奶牛乳房炎源鏈球菌裂解噬菌體的分離鑒定

吳子文，王輝翔，張 琪，屈勇剛*，梁 晏，常軍帥，易 鵬，俞佳輝，梁成哲

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

奶牛乳房炎嚴(yán)重影響奶牛業(yè)發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，全球約有2.2億頭奶牛，其中患乳房炎奶牛占總數(shù)的1/3，每年因各種類(lèi)型的乳房炎造成的損失高達(dá)上百億美元[1]。奶牛患乳房炎的主要原因是受到病原微生物的侵襲，150多種病原微生物可導(dǎo)致泌乳奶?；既榉垦?，其中鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一[2-3]。目前，抗生素是治療奶牛乳房炎常用的藥物，由于人們過(guò)度使用或誤用抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，還嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生安全，威脅人類(lèi)健康[4]。賈文博等[5]對(duì)從15個(gè)奶牛場(chǎng)采集的300份乳房炎奶牛的乳樣經(jīng)藥敏分析發(fā)現(xiàn)，所分離到的鏈球菌對(duì)氨基糖類(lèi)藥物的耐藥性為100%，對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物的耐藥性均超過(guò)90%?？股丿煼ǜ弊饔玫闹饾u凸顯，已難以達(dá)到理想治療效果[6]。所以急需尋找一種新型治療方式，既能有效地防治奶牛乳房炎，又能解決現(xiàn)有抗生素藥物帶來(lái)的一些弊端與危害[7]。

噬菌體(phage)是一種侵襲細(xì)菌的病毒，通過(guò)內(nèi)溶素抑制肽聚糖的合成或利用穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)水解肽聚糖來(lái)完成殺死細(xì)菌的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體可用于治療各種抗生素耐藥病原體引起的疾病，治愈率高達(dá)80%～95%[8]。肖峰[9]研究報(bào)道，金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysGH15對(duì)金黃色葡萄球菌造成的小鼠乳房炎模型表現(xiàn)出良好的治療效果。本研究以奶牛乳房炎源鏈球菌為宿主菌，從奶牛場(chǎng)的糞便和污水中分離得到一株裂解性肌尾噬菌體，采用雙層瓊脂平板法對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性分析，以期為奶牛乳房炎的防治提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和樣品的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)室分離并保存的33株奶牛乳房炎源致病性鏈球菌為本次實(shí)驗(yàn)的宿主菌。采集石河子地區(qū)某奶牛場(chǎng)的糞便、奶牛生活用水和污水，將其充分混勻作為噬菌體的來(lái)源。

1.1.2 主要試劑 BHI培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；病毒基因DNA/RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；SM緩沖液，葉源有限公司產(chǎn)品；PEG8000、20 g/L磷鎢酸復(fù)染液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 透射電子顯微鏡(HT7700),日立(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Multifuge X1R)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；立式恒溫振蕩器(IS-RDV1)，美國(guó)精騏有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離、篩選及純化 將采集到的混合溶液經(jīng)過(guò)8層紗布、雙層濾紙和0.22 μm微孔濾膜逐次過(guò)濾。將所得濾液加入到BHI培養(yǎng)基中，并向其中加入33株鏈球菌的菌懸液各1 mL，在37℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 h，將混合液在1 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液分別加入到預(yù)先準(zhǔn)備的33支試管中，再向每個(gè)試管中分別加入不同鏈球菌的菌懸液100 μL,充分混勻靜置15 min，采用雙層瓊脂平板法培養(yǎng)12 h，觀察生長(zhǎng)情況。篩選出可以看到噬菌斑的平板，在該平板中取一個(gè)形態(tài)、大小相似的噬菌斑接種到相應(yīng)的宿主菌培養(yǎng)液中，在37℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 h。取10倍倍比稀釋的噬菌體上清液與菌液混勻吸附15 min，采用雙層瓊脂平板法觀察噬菌斑大小、形態(tài)，重復(fù)該步驟3次以上，直至平板上噬菌斑大小相近、形態(tài)一致。

1.2.2 噬菌體的濃縮及透射電子顯微鏡的觀察 噬菌體的濃縮采取PEG沉淀法[10]，得到噬菌體濃縮液(噬菌體濃縮液的效價(jià)不低于1.0×1010PFU/mL)，取10 μL濃縮后的噬菌體液滴加在銅網(wǎng)上并作用15 min，多余的水分使用濾紙吸出，染色選用20 g/L磷鎢酸作用30 min,等待干燥后,通過(guò)透射電子顯微鏡觀察。

1.2.3 噬菌體的核酸類(lèi)型鑒定 采用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取噬菌體基因，將提取的噬菌體核酸分別在RNase A、DNase I和Mung Bean Nuclease 作用下在37℃水浴中酶解2 h，通過(guò)7 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定噬菌體核酸類(lèi)型。

