齊帕特羅人工抗原合成及其多克隆抗體制備

郭東光，陳明艷，馮春花，王 豐，卞爽麗,2，李文明，王凱露，呂薇薇，鄭文珺，陳子怡，孫國(guó)鵬，李雪華，田金河，李 鵬，朱艷平，岳 鋒，王選年*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院/動(dòng)物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450000；3.新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河南新鄉(xiāng) 453000)

近年來(lái)，隨著我國(guó)對(duì)傳統(tǒng)“瘦肉精”監(jiān)管力度的不斷加強(qiáng)，一些新型“瘦肉精”藥物可能被非法用于畜禽養(yǎng)殖，當(dāng)被動(dòng)物機(jī)體攝入后，同樣導(dǎo)致畜產(chǎn)品(肌肉、肝臟、腎臟等器管)中有較高的殘留量。因“瘦肉精”是苯乙醇胺類(lèi)化合物，與機(jī)體分泌的多巴胺(dopamine)、去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)及腎上腺素(adrenaline,A)等兒茶酚胺類(lèi)化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重危害，如組織器官的損傷，心悸、頭暈、乏力、惡心嘔吐等中毒現(xiàn)象[1]。

齊帕特羅(zilpaterol,ZIL)是β2腎上腺素受體(β2-adrenergic receptors,β2AR)激動(dòng)劑的一種，與萊克多巴胺(ractopamine,RAC)和克倫特羅(clenbuterol,CLB)一樣同屬于“瘦肉精”類(lèi)，其分子式為C14H19N3O2，分子質(zhì)量為297.784 u，熔點(diǎn)為123℃～126℃，外觀呈白色或類(lèi)白色結(jié)晶性粉末(圖1)[2-3]。作為一種新型瘦肉精，ZIL其主要作用也是促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和肌肉生長(zhǎng)，減少脂肪組織的沉淀。當(dāng)作為飼料添加劑飼喂動(dòng)物后能明顯增加動(dòng)物的肌肉/脂肪比，顯著提高飼養(yǎng)動(dòng)物胴體瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率，明顯改善肉的品質(zhì)和降低動(dòng)物的養(yǎng)殖成本。但相比于傳統(tǒng)“瘦肉精”CLB，ZIL因其毒性相對(duì)較弱，其藥效僅相當(dāng)于CLB的十分之一，卻比RAC更有效。因此，ZIL可能迅速發(fā)展成為動(dòng)物飼料添加劑CLB的替代品，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)[4]。所以，建立有效、快速、簡(jiǎn)便、靈敏的食品污染物檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。

圖1 齊帕特羅的分子結(jié)構(gòu)

很多國(guó)家已經(jīng)明令禁止使用ZIL，但美國(guó)、加拿大、墨西哥和南非曾批準(zhǔn)在牛上使用ZIL，給全世界食品安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅[5-6]。目前，歐盟國(guó)家對(duì)ZIL使用和動(dòng)物組織中殘留方面的研究相對(duì)較多，儀器檢測(cè)方法主要涉及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid liquid-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[7-9]。在快速和高通量篩選方面，因免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏度、高通量、重現(xiàn)時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前檢測(cè)食品污染物常用的檢測(cè)方法之一[10-12]。

抗體是建立免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的核心試劑，由于ZIL和其他β2AR在結(jié)構(gòu)上的巨大差異，要檢測(cè)食品污染物中ZIL的殘留，則需要制備應(yīng)用于ZIL檢測(cè)的特異性抗體，而ZIL完全抗原的制備是獲得ZIL抗體和建立免疫學(xué)檢測(cè)方法的重要前提[13]。因此，本研究通過(guò)制備ZIL完全抗原，免疫新西蘭大白兔后獲得抗ZIL高特異性和高靈敏度多克隆抗體(polyclonal antibody,pAb)，為后期建立ZIL免疫學(xué)快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔，由新鄉(xiāng)學(xué)院動(dòng)物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 ZIL、沙丁胺醇(salbutamol,SAL)、特布他林(terbutaline,TBL)、溴布特羅(brombuterol，BRO)、西馬特羅(cimaterol,CIM)、CLB、鹽酸多巴胺(dopamine hydrochloride,DH)、RAC、達(dá)氟沙星(danofloxain,DAN)、泰樂(lè)菌素(tylosin,TYL)標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant,FIA)、嗎啉乙磺酸(monohydrate,MES)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide)德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；HRP-羊抗兔IgG，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；4-溴丁酸乙酯、無(wú)水碳酸鉀、丙酮、乙酸乙酯，上海有朋化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(Enspire)和蛋白電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra Cell 1658001)，美國(guó)Bio-Rad司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10 digitalV)、加熱磁力攪拌器(CMAGHS4)，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-3010)，日本Hitachi公司產(chǎn)品；透析袋(MD25)，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 齊帕特羅半抗原的修飾及改造 將1g ZIL鹽酸鹽添加到20 mL的NaOH溶液中(pH>10)，并用乙酸乙酯萃取ZIL游離堿。將得到的產(chǎn)物溶于50 mL丙酮后，加入4-溴丁酸乙酯和碳酸鉀回流，過(guò)濾除去碳酸鉀，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)丙酮。然后，用乙醇和KOH水溶液回流，將酯轉(zhuǎn)化為游離酸，并用液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)進(jìn)行鑒定。

