中，盡管只有一段有限的時(shí)間，免疫復(fù)合物似乎也在循環(huán)。

2.3 免疫組化/免疫細(xì)胞化學(xué)

1989年首次報(bào)道了通過印跡涂片的免疫熒光染色在貓的瞬膜上皮細(xì)胞中檢測(cè)到FCoV病毒抗原[19]，隨后，在組織病理學(xué)確診的FIP貓中，IHC檢測(cè)的敏感性高達(dá)97%～100%[20-21]。然而在許多情況下，IHC只能在死后進(jìn)行，因?yàn)橥ㄟ^剖腹或腹腔鏡采集死前組織樣本是一種侵入性的行為，對(duì)患病的貓來說將會(huì)面臨巨大的風(fēng)險(xiǎn)。雖然使用由微創(chuàng)超聲引導(dǎo)的細(xì)針穿刺(fine needle aspiration，F(xiàn)NC)可以獲得肝、腎或淋巴結(jié)樣本[22]，但是對(duì)其進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)敏感性較低。

采用免疫熒光染色檢測(cè)胸腔積液或腹腔積液中的FCoV抗原，在早期的研究中[23]，這項(xiàng)測(cè)試具有100%的特異性，但根據(jù)近年的調(diào)查結(jié)果顯示，對(duì)由FIP以外的其他疾病引起的積液的貓進(jìn)行免疫熒光或ICC的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沒有FIP的貓身上檢測(cè)到FECV[24-25]。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

根據(jù)長(zhǎng)期存在的假設(shè)，F(xiàn)ECV僅存在于腸道內(nèi)，所以通過RT-PCR在血液或除胃腸道以外的任何其他體液或組織中檢測(cè)到的RNA表明存在FIPV。然而，這一假設(shè)已經(jīng)被大量研究駁斥。眾所周知，患有FIP的貓比FECV感染貓表現(xiàn)出更高的病毒載量[15,26-28]。所以，理想的RT-PCR方法不僅需要擴(kuò)增FCoV，還應(yīng)該能夠量化病毒載量。

在FIP貓中，只有在有炎癥變化的組織中才能發(fā)現(xiàn)大量的FCoV RNA。病毒載量最高的器官是大網(wǎng)膜、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟，這些組織對(duì)RT-PCR分析最有用。相比之下，腎、肝、肺、心肌和窩淋巴結(jié)幾乎不含有病毒RNA[42]。在有積液的FIP貓中，積液中的病毒載量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血液中的病毒載量[29]，并且PCR結(jié)果有較好的敏感性與特異性(大部分都可以達(dá)到90%以上)，對(duì)于積液的RT-PCR檢查已然成為臨床最常用的檢測(cè)手段[30]。

2.5 FCoV病毒變異的檢測(cè)

FCoV S蛋白負(fù)責(zé)病毒細(xì)胞的進(jìn)入，它包括受體結(jié)合亞基(S1)和介導(dǎo)膜融合的亞基(S2)[31]。FCoV S基因的突變、S2區(qū)更具特異性的突變以及S蛋白中相應(yīng)的氨基酸替換被認(rèn)為是導(dǎo)致病毒細(xì)胞嗜性改變的原因[32-33]。因此，只有FIPV而不是FECV能夠在巨噬細(xì)胞中高效和持續(xù)地復(fù)制，產(chǎn)生大量病毒顆粒，并將感染傳播到鄰近細(xì)胞。S基因?qū)τ诖_定哪些突變導(dǎo)致FECV向FIPV的轉(zhuǎn)變特別有意義。

對(duì)來自健康貓糞便和FIP貓組織(或腹水)的大量FCoV的S基因進(jìn)行了序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)2個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nuclotide polymorphism，SNP)，這些SNP位于S基因內(nèi)的23531和23537位核苷酸。在所有已測(cè)序的健康貓糞便FCoV病毒中，腺嘌呤位于23531位核苷酸，而92%的FIP貓腹水或組織中檢出胸腺嘧啶或胞嘧啶，該SNP均導(dǎo)致S蛋白融合肽(M1058L)中1058位氨基酸的亮氨酸取代蛋氨酸[28]；健康貓糞便FCoV中，胸腺嘧啶都在第2個(gè)核苷酸位置23537被檢測(cè)到，而94%的FIP貓腹水或組織中含有鳥嘌呤，該SNP導(dǎo)致S蛋白(S1060A)1060位絲氨酸替代丙氨酸[32,34]。

根據(jù)上述結(jié)論，在原先RT-PCR的基礎(chǔ)上，建立套式RT-PCR[33]，對(duì)S基因23531和23537位核苷酸進(jìn)行局部擴(kuò)增，檢測(cè)FCoV是否出現(xiàn)變異是目前較為準(zhǔn)確的FIP診斷方法。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，無論何種樣本，IFAT和ELISA這種針對(duì)FCoV病毒抗體檢測(cè)的方法不能用于FIP的診斷，應(yīng)該采用可以有效檢測(cè)病毒載量的熒光定量RT-PCR。另外，RT-PCR的樣本，滲出液應(yīng)該優(yōu)先于腦脊液、房水，而血液的參考價(jià)值并不高，對(duì)于沒有滲出液的FIP貓，也可以采取細(xì)針穿刺活檢(fine needle aspiration，F(xiàn)NA)采集組織樣本。對(duì)于組織樣本來說，免疫組化可以作為FIP診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但不建議采用FNA，而是需要剖腹/腹腔鏡來獲取組織樣本。

完整的FIP診斷流程應(yīng)包括臨床檢查、RT-PCR和S基因變異檢查等，對(duì)臨床檢查結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)的患貓，根據(jù)有無積液進(jìn)一步采樣進(jìn)行RT-PCR(最好是RT-qPCR)，再結(jié)合S基因變異陽性結(jié)果進(jìn)行確診，若低病毒載量且S基因未變異則需要采用免疫組化或組織病理學(xué)確診?？偨Y(jié)以上診斷思路，做出如下診斷流程圖供獸醫(yī)師參考(圖1)。

圖1 FIP診斷流程

盡管目前對(duì)于貓傳染性腹膜炎的發(fā)病機(jī)制和免疫機(jī)制尚不明確，也沒有一個(gè)簡(jiǎn)單高效的檢測(cè)方法，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，伴侶動(dòng)物在人民生活中的地位逐漸升高，貓傳染性腹膜炎作為一個(gè)貓科動(dòng)物高致死疾病，今后一定會(huì)得到更多學(xué)者的重視與研究。相信在不久的將來，該病的發(fā)病機(jī)制和免疫機(jī)制會(huì)被攻克，屆時(shí)就會(huì)出現(xiàn)更多更好的診斷方法。