長鏈非編碼RNA 在畜禽脂代謝中的作用研究進(jìn)展

孫嘉宏，譚曉冬，楊欣婷，趙桂蘋，文 杰，劉冉冉

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖（家禽）重點實驗室，北京 100193）

脂肪是動物重要的儲能與供能組織，當(dāng)動物能量過剩時，脂肪以中性脂質(zhì)的形式儲存在體內(nèi)；當(dāng)能量缺乏時，脂肪則通過脂解的方式為機(jī)體提供能量。畜禽許多重要經(jīng)濟(jì)性狀與脂代謝密切相關(guān)，如背膘厚、肌內(nèi)脂肪含量和腹脂率等。以肉雞生產(chǎn)為例，肌內(nèi)脂肪含量提高有利于肉品質(zhì)提高，而腹部脂肪過度沉積會影響胴體品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益，并造成環(huán)境污染。因此，研究機(jī)體脂代謝的精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)制將為體脂性狀的遺傳技術(shù)研發(fā)奠定必要基礎(chǔ)。

長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）是一類長度大于200nt、不編碼蛋白質(zhì)的RNA，廣泛存在于動植物中。在很長一段時間內(nèi)，lncRNA 被看作是“轉(zhuǎn)錄噪聲”，不被人們重視。但近些年研究已充分證明，lncRNA 在生物體代謝調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用，如lncRNA 在肌細(xì)胞分化和細(xì)胞周期過程中具有調(diào)控作用，并直接參與卵子成熟、精子形成、胎盤形成、妊娠、性腺激素應(yīng)答、胚胎發(fā)育等過程。lncRNA 在脂肪代謝中同樣起重要調(diào)控作用，lncRNA 與棕色脂肪生成、白色脂肪生成、血漿高密度脂蛋白濃度、血漿甘油三酯濃度有關(guān)。lncRNA 在小鼠和人上的相關(guān)研究較為豐富，在肝臟中，LNCLSR 直接與TDP-43 結(jié)合并抑制的表達(dá)以下調(diào)甘油三酯水平，APOA1-AS 在體內(nèi)外均對的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，以抑制高密度脂蛋白形成，在脂肪發(fā)育過程中，SRA 通過調(diào)節(jié)PPAR和P38/JNK 磷酸化促進(jìn)體外脂肪生成，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化，ADINR 通過轉(zhuǎn)錄激活C/EBPa 促進(jìn)脂肪生成，Blnc1 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子EBF2 促進(jìn)棕色和米色脂肪細(xì)胞分化。在畜禽脂代謝研究中，lncRNA 調(diào)控機(jī)制解析也成為研究熱點之一。因此，本文就lncRNA 及其在畜禽脂代謝上的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述，為相關(guān)工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 lncRNA 簡介

lncRNA 的種類繁多，功能復(fù)雜，在不同的物種間保守性較低，有組織和發(fā)育階段特異性，在不同的亞細(xì)胞區(qū)域發(fā)揮作用。由于lncRNA 結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，為利于開展研究，通常根據(jù)lncRNA 與功能基因的相對位置對其進(jìn)行分類。根據(jù)其與鄰近蛋白質(zhì)編碼基因的相對位置可將lncRNA 分為六類，包括：①基因內(nèi)lncRNA：來源于內(nèi)含子的二次轉(zhuǎn)錄；②基因間lncRNA：位于2 個基因的間隔區(qū)域內(nèi)，構(gòu)成最大的非編碼RNA 家族；③正義lncRNA：由蛋白質(zhì)基因編碼的正義鏈轉(zhuǎn)錄；④反義lncRNA：由蛋白質(zhì)基因編碼的反義鏈轉(zhuǎn)錄，大約70%的lncRNA 是自然反義轉(zhuǎn)錄本（Natural Antisense Transcripts，NAT）；⑤雙向lncRNA：由蛋白質(zhì)編碼基因的反向互補鏈轉(zhuǎn)錄，其功能與蛋白質(zhì)編碼基因相似；⑥增強(qiáng)子lncRNA：通過向特定的基因啟動子募集染色質(zhì)重塑復(fù)合物來增強(qiáng)基因活性。