1.2.2 齊帕特羅完全抗原的合成及鑒定 將1.2.1得到的產(chǎn)物全部溶于2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸(MES)中，加50 mg EDC和20 mg NHS，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h即為A液，并將溶液分成2份。然后，將20 mg BSA和20 mg OVA分別溶解于MES中，4℃冷藏即為B液。將A液緩慢滴加至B液中，室溫?cái)嚢? h，用0.01 mol/L的PBS溶液透析3 d，每天換液6次，收集透析后的產(chǎn)物后，分裝凍存于-80℃冰箱，具體合成路線見(jiàn)圖2。

圖2 齊帕特羅完全抗原合成路線圖

1.2.3 齊帕特羅完全抗原的鑒定 參考本實(shí)驗(yàn)室前期研究方法[14-15]，根據(jù)Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)偶聯(lián)后的產(chǎn)物進(jìn)行濃度測(cè)定后，分別采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和紫外掃描(ultraviolet scanning,UV)鑒定完全抗原的合成情況。SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)，濃縮膠濃度為50 g/L，分離膠濃度為150 g/L，電泳電壓為200 V，最后用考馬斯亮藍(lán)染色。UV鑒定完全抗原時(shí)，先用PBS稀釋BSA、OVA和ZIL標(biāo)準(zhǔn)溶液，并調(diào)整濃度與ZIL-BSA、ZIL-OVA的濃度一致，約為1 mg/mL。然后采用光譜掃描模式獲得上述溶液在200 nm～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜圖。

1.2.4 齊帕特羅多克隆抗體的制備 選擇健康的新西蘭大白兔2只，體重約1.5 kg左右，免疫劑量為500 μg，1 mL/只，首次免疫用等體積的弗氏佐劑進(jìn)行乳化，乳化完全后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。從第2次免疫開(kāi)始，用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，每隔20 d免疫1次，共免疫5次。最后1次免疫后10 d，耳緣靜脈取血2 mL，37℃放置2 h后，4℃過(guò)夜，6 000 r/min離心5 min，抽取血清，分裝后，置-20℃保存。

1.2.5 齊帕特羅多抗血清的效價(jià)檢測(cè) 采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)評(píng)估免疫后的血清效價(jià)?；静襟E如下：(1)包被：將包被原(ZIL-OVA)用包被緩沖液(CBS，0.01 moL/L，pH=9.6)稀釋到2 μg/mL，50 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜；(2)洗滌：次日，甩干孔內(nèi)液體，先用PBST清洗5次，第5次靜置5 min，隨后在吸水紙上拍干；(3)封閉：每孔加入200 μL封閉液(50 g/L脫脂奶粉-PBST)，于37℃恒溫箱中孵育2 h，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次，方法同上；(4)一抗孵育：先在每孔加入50 μL的PBS，然后在第1孔加入1∶100倍稀釋的50 μL的抗血清并進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瓿珊笥?7℃恒溫箱中孵育40 min，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次，方法同上；(5)加入二抗：以辣根過(guò)氧化物酶(peroxidase)HRP標(biāo)記的羊抗兔-IgG作為二抗，用封閉液1∶5 000稀釋?zhuān)?0 μL/孔，于37℃恒溫箱中孵育30 min，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次，方法同上；(6)顯色：顯色液為T(mén)MB單組分顯色液，50 μL/孔，37℃避光10 min后，立即加入50 μL/孔的終止液；(7)讀數(shù)：酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光值。(8)判斷標(biāo)準(zhǔn)：以O(shè)D450nm值>0.3且P/N>3.1判斷兔血清產(chǎn)生的效價(jià)反應(yīng)層度。待效價(jià)符預(yù)期后，用500 μg 進(jìn)行超免，7 d后進(jìn)行心臟大量釆血，得到ZIL抗血清。