1.2.4 噬菌體的生物學(xué)特性

(1)噬菌體效價(jià)測(cè)定：將噬菌體溶液1000 r/min離心10 min，取上清液并采取10倍倍比法進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)∶總€(gè)梯度的稀釋液100 μL向其中加入相應(yīng)的宿主菌的菌懸液100 μL，采用雙層瓊脂平板法，計(jì)算噬菌斑的個(gè)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值。噬菌體的滴度=平板上噬菌斑個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。(注：選取平板上有30～300個(gè)噬菌斑的平板，且噬菌斑個(gè)數(shù)小于30、大于300均不采取)。

(2)最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定：將噬菌體與宿主菌按照不同MOI(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100)比例混合，再加入等體積的BHI培養(yǎng)基，在37℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 h，采用雙層瓊脂平板法測(cè)量噬菌體效價(jià)，噬菌體效價(jià)最高的MOI為最佳感染復(fù)數(shù)。

(3)一步生長(zhǎng)曲線(xiàn) ：參考文獻(xiàn)[11]，加入宿主菌及噬菌體，按最佳MOI混合，在37℃、160 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)3 h，分別在5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、110、130、150、170、190、210 min取樣，采用雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，重復(fù)3次取平均值，繪制一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

(4)噬菌譜：噬菌體液與11株鏈球菌、11株大腸桿菌、11株金色葡萄菌的菌懸液分別1∶1混合均勻，吸附15 min，采用雙層瓊脂平板法判斷噬菌體對(duì)其他菌株有無(wú)裂解能力。

1.2.5 噬菌體穩(wěn)定性研究

(1) 酸堿度耐受性：調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基pH(pH=2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)后高壓處理，取已知等體積的噬菌體，分別加入5 mL不同pH的液體培養(yǎng)基，37℃水浴1 h，采用雙層瓊脂平板法計(jì)算噬菌體的滴度。制作pH穩(wěn)定性曲線(xiàn)。

(2)熱穩(wěn)定性：將噬菌體液放置于不同溫度下(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)恒溫水浴，每隔10 min取一次樣，測(cè)定噬菌體效價(jià)，重復(fù)3次取平均值，制作熱穩(wěn)定性曲線(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 分離、純化和效價(jià)測(cè)定結(jié)果

分離得到一株裂解性鏈球菌噬菌體，根據(jù)其來(lái)源命名為SM-P21。通過(guò)雙層瓊脂平板法對(duì)噬菌體進(jìn)行3次以上的純化處理，得到噬菌斑形狀較為統(tǒng)一、大小近似相等、無(wú)色透明的噬菌體(圖1)。純化后的噬菌體經(jīng)10倍倍比稀釋通過(guò)雙層瓊脂平板法，計(jì)算噬菌斑個(gè)數(shù)，此步驟重復(fù)3次取平均值，計(jì)算得出噬菌體的效價(jià)9.4×109PFU/mL。

圖1 噬菌體SM-P21的噬菌斑

2.2 噬菌體SM-P21的電鏡觀察

使用20 g/L磷鎢酸復(fù)染純化后的噬菌體濃縮液30 min，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)(圖2)，噬菌體屬于肌尾噬菌體科，頭部呈20面體，體長(zhǎng)約203.11 nm，頭長(zhǎng)約48.7 nm×56.4 nm，尾長(zhǎng)約為10.2 nm×89.66 nm。

圖2 噬菌體SM-P21的電鏡照片(80 000×)

2.3 噬菌體SM-P21核酸類(lèi)型的鑒定

結(jié)果如圖3所示。消化反應(yīng)結(jié)果顯示，噬菌體SM-P21的核酸被DNase I完全降解，不能被RNase A、Mung Bean Nuclease降解，由此可知噬菌體SM-P21的核酸類(lèi)型為雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 15 000; 1.SM-P21核酸; 2.RNase A; 3.DNase I;4.Mung Bean Nuclease

2.4 噬菌體SM-P21的最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定

按MOI=10的比例加入噬菌體及宿主菌，吸附15 min，采用雙層瓊脂培養(yǎng)法，觀察平板上噬菌斑個(gè)數(shù)，此時(shí)噬菌體在侵染過(guò)程中釋放的子代噬菌體的滴度最高，為9.45×109PFU/mL(圖4)。

2.5 噬菌體SM-P21一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

噬菌體的潛伏期約為15 min，暴發(fā)期約為95 min，經(jīng)計(jì)算得出噬菌體的裂解量為249 PFU/cell左右(圖5)。

2.6 噬菌體SM-P21裂解譜測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)對(duì)11株金色葡萄球菌、11株鏈球菌以及11株大腸埃希氏菌侵染情況的觀察，目前得出噬菌體SM-P21對(duì)所選菌株并無(wú)裂解能力，噬菌體SM-P21只對(duì)宿主菌具備裂解能力。

