余 航,劉洋銓,吳瑞可,王 靜,何麗芳,黃樹武,張 暉,閔凡貴*
(1.佛山科學技術學院 生命科學與工程學院,廣東佛山 528231;2.廣東省實驗動物監(jiān)測所 廣東省實驗動物重點實驗室,廣東廣州 510000)
恒河猴和食蟹猴作為生物醫(yī)學研究重要的模式動物,是當前世界上用量最大的非人靈長類實驗動物,病毒感染會損害其健康以及影響生物醫(yī)學研究的結果,被感染的動物也會對從業(yè)人員構成潛在的威脅,因此,監(jiān)測恒河猴和食蟹猴群體的病毒感染是一項重要任務[1]。猴T淋巴細胞趨向性病毒1型(Simian T-lymphotropic virus 1,STLV-1)為逆轉錄病毒科、正逆轉錄病毒亞科、δ逆轉錄病毒屬的成員,主要侵害猴的免疫系統(tǒng),可導致惡性淋巴瘤、淋巴組織增生等疾病[2-3]。猴感染STLV-1后多數情況下表現(xiàn)為潛伏感染,很難觀察到臨床癥狀[4-5],從而增加了該病毒在猴群中的傳播。國家標準GB 14922.2-2011《實驗動物微生物學等級及監(jiān)測》規(guī)定無特定病原體猴必須排除STLV-1感染,因此在人工繁育過程中長期對猴群進行STLV-1監(jiān)測具有重要意義[6]。
國內的實驗猴養(yǎng)殖場主要分布于廣東、海南、廣西、云南、河南省等省份,主要養(yǎng)殖的實驗猴種類為恒河猴和食蟹猴。因此,本研究通過對國內不同省份的主要猴場進行采樣調查STLV-1的感染狀況,以期獲得重要臨床數據,為實驗猴生產、使用機構以及標準的制(修)訂提供參考。
1.1.1 血樣 實驗猴血液樣品共計752份,詳細信息見表1,采血后低溫運輸至實驗室,離心后收集血清,置-80℃保存。
1.1.2 主要試劑 猴T淋巴細胞趨向性病毒1型抗體檢測試劑盒,購自蘇州西山生物技術有限公司,批號為20210428。
1.1.3 主要儀器 微量高速離心機(TG16-W),湖南湘儀離心機儀器有限公司產品;洗板機(BIO-RAD 1575),伯樂生命醫(yī)學產品有限公司產品;酶標儀(Multiskan FC),賽默飛世爾科技有限公司產品。
1.2.1 血樣的檢測及判定 按照試劑盒內所提供的說明書進行實驗操作與結果判定。試劑盒Cutoff值為OD405 nm=0.3,初次檢測樣品OD405 nm值在0.25~0.60之間的血清樣品進行復檢,第2次檢測OD405 nm值≥0.3判為陽性,OD405 nm值<0.3判為陰性。
1.2.2 統(tǒng)計分析 結果采用Microsoft Excle以及SPSS軟件統(tǒng)計分析,使用Graphpad Prism作圖,群體抗體OD405 nm值采用“平均值±標準差”表示,組間感染率比較采用非參數檢驗進行,P<0.05表示差異顯著。
采用ELISA試劑盒測定752份猴血清STLV-1抗體水平,ELISA反應結束后用酶標儀讀取OD 405 nm值,檢測結果分布見圖1,其中云南組樣品檢測的OD值最高(1.02±1.79),其次是廣東B組(0.59±1.24),廣東A組和海南組居中(分別為0.25±0.57和0.22±0.55),廣西組和河南組樣品OD值均較低(平均值均為0.10)。
表1 實驗猴血清樣本信息
A.廣東A; B.廣東B; C.云南;D.海南;E.廣西;F.河南。