1.2.6 齊帕特羅多抗血清半數(shù)抑制濃度的測(cè)定 采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA評(píng)估多抗血清的半數(shù)抑制濃度(half-inhibitory concentration,IC50)。基本步驟如下：(1)包被：將包被原(ZILL-OVA)用包被緩沖液稀釋到2 μg/mL，100 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜。(2)封閉：甩去孔內(nèi)液體，PBST-5%脫脂奶粉洗滌5次，每次3 min；每孔加入200 μL封閉液，于37℃恒溫箱中孵育2 h，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次。(3)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：將0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液稀釋成系列濃度，50 μL/孔加入到已包被抗原的酶標(biāo)板中；再依次加入稀釋至合適濃度的50 μL/孔抗血清，37℃反應(yīng)90 min，洗滌5次，甩干。(4)加酶標(biāo)二抗：每孔加入100 μL 5 000倍稀釋的HRP-羊抗兔IgG，37℃反應(yīng)60 min，洗滌5次，甩干。(5)顯色：每孔加顯色液100 μL，室溫避光顯色15 min，加入50 μL/孔終止液終止反應(yīng)。(6)測(cè)定：酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光值。(7)計(jì)算：使用Origin 9.0軟件中的四參數(shù)擬合函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以吸光值B/B0作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)IC50=(ZIL抗血清效價(jià)-ZIL抗血清抑制)/ ZIL抗血清效價(jià)×100%進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 齊帕特羅多抗血清的特異性鑒定 選取瘦肉精類(lèi)小分子CL、RAC、SAL、DH、BRO、BAM、CIM、TBL和2種臨床抗菌藥物DAN、TYL作為抑制物，評(píng)價(jià)該方法的特異性。按步驟1.2.6測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按公式交叉反應(yīng)率(CR)=IC50(標(biāo)準(zhǔn)品)/ IC50(反應(yīng)物)×100%計(jì)算相對(duì)應(yīng)的交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果

2.1 齊帕特羅丁酸鹽的合成

為在ZIL分子結(jié)構(gòu)上引入-COOH，將ZIL與4-溴丁酸乙酯反應(yīng)即得到ZIL-丁酸鹽。HPLC-MS鑒定結(jié)果表明，如圖3A所示，在反應(yīng)體系中檢測(cè)到2種主要產(chǎn)物，保留時(shí)間(RT)分別為11.48 min和12.94 min。其中RT值為11.48的分子質(zhì)量348.217 3 u(圖3B)，RT為12.94的分子質(zhì)量290.014 4 u(圖3C)。經(jīng)質(zhì)譜(MS)鑒定結(jié)果顯示，RT值為11.48的分子質(zhì)量與ZIL-丁酸鹽的分子量完全相符，約占體系中總反應(yīng)產(chǎn)物的92.23%(表1)，以上結(jié)果表明成功合成ZIL-丁酸鹽。

A.HPLC分離結(jié)果；B.樣品的MS檢測(cè)結(jié)果；C.樣品的MS檢測(cè)結(jié)果

2.2 齊帕特羅完全抗原的鑒定

2.2.1 SDS-PAGE鑒定 如圖4和圖5所示，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，ZIL-丁酸鹽與載體蛋白BSA/OVA偶聯(lián)后的產(chǎn)物的分子質(zhì)量分別為66 ku和45 ku，相比BSA和OVA均有所增加，并且偶聯(lián)后產(chǎn)物的遷移速率明顯小于載體蛋白BSA或OVA，可初步證明ZIL與載體蛋白偶聯(lián)成功。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.BSA載體蛋白；2.偶聯(lián)產(chǎn)物