圖4 噬菌體SM-P21的最佳MOI測(cè)定

圖5 噬菌體SM-P21的一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.7 噬菌體SM-P21穩(wěn)定性研究

2.7.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定 測(cè)定噬菌體處于不同溫度下的裂解情況。在溫度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)的情況下，噬菌體的侵染能力越來(lái)越弱直至消失。噬菌體的侵染能力在40.0℃～50.0℃之間基本保持穩(wěn)定；溫度到達(dá)55℃時(shí)噬菌體的活性逐漸降低；當(dāng)溫度到達(dá)60℃時(shí)，噬菌體滴度隨時(shí)間延長(zhǎng)大幅度下降直至為0(圖6)。

2.7.2 酸堿度耐受性測(cè)定 由圖7可知，pH在3.0～11.0之間，噬菌體的活性比較穩(wěn)定，pH為7.0時(shí)，噬菌體的活性最高，說(shuō)明該噬菌體對(duì)于pH的耐受性較強(qiáng)。但在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的情況下，噬菌體失去活性。

3 討論

本試驗(yàn)采用雙層瓊脂平板法，從牛場(chǎng)中采集到的污水及糞便中分離純化出一株裂解性鏈球菌肌尾噬菌體，根據(jù)噬菌體階元的劃分及噬菌體常規(guī)命名方法暫命名為SM-P21，其中S為Streptococcus(鏈球菌)，M為Myoviridae(肌尾噬菌體科)。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(ICTV)的數(shù)據(jù)庫(kù)，噬菌體SM-P21屬于最為常見(jiàn)的dsDNA病毒群[12]。

表1 噬菌體SM-P21對(duì)33株臨床分離株裂解情況

圖6 噬菌體SM-P21的熱穩(wěn)定性

圖7 噬菌體SM-P21的pH穩(wěn)定性測(cè)定

噬菌體SM-P21與Bai Qinqin[13]報(bào)道的噬菌體JX01相比，吸附時(shí)間較長(zhǎng)，JX01噬菌體90%以上完成吸附只需2.5 min，潛伏期為30 min，裂解量為20PFU/cell；而噬菌體SM-P21的吸附時(shí)間需要15min，潛伏期為15 min、暴發(fā)期為95 min，裂解量為249 PFU/cell左右，與噬菌體JX01相比，本試驗(yàn)所分離的噬菌體潛伏期較短，裂解量較大。噬菌體SM-P21與張倩[14]報(bào)道的噬菌體v B-Eco M-XJ2相比，噬菌體v B-Eco M-XJ2在40～60℃之間活性比較穩(wěn)定，70℃時(shí)滴度大幅度下降直至為0，其溫度耐受性較強(qiáng)于噬菌體SM-P21；噬菌體v B-Eco M-XJ2在pH 5.0～11.0之間侵染能力較穩(wěn)定，比噬菌體SM-P21的酸堿耐受性弱。噬菌體SM-P21與柏琴琴[15]報(bào)道的3株牛源無(wú)乳鏈球菌LYGO9、HZ04和pA11相比，牛源無(wú)乳鏈球菌LYGO9、HZ04和pA11分別裂解42株牛源無(wú)乳鏈球菌的12株(28.6%)、13株(31%)、20株(47.6%)和23株 (54.8%)，其宿主范圍廣于噬菌體SM-P21。噬菌體SM-P21只對(duì)宿主菌有裂解能力，對(duì)本試驗(yàn)所選的33株臨床分離菌并無(wú)裂解能力，針對(duì)SM-P21噬菌體是否有裂解其他菌株的能力，要在后期的試驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

噬菌體是一類(lèi)本身具有高度細(xì)菌特異性的病毒，具有高度的宿主特異性、復(fù)制能力、副作用極小以及無(wú)藥物殘留等優(yōu)點(diǎn)，作為一種微生態(tài)制劑在治療過(guò)程可以有效地避免藥物殘留和細(xì)菌耐藥性問(wèn)題[16]。Russell H等[17]在1969年首次分離得到牛源無(wú)乳鏈球菌噬菌體，并開(kāi)展了對(duì)牛源無(wú)乳鏈球菌噬菌體及其相關(guān)試驗(yàn)研究。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)奶牛乳房炎鏈球菌噬菌體的研究處于初步階段，分離到的鏈球菌噬菌體相對(duì)較少，與已報(bào)道的奶牛乳房炎鏈球菌噬菌體相比，SM-P21具有較大的裂解量，對(duì)酸堿度和溫度的耐受情況較好，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。