已知的lncRNA 實現(xiàn)生物學(xué)功能的分子機(jī)制包括（圖1）：①lncRNA 作為信號分子，對來自細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的各種刺激做出回應(yīng)，作為特定時間、地點、生理狀態(tài)、基因調(diào)控的標(biāo)志物；②lncRNA 作為誘餌分子，誘導(dǎo)某些蛋白質(zhì)、RNA 或MicroRNA（miRNA）分子離開特定的區(qū)域；③lncRNA 作為引導(dǎo)分子，通過與目標(biāo)分子結(jié)合，指引核糖核蛋白復(fù)合體定位至目標(biāo)區(qū)域，進(jìn)而影響鄰近基因或遠(yuǎn)距離基因的表達(dá)；④lncRNA 作為支架分子，為多個不同類型大分子組件的裝配提供一個中心平臺，在生物信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

圖1 lncRNA 實現(xiàn)生物學(xué)功能的分子機(jī)制[22]

lncRNA 能夠在染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后等水平影響基因表達(dá)，從而發(fā)揮生物學(xué)功能（圖2）：①染色質(zhì)水平：通過介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾來調(diào)控下游基因的表達(dá)，lncRNA HOTAIR等可以將核心蛋白復(fù)合體招募到特定位點，在那里將組蛋白H3 的賴氨酸27 殘基3（me3K27）甲基化以誘導(dǎo)異染色質(zhì)的形成和抑制基因表達(dá)（圖2-a）；②轉(zhuǎn)錄水平：與上游啟動子區(qū)結(jié)合，干擾下游基因的表達(dá)。lncRNA 募集RNA 結(jié)合蛋白TLS（translocatedinliposarcoma）來調(diào)節(jié)CREB 結(jié)合蛋白（CBP）和p300 的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，以抑制基因轉(zhuǎn)錄（圖2-b）；一種超保守的增強(qiáng)子被轉(zhuǎn)錄為一個lncRNA，Evf2 作為轉(zhuǎn)錄因子DLΧ2 的共同激活因子可調(diào)節(jié)Dlx6 基因的轉(zhuǎn)錄（圖2-c）；lncRNA可以在主要啟動子處形成一個三聯(lián)體以阻斷一般轉(zhuǎn)錄因子TFIID 的結(jié)合，從而使基因表達(dá)沉默[26]（圖2-d）；③轉(zhuǎn)錄后修飾：反義lncRNA 通過與mRNA 形成互補雙鏈，干擾mRNA 的剪切或者生成內(nèi)源性Small interfering RNA（siRNA）來調(diào)控基因的表達(dá)（圖2-e）。

圖2 lncRNA 的功能[29]

2 lncRNA 在畜禽脂代謝中的研究進(jìn)展

2.1 lncRNA 在肝脂代謝過程中的作用 肝臟在脂肪的消化、吸收、分解、合成及運輸?shù)却x過程中發(fā)揮重要作用，是機(jī)體脂代謝的樞紐。肝臟從血液中攝取游離脂肪酸，合成甘油三酯，隨后以極低密度脂蛋白的形式將甘油三酯轉(zhuǎn)運出肝。正常情況下，肝臟僅儲存少量脂肪酸，當(dāng)機(jī)體營養(yǎng)過剩時，肝脂代謝加劇會引起代謝性綜合征。大量研究表明，畜禽肝脂代謝受表觀遺傳調(diào)控，包括lncRNA 作用。