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.OVA載體蛋白；2.偶聯(lián)產(chǎn)物

2.2.2 紫外(UV)掃描鑒定結(jié)果 為進(jìn)一步鑒定完全抗原是否制備成功，UV結(jié)果顯示，載體蛋白BSA和OVA的最高吸收峰分別為276 nm 和278 nm，小分子ZIL的最高吸收峰約為225 nm，而偶聯(lián)后的ZIL-BSA和ZIL-OVA的最高吸收峰分別為282 nm和275 nm。因此，相對(duì)于載體蛋白BSA/OVA，偶聯(lián)產(chǎn)物在200 nm～500 nm波長(zhǎng)范圍特征吸收峰明顯不同，ZIL-BSA特征吸收峰發(fā)生明顯右移(圖6A)。雖然ZIL-OVA在268 nm～281 nm處的吸光值沒(méi)有明顯變化，其450 nm吸光值波動(dòng)范圍在0.6207～0.6212之間，最大吸光值在275 nm處，為0.6271。因此，ZIL-OVA的特征吸收峰均發(fā)生了明顯左移(圖6B)。以上結(jié)果進(jìn)一步證明ZIL與載體蛋白BSA/OVA偶聯(lián)成功。

A.ZIL-BSA紫外掃描鑒定結(jié)果；B.ZIL-OVA紫外掃描鑒定結(jié)果A.ZIL-BSA UV scanning identification results; B.ZIL-OVA UV scanning identification results

2.3 齊帕特羅多抗血清效價(jià)檢測(cè)

第5次免疫后，通過(guò)對(duì)2只新西蘭大白兔耳緣靜脈采血，采用間接ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)。如表2所示，以O(shè)D450nm值>0.3且P/N>3.1為判斷標(biāo)準(zhǔn)。相比于陰性兔血清，2只兔子均產(chǎn)生了良好的抗體效價(jià)，其中1號(hào)兔在第5次免疫后效價(jià)最高，達(dá)到1∶12 800，2號(hào)兔效價(jià)約為1∶6 400，說(shuō)明完全抗原免疫后具有良好的免疫效果。

表2 間接ELISA檢測(cè)兔血清抗體效價(jià)結(jié)果

2.4 齊帕特羅多抗血清的IC50測(cè)定

為鑒定ZIL抗血清靈敏度，間接競(jìng)爭(zhēng)法ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度良好，1號(hào)兔和2號(hào)兔血清標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2值分別為0.999 75和0.998 95(圖7)。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出1號(hào)和2號(hào)兔血清IC50值分別為0.38 ng/mL和1.13 ng/mL。由于1號(hào)兔血清敏感性較好，因此選擇1號(hào)兔血清用于后續(xù)試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算1號(hào)兔血清IC20-IC80值為0.054 ng/mL～1.554 ng/mL。

2.5 抗體的特異性測(cè)定

為進(jìn)一步鑒定ZIL抗血清的特異性，共選取了7種β2AR激動(dòng)劑和2種獸用標(biāo)準(zhǔn)品與ZIL抗血清進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果如表3所示，ZIL抗血清與CL、RAC、SAL、DH、BRO、BAM、CIM、TBL等7種常見(jiàn)β2AR激動(dòng)劑均無(wú)交叉反應(yīng)，并且與2種獸藥DAN、TYL也無(wú)交叉反應(yīng)，其IC50值均高于1 000 ng/mL。

圖7 1號(hào)兔和2號(hào)兔血清敏感度標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

ZIL屬于小分子半抗原，不具備免疫原性，只有與相應(yīng)載體蛋白偶聯(lián)后才能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)。在合成完全抗原時(shí)，半抗原必須經(jīng)過(guò)合理的設(shè)計(jì)以獲得較好的特異性[14-15]。本研究將ZIL與4-溴丁酸乙酯進(jìn)行反應(yīng)，最終使丁酸酯連接物的游離羧基被激活，使ZIL小分子被修飾成為ZIL-丁酸鹽，使之能與目標(biāo)蛋白的氨基偶聯(lián)[13]。為鑒定修飾后小分子是否改造成功，用HPLC-MS技術(shù)鑒定了小分子ZIL改造后的分子質(zhì)量和純度，其結(jié)果表明，分子質(zhì)量為348.91 u的化合物為主要產(chǎn)物，約占整個(gè)反應(yīng)體系產(chǎn)物的92.23%，與預(yù)期結(jié)果完全相符，表明成功引入了-COOH，獲得了ZIL-丁酸鹽。

