山東、河南、河北驢群馬動(dòng)脈炎病毒和馬皰疹病毒8型的檢測(cè)與分析

王彤彤，黃澤統(tǒng)，陳 麗，郭瑞宏，董宇婷，劉文強(qiáng)，劉桂芹，王長(zhǎng)法，任慧英，李亮亮*

(1.聊城大學(xué)毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東聊城 252000；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109)

近年來(lái)伴隨著國(guó)內(nèi)驢產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，規(guī)模化養(yǎng)驢基地在山東、河北、河南等多個(gè)省份不斷增多，驢群的疫病逐漸增加。其中，呼吸道疾病、繁殖率低、流產(chǎn)和死胎等疾病嚴(yán)重困擾驢產(chǎn)業(yè)，每年給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。相關(guān)研究報(bào)道，馬動(dòng)脈炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)和馬皰疹病毒8型(Equine herpesvirus 8，EHV-8)感染可引起馬屬動(dòng)物出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病和繁殖障礙等疾病。

EAV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒科?；蚪M長(zhǎng)度為12.7 kb，主要包含8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和至少13個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。ORF7基因序列高度保守，可用于檢測(cè)EAV[2]。EAV主要通過(guò)呼吸道和生殖道途徑感染，主要導(dǎo)致馬屬動(dòng)物呼吸困難和繁殖障礙(包括流產(chǎn)、產(chǎn)弱駒)等[3]。感染EAV的公馬或驢會(huì)終生帶毒。該病嚴(yán)重危害馬屬動(dòng)物的健康，給馬屬動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。該病毒于1953年在美國(guó)俄亥俄州的馬流產(chǎn)胎兒中首次被分離，命名為Bucyrus毒株。2017年，智利研究人員從南美洲驢群中分離到EAV(命名為Atacama-2014)[4]。國(guó)內(nèi)學(xué)者前期對(duì)新疆和貴州的馬場(chǎng)展開(kāi)調(diào)查研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EAV感染在新疆和貴州馬場(chǎng)處于散發(fā)狀態(tài)，但目前為止，國(guó)內(nèi)規(guī)?；H場(chǎng)尚無(wú)EAV的相關(guān)報(bào)道。

EHV-8是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，屬于α皰疹病毒亞科。其基因組全長(zhǎng)約150 kb，包含80個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼76個(gè)蛋白[5]，由ORF70基因編碼的gG蛋白在馬皰疹病毒同系中存在較大差異，因此gG蛋白被用作α皰疹病毒之間的分子標(biāo)記。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EHV-8的感染可導(dǎo)致馬屬動(dòng)物出現(xiàn)呼吸癥狀和流產(chǎn)現(xiàn)象，嚴(yán)重危害馬屬動(dòng)物的健康[6]。1987年，澳大利亞科研人員首次從驢鼻腔組織中分離到該病毒；2010年，國(guó)內(nèi)科研人員首次從馬分離到EHV-8 wh毒株；2020年以色列學(xué)者首次從成年公驢體內(nèi)分離到EHV-8 351076/2019毒株[7]。我們團(tuán)隊(duì)前期首次從病死驢肺臟組織中分離獲得1株驢源EHV-8[8]，然而，國(guó)內(nèi)規(guī)?；H場(chǎng)EHV-8的流行情況仍不清楚。

本研究于2020年從山東、河南、河北規(guī)?；H場(chǎng)和屠宰場(chǎng)隨機(jī)采集血樣，采用RT-PCR和PCR方法對(duì)采集血樣的EAV和EHV-8進(jìn)行檢測(cè)，分析EAV和EHV-8在上述地區(qū)驢群中的流行情況，以期為規(guī)?；H場(chǎng)EAV和EHV-8的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2020年期間，分別從山東省、河南省、河北省的規(guī)模化驢場(chǎng)和屠宰場(chǎng)共采集驢血860份，血液收集在內(nèi)含促凝劑的真空采集管中，低溫保存，返回實(shí)驗(yàn)室后立即以3 000 r/min離心5 min，將血清轉(zhuǎn)移至離心管中，置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒(R4174-02)，美基生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒(DP214-02)，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT reagent Kit、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、DNA Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；pTOPO載體，艾德萊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(TC-96/G/H)，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；低溫超高速離心機(jī)(5910R)，Eppendorf公司產(chǎn)品；生化恒溫培養(yǎng)箱(SPX-100B-Z)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；垂直層流潔凈工作臺(tái)(HCB-1300V)，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀(DYCP-32B)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS)，Biorad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的EAV(DQ846750)ORF7基因序列以及我們團(tuán)隊(duì)前期分離的EHV-8毒株序列(MW816102)ORF70部分基因序列設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)EAV和EHV-8的引物，對(duì)臨床樣品進(jìn)行病原核酸檢測(cè)。引物由華大基因科技有限公司合成。引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.2 核酸提取 取200 μL驢血清，利用病毒DNA/RNA提取試劑盒同時(shí)提取血清的DNA和RNA。