對家禽而言，由于脂肪細(xì)胞不能或僅能合成微量脂類，肝臟成為其內(nèi)源性脂類合成的主要部位。Tan 等利用實驗室前期建立的持續(xù)5 個世代的雞脂肪肝父系遺傳模型為素材，通過對肝臟進(jìn)行DNA 甲基化和lncRNA 測序研究脂肪肝發(fā)生后肝臟表觀修飾的變化，發(fā)現(xiàn)易感系公雞83 個脂肪和葡萄糖相關(guān)基因中有72%上調(diào)；通過共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析鑒定到與脂代謝相關(guān)的重要新lncRNA（LNC_006756、LNC_012355 等）；此外，脂肪肝發(fā)生后肝臟甲基化水平顯著降低，并發(fā)現(xiàn)23 個甲基化與lncRNA 的共同靶點基因（等）。Li 等通過轉(zhuǎn)錄組測序比較20 周齡和30 周齡預(yù)產(chǎn)蛋雞和產(chǎn)蛋高峰雞的肝臟中l(wèi)ncRNA 表達(dá)差異，鑒定了一系列與雞肝脂代謝相關(guān)的lncRNA，分析了產(chǎn)前和產(chǎn)蛋母雞之間在肝臟中存在顯著差異表達(dá)的lncRNA 即lncLTR 的表達(dá)調(diào)控方式，lncLTR 受雌激素通過ERbeta 信號調(diào)節(jié)，并與雞胴體性狀和血液甘油三酯含量有關(guān)?；蚪M功能注釋是彌合基因型和表型之間差距的關(guān)鍵，Muret 等通過RNA-Seq 對雞肝臟和脂肪組織中l(wèi)ncRNA 轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，在雞肝臟和脂肪組織中提供了一個完整的lncRNA 庫，該庫顯示了mRNA 和lncRNA 之間共表達(dá)的有趣模式，很多在其他物種上驗證的lncRNA 在雞上不具有參考意義，在肝臟和脂肪沉積中，相較于mRNA，lncRNA 表達(dá)量更低、組織特異性更強(qiáng)，他們還強(qiáng)調(diào)了參與脂質(zhì)代謝的新型lncRNA 候選物lnc_DHCR24，它與編碼膽固醇生物合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量高度相關(guān)。Ning 等在構(gòu)建了4 個發(fā)育階段（60、133、220、400 日齡）肝臟組織的12 個RNA 文庫，鑒定的lncRNA 中一半以上是lincRNA（long intergenic ncRNAs），功能富集與脂質(zhì)代謝有關(guān)，通過結(jié)合加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）構(gòu)建DE-lncRNA（Differentially expressed lncRNA）和DEG（Differentially expressed gene）之間的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，功能富集結(jié)果也與脂質(zhì)代謝有關(guān)，表明DE-lncRNA 具有調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的生物學(xué)功能。

Liang 等使用HiSeq 平臺對3 只荷斯坦奶 牛在干乳期、泌乳早期和泌乳高峰期的9 份肝臟樣品的cDNA 和sRNA 文庫進(jìn)行了測序，構(gòu)建了一個大型的可能影響牛乳脂合成的內(nèi)源競爭RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找到12 個可能會通過胰島素、PI3K-Akt、MAPK、AMPK、mTOR和PPAR 信號傳導(dǎo)途徑影響肝臟脂質(zhì)代謝的候選基因。

綜上，由于物種間差異，已驗證的lncRNA 對其他物種參考意義有限，研究者們?nèi)灾铝τ跇?gòu)建肝臟組織lncRNA 和mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)以及篩選出有參考價值的lncRNA。

2.2 lncRNA 在脂肪沉積中的作用 動物體內(nèi)脂肪沉積程度取決于血漿中甘油三酯水平，脂肪沉積與畜禽繁殖、生長、產(chǎn)肉性狀有關(guān)，且脂肪對肉品質(zhì)及其加工特性有重要影響。機(jī)體內(nèi)脂肪沉積主要取決于合成代謝和分解代謝之間的動態(tài)平衡，lncRNA 對畜禽脂肪沉積有著重要作用。