表3 ZIL抗血清的特異性鑒定

為獲得ZIL-BSA/OVA完全抗原，首先對(duì)ZIL化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，其包含3個(gè)親核基團(tuán)，分別為仲醇、仲胺和苯并咪唑酰胺，它們有可能取代4-溴丁酸乙酯上的溴原子。但與脂肪族或苯并咪唑類(lèi)硝基物相比，ZIL仲醇基的反應(yīng)活性要小得多。由于仲胺具有較大的旋轉(zhuǎn)空間位阻，因此ZIL和4-溴丁酸乙酯最可能的反應(yīng)位點(diǎn)是苯并咪唑部分上的仲胺[13,16]。另外，從設(shè)計(jì)的角度考慮，在仲胺或酰胺的基礎(chǔ)上都有可能產(chǎn)生合適的半抗原。因此，在ZIL-丁酸鹽的基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)EDC/NHS方法，將其與載體蛋白BSA/OVA分別進(jìn)行偶聯(lián)。SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果表明，相比于載體蛋白，偶聯(lián)后的分子質(zhì)量均明顯增加，且泳動(dòng)速率明顯變慢，初步證實(shí)成功制備了完全抗原ZIL-BSA/OV。UV結(jié)果進(jìn)一步表明，偶聯(lián)后的ZIL-BSA/OVA最大吸收峰明顯發(fā)生變化，同時(shí)具備小分子ZIL和載體蛋白BSA/OVA的分子特征，進(jìn)一步證實(shí)成功制備了完全抗原ZIL-BSA/OVA。

此外，從引入的側(cè)鏈長(zhǎng)度分析，與載體蛋白質(zhì)結(jié)合的-COOH和ZIL分子之間的3個(gè)碳原子的距離完全可以滿足和載體蛋白的有效偶聯(lián)，并能適當(dāng)暴露ZIL分子抗原表位，以提高抗體的特異性[13]。通過(guò)免疫新西蘭大白兔后，成功制備了高特異性和高靈敏度抗ZIL多抗血清，其效價(jià)在1∶6 400以上， IC50分別為0.38 ng/mL和1.13 ng/mL，并且與7種常見(jiàn)的“瘦肉精”類(lèi)小分子和2種臨床常用抗菌藥物均無(wú)交叉反應(yīng)。更為重要的是，獲得的ZIL pAb均沒(méi)有與常見(jiàn)的“瘦肉精”(如CLB、RAC、SAL)發(fā)生任何交叉反應(yīng)。因?yàn)榕c這些常用“瘦肉精”的任何一種產(chǎn)生交叉反應(yīng)，都有可能導(dǎo)致在檢測(cè)過(guò)程中假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

此外，ZIL抗體具有高特異性的主要原因還可能與ZIL屬于苯乙醇胺激動(dòng)劑有關(guān)，由于其具有獨(dú)特的苯并咪唑核，在結(jié)構(gòu)上與其他苯乙醇胺激動(dòng)劑完全不同，這也可能是抗體具有高特異性的另一個(gè)重要原因。Shelver WL等[13]采用相似的方法制備了山羊源抗ZIL的pAb，雖然與其他β2AR也無(wú)交叉反應(yīng)，但是其IC50=3.94 ng/mL，相比而言，本研究制備的兔源ZIL抗體具備更好的靈敏度。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)CLB、CIM、SAL、TBL等不同小分子研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)即使是同一種抗原，甚至是同一批制備的完全抗原免疫小鼠和兔子后，產(chǎn)生的免疫效果均存在很大差異。但是從整體情況分析，同種抗原免疫兔子后獲得的血清敏感度較好，IC50較低，并且效價(jià)較好。因此，相比Shelver WL等研究，我們推測(cè)本研究獲得的兔抗ZIL pAb IC50較低的原因，可能是相比于其他動(dòng)物，與兔子免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，本研究利用ZIL與4-溴丁酸乙酯反應(yīng)，再通過(guò)與載體蛋白BSA/OVA偶聯(lián)后，成功制備了ZIL完全抗原ZIL-BSA/OVA，免疫新西蘭大白兔后，獲得一種高靈敏度和高特異性的抗ZIL pAb，為后續(xù)建立ZIL免疫學(xué)快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。