依據試劑盒Cutoff值及可疑樣本復檢結果判定不同來源實驗猴群體的感染率,結果見表2,不同來源實驗猴群的感染率存在較大差異,其中,云南組的感染率最高,達到25%,其次是廣東B組,感染率為13.5%,廣東A組和海南組均為5%,河南組為3.13%,廣西組未檢出陽性個體。
進一步采用費希爾精確檢驗(Fisher’s exact probability test) 進行組間陽性率比較,結果見表3,其中云南組陽性率顯著高于其他組別(P<0.05),廣東B組陽性率顯著高于廣東A組與海南組(P<0.05),其他組別間陽性率無顯著差異(P>0.05)。
表2 不同猴場STLV-1抗體檢測結果
表3 不同猴場STLV-1抗體陽性率比較
將檢測結果按照猴種屬分組比較,結果見表4。食蟹猴血清抗體OD值為0.89±1.69(n=520),恒河猴血清抗體OD值為0.37±0.89(n=232),感染率分別為8.10%和21.98%,卡方檢驗(chi-square test)結果顯示,食蟹猴STLV-1陽性率顯著低于恒河猴(P<0.0001)。
表4 食蟹猴與恒河猴感染情況比較
STLV-1可通過血液、性接觸、打斗撕咬等方式在非人靈長類動物中傳播,且有少數證據表明,STLV-1也可感染人類[7],這給從業(yè)人員的身體健康造成了潛在的威脅,加強對該病毒的日常監(jiān)測具有重要意義。
不同國家和地區(qū)猴STLV-1感染情況存在較大差異,其中日本部分地區(qū)散養(yǎng)獼猴的感染率可達64%,圈養(yǎng)獼猴可達55%~77%[8]。德國部分地區(qū)圈養(yǎng)恒河猴STLV-1感染血清陽性率在10%左右[1]。在本研究中,國內不同猴場實驗猴STLV-1感染率差異較大,其中云南猴場的感染率最高,達到25%,顯著高于廣東、海南、河南、廣西等地的實驗猴。其次是廣東境內的猴場,感染率為5%~13.5%,海南與河南境內猴場的檢出率較低,分別為5%和3.13%,廣西猴場未檢出。廣西猴場未檢測出STLV-1陽性個體,這可能與采樣量少有關。朱林等曾通過PCR(polymerase chain reaction)方法對云南省內人工飼養(yǎng)恒河猴進行STLV-1的檢測,顯示群體STLV-1感染率為13.38%[4]。這提示我們日常生產中可將該病毒的核酸檢測與抗體檢測結合起來,以獲得更加精準的流行病學資料,從而有利于該病毒的凈化和SPF猴群的建立。作為實驗猴養(yǎng)殖大省,廣東省人工養(yǎng)殖食蟹猴STLV-1的陽性率也較高,為5%~13.5%。研究結果提示,日常生產中需加強對云南省與廣東省實驗猴STLV-1感染情況的監(jiān)測,以及時淘汰陽性個體、減少經濟損失,同時為實驗猴生產以及生命科學研究提供保障。
饒軍華等對食蟹猴以及恒河猴進行檢測后發(fā)現(xiàn)食蟹猴的STLV-1感染率高于恒河猴[9],而本次研究結果表明,恒河猴的STLV-1感染率明顯高于食蟹猴(P<0.05),這可能與檢測樣本來源以及樣本量有關,但食蟹猴與恒河猴本身對該病毒的易感性是否存在差異需要進一步研究確定。此外,進行檢測的動物年齡、性別等也會影響STLV-1的感染率檢測結果[10],這提示需要進一步加強對該病毒的檢測,以獲得更加準確的流行病學統(tǒng)計資料,為實驗猴繁育和應用提供技術支撐。
綜上所述,本研究通過對國內不同地區(qū)人工養(yǎng)殖食蟹猴與恒河猴STLV-1抗體檢測分析,獲得了重要的技術資料,為實驗猴人工繁育以及生物凈化提供了參考數據。