Chen 等使用來自白色杜洛克和二花臉雜交的兩個F全同胞雌性個體240 日齡的肝臟、腹脂和背最長肌的數(shù)據(jù)以鑒定581 個與豬肌肉生長和脂肪沉積相關(guān)的lincRNAs，從預(yù)測的lincRNAs 中篩選了一些靶基因，與肌肉生長有關(guān)，和與脂肪沉積有關(guān)，和與肌肉生長和脂肪沉積均有關(guān)。這些lincRNAs 可能通過靶基因的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)參與豬肌肉生長或脂肪沉積有關(guān)的生物學(xué)過程。lncRNA 雖然有組織特異性，但仍可能同時參與不同的生物學(xué)過程。脂肪沉積研究中可以將lncRNA 和性激素研究結(jié)合，Wang 等對閹割和未閹割的全同胞淮南公豬皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定出343 個lncRNAs，其中18 個lncRNAs 在2 個組中差異表達(dá)，功能分析表明這18 種lncRNAs 及其靶基因參與脂肪酸、胰島素和脂肪細(xì)胞因子信號通路，去勢豬的脂肪酸合成和代謝更為活躍。Li 等在雞上也發(fā)現(xiàn)lncLTR受雌激素調(diào)節(jié)。Zhang 等對嘉興黑豬和長白豬皮下脂肪的lncRNAs 和mRNAs 表達(dá)譜進(jìn)行比較，鑒定到221 個lncRNAs 和958 個mRNAs，對DEG 進(jìn)行功能分析，其主要參與免疫應(yīng)答、PI3K-Akt 信號通路和MARK 信號通路等與脂肪形成和脂質(zhì)代謝相關(guān)通路，其中LTCONS_00055593 可能通過調(diào)節(jié)其靶基因在脂肪代謝和沉積中起關(guān)鍵作用。

羊的“脂尾”可以在遷徙期間和牧場處于休眠狀態(tài)或干物質(zhì)較少的季節(jié)為機(jī)體提供能量。綿羊的尾脂是人類用作膳食脂肪的重要來源。為鑒定與尾脂沉積和發(fā)育相關(guān)的lncRNA 和mRNA，Ma 等對蘭州肥尾羊、小尾寒羊和藏羊的尾脂進(jìn)行高通量測序，對篩選的mRNA-lncRNA 對構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)4個lncRNA（TCONS_00372767、TCONS_00171926、TCONS_00054953 和TCONS_00373007）與超過50 個mRNA 相互作用，對其靶基因進(jìn)行功能富集可發(fā)現(xiàn)這些基因廣泛參與脂肪酸代謝和脂肪酸延伸相關(guān)途徑，均有助于脂肪沉積，可能作為核心lncRNA 在尾部脂肪沉積過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且mRNA 和lncRNA 可能主要通過正調(diào)控發(fā)揮作用；組學(xué)分析說明mRNA 和lncRNA 在脂代謝中可能通過同向表達(dá)發(fā)揮作用。

肉雞的生長速度通過遺傳選擇可實現(xiàn)持續(xù)性提高，但對快速生長的選擇會伴隨腹脂過量，會影響飼料轉(zhuǎn)化率，降低腹脂沉積已成為肉雞育種目標(biāo)之一。Zhang 等以14 日齡京海黃雞腹部脂肪組織的前脂肪細(xì)胞為樣本，通過對不同分化階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，鑒定出1 336個lncRNA 和1 759 個mRNA 差異表達(dá)，且在分化過程中各個階段差異表達(dá)基因數(shù)下降，這些基因涉及與前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)途徑，包括丙酸脂代謝、脂肪酸代謝、氧化磷酸化途徑等。杜志強(qiáng)等指出lncRNA 基因可抑制活化T 細(xì)胞核因子（），且和在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞腹脂雙向選擇系和愛拔益加肉雞群體腹部脂肪組織中的表達(dá)水平