1.2.3 病原的RT-PCR/PCR檢測(cè) 提取的驢血清病毒RNA首先借助反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit生成cDNA，體系為：RNA 2 μg，RT Mix 4 μL，再加入DEPC水補(bǔ)齊至20 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃ 20 min；85℃ 5 s；4℃終止反應(yīng)。以cDNA作為模板，用EAVORF7基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時(shí)，以提取的驢血清病毒DNA作為模板，EHV-8ORF70基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系均為：上、下游引物各1 μL，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶0.5 μL，5×PrimeSTAR GXL緩沖液5 μL，dNTP 混合物2 μL，模板2 μL(無(wú)菌水作為陰性對(duì)照模板)，最后用ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸80 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物借助15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。預(yù)期EAVORF7基因擴(kuò)增的目的片段大小為333 bp， EHV-8ORF70基因擴(kuò)增的目的片段大小為316 bp。

1.2.4 測(cè)序 將擴(kuò)增出的EAVORF7基因目的片段和EHV-8ORF70基因目的片段通過(guò)膠回收進(jìn)行純化，連接至pTOPO載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，最后將鑒定陽(yáng)性的菌液送至華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)整理與病原遺傳進(jìn)化分析 對(duì)采集的河北省、河南省、山東省的驢血清EAV和EHV-8分別統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性數(shù)、陽(yáng)性率以及混合感染率。利用DNA Star軟件的EditSeq程序編輯測(cè)序得到的EAVORF7基因和EHV-8ORF70基因以及參考毒株的基因序列，利用MegAlign程序分別對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)，并分析其同源性。利用分子進(jìn)化遺傳分析(Mega 6.0)軟件，分別對(duì)ORF7和ORF70基因的部分序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 病原RT-PCR/PCR檢測(cè)結(jié)果

將收集的驢血清利用試劑盒提取DNA和RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用EAVORF7基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，獲得一條約333 bp的目的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。

同時(shí)，將提取的DNA使用EHV-8ORF70基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，目的片段大小約316 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。

2.2 檢測(cè)數(shù)據(jù)整理

2.2.1 驢場(chǎng)EAV檢測(cè)結(jié)果 2020年期間，從屠宰場(chǎng)采集的驢血清樣品共358份，來(lái)源于河北省96份，河南省110份，山東省152份；另外從河北省、河南省和山東省驢場(chǎng)分別采集的血清樣品共502份，其中河北省60份(取自1個(gè)驢場(chǎng))；河南省180份(取自2個(gè)驢場(chǎng))，山東省262份(取自4個(gè)驢場(chǎng))。病原檢測(cè)結(jié)果顯示，860份驢血清中EAV檢出率為5.7%，其中，河北省驢場(chǎng)EAV陽(yáng)性樣品共3份，屠宰場(chǎng)EAV測(cè)陽(yáng)性樣品共2份，總陽(yáng)性率為3.2%；河南省驢場(chǎng)EAV陽(yáng)性樣品共9份，屠宰場(chǎng)EAV陽(yáng)性樣品共5份，總陽(yáng)性率為4.8%；山東省驢場(chǎng)EAV陽(yáng)性樣品共20份，屠宰場(chǎng)EAV陽(yáng)性樣品共10份，總陽(yáng)性率為7.2%。山東省檢出EAV的陽(yáng)性率最高，結(jié)果見(jiàn)表2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.陰性對(duì)照；2.驢血清

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.陰性對(duì)照；2.驢血清

2.2.2 驢場(chǎng)EHV-8檢測(cè)結(jié)果 對(duì)2020年期間采集的驢血清同時(shí)進(jìn)行EHV-8檢測(cè)，結(jié)果顯示，河北省、河南省和山東省的驢血清中EHV-8檢出率為19.7 %，其中，河北省驢場(chǎng)EHV-8陽(yáng)性樣品共15份，屠宰場(chǎng)EHV-8陽(yáng)性樣品共11份，總陽(yáng)性率為16.7%；河南省驢場(chǎng)EHV-8陽(yáng)性樣品共48份，屠宰場(chǎng)EHV-8陽(yáng)性樣品共5份，總陽(yáng)性率為18.3%；山東省驢場(chǎng)EHV-8陽(yáng)性樣品共74份，屠宰場(chǎng)EHV-8陽(yáng)性樣品共16份，總陽(yáng)性率為21.7%。山東省EHV-8陽(yáng)性率最高，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.3 驢場(chǎng)EAV和EHV-8混合感染情況 2020年期間，河北省、河南省和山東省的驢血清中EAV和EHV-8混合感染有16份，占檢測(cè)總份數(shù)的1.9%，其中，山東省檢出EAV和EHV-8混合感染率最高，共10份，檢出率為2.4%，河北省和河南省分別檢出1份和5份，檢出率為0.6%和1.7%，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3 驢場(chǎng)EAV和EHV-8遺傳進(jìn)化分析

將PCR擴(kuò)增的目的片段條帶進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，從河北省、河南省、山東省擴(kuò)增獲得的EAVORF7基因序列HBAV、HNAV、SDAV分別與參考毒株EAV Bucyrus(GenBank登錄號(hào)：DQ846750)、EAV(GenBank登錄號(hào)：NC-002532)、EAV(GenBank登錄號(hào)：X53459)、KY84 field strain(GenBank登錄號(hào)：MG137429)、KY84-Stallion-E84(GenBank登錄號(hào)：MG137432)、KY84-L137B-S5(GenBank登錄號(hào)：MG137445)ORF7基因的同源性分別為97.9%～100%，99.7%～100%，99.7%～100%，其中，HBAV、HNAV、SDAV與EAV Bucyrus的同源性最高，均為100%(圖3A)；基于ORF7基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，9株馬動(dòng)脈炎病毒形成了兩個(gè)大分支。HBAV、HNAV、SDAV與3株參考株(EAV Bucyrus-DQ846750、EAV NC-002532、EAV-X53459)的ORF7基因形成一個(gè)大分支，且與EAV Bucyrus的ORF7基因處于同一個(gè)小分支(圖3B)。進(jìn)一步證實(shí)了HBAV、HNAV、SDAV均與EAV Bucyrus株的ORF7基因親緣關(guān)系較近。

從河北省、河南省、山東省擴(kuò)增獲得的EHV-8ORF70基因部分序列HBHV、HNHV、SDHV分別與EHV-8 IR/2010/16(GenBank登錄號(hào)：MF431613)、EHV-8 IR/2010/47(GenBank登錄號(hào)：MF431612)、EHV-8 SDLC66(GenBank登錄號(hào)：MW816102)、EHV-8 wh(GenBank登錄號(hào)：JQ343919)、EHV-8-IR/2003/19(GenBank登錄號(hào)：MF431611)、EHV-8 IR/2015/40(GenBank登錄號(hào)：MF431614)毒株的ORF70基因?qū)?yīng)序列同源性為99.4%～99.7%，99.7%～100%，99.7%～100%(圖4A)；基于ORF70基因部分序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，9株馬皰疹病毒形成了兩個(gè)大分支，HNHV、SDHV與4株參考株(EHV-8 IR/2010/47-MF431612、EHV-8-IR/2003/19-MF431611、EHV-8 IR/2015/40-MF431614、EHV-8 wh-JQ343919)在同一個(gè)大的分支上，而HBHV與EHV-8 SDLC66-MW816102和EHV-8 IR/2010/16-MF431613毒株在另一個(gè)大的分支上，并且HBHV、HNHV、SDHV分別與EHV-8 IR/2010/16-MF431613、EHV-8 IR/2010/47、EHV-8 wh-JQ343919處于同一小分支(圖4B)。以上結(jié)果說(shuō)明HBHV與EHV-8 IR/2010/16-MF431613親緣關(guān)系最近、HNHV與EHV-8 IR/2010/47-MF431612親緣關(guān)系最近，SDHV與EHV-8 wh-JQ343919親緣關(guān)系最近。

表2 EAV檢測(cè)結(jié)果

表3 EHV-8檢測(cè)結(jié)果

表4 混合感染檢測(cè)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，伴隨著人們生活水平不斷提高，對(duì)阿膠、驢肉、驢奶的需求不斷增加，規(guī)?；B(yǎng)驢基地不斷出現(xiàn)、驢的疾病特別是傳染病的威脅對(duì)養(yǎng)驢業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生重大影響。尤其是驢呼吸系統(tǒng)疾病和繁殖障礙(妊娠驢流產(chǎn))已成為困擾養(yǎng)驢業(yè)持續(xù)發(fā)展的重大難題[9，10]。

本研究采用RT-PCR和PCR方法對(duì)2020年采自河北省、河南省和山東省的860份驢血樣進(jìn)行EAV和EHV-8 2種病原檢測(cè)，結(jié)果顯示，3個(gè)省份均檢測(cè)到EAV和EHV-8，說(shuō)明河北省、河南省和山東省規(guī)?；H場(chǎng)均存在EAV和EHV-8感染。分析2種病原的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，EHV-8感染總陽(yáng)性率高達(dá)19.7%，而馬動(dòng)脈炎病毒存在較少，僅有5.7%，2種病原混合感染的檢出率在1.9%，由此可見(jiàn)，目前EHV-8可能是危害驢產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要病原。相關(guān)研究報(bào)道，EHV-8的感染可導(dǎo)致馬屬動(dòng)物出現(xiàn)呼吸癥狀和流產(chǎn)現(xiàn)象，我們團(tuán)隊(duì)前期已從病驢肺臟分離1株EHV-8毒株[8]，并且EHV-8感染是否與驢的呼吸系統(tǒng)和繁殖障礙密切關(guān)聯(lián)正在進(jìn)行相關(guān)研究。另外，本研究檢測(cè)到EAV與EHV-8混合感染，驢感染EAV存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)镋AV屬于動(dòng)脈炎病毒科，與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)同屬于一個(gè)科，很可能會(huì)引起驢群大面積發(fā)病，誘發(fā)群體產(chǎn)生免疫抑制，導(dǎo)致其他病原的致病性增強(qiáng)[11，12]。因此，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期消毒有利于驢群的健康成長(zhǎng)。

圖3 EAV ORF7基因核酸序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

圖4 EHV-8 ORF70基因核酸序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

遺傳進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，分別從3個(gè)省份取1份樣品作為代表擴(kuò)增的HBAV、HNAV和SDAV均與EAV Bucyrus毒株的親緣關(guān)系最近，Bucyrus屬于美國(guó)毒株；擴(kuò)增的HBHV、HNHV和SDHV 分別與EHV-8 IR/2010/16-MF431613、EHV-8 IR/2010/47-MF431612、EHV-8 wh-JQ343919親緣關(guān)系最近，其中，EHV-8 IR/2010/16-MF431613、EHV-8 IR/2010/47-MF431612屬于愛(ài)爾蘭毒株，EHV-8 wh-JQ343919屬于國(guó)內(nèi)毒株，不同的感染來(lái)源可能與國(guó)內(nèi)和國(guó)際貿(mào)易交易，或者通過(guò)其他物品間接攜帶感染有關(guān)[13]。通過(guò)對(duì)該些省份規(guī)?；H場(chǎng)中2種病毒流行情況的調(diào)查，以期為規(guī)?；H場(chǎng)的健康養(yǎng)殖提供參考。

綜上所述，國(guó)內(nèi)規(guī)?；H場(chǎng)存在皰疹病毒8型感染的情況較多，鑒于該病毒傳播流行較快的風(fēng)險(xiǎn)，需加強(qiáng)消毒工作和飼養(yǎng)管理，做好臨床防控工作。另外，針對(duì)馬動(dòng)脈病毒感染較少，在局部呈現(xiàn)散發(fā)狀態(tài)，臨床上應(yīng)該加強(qiáng)定期檢疫，及時(shí)淘汰EAV陽(yáng)性驢個(gè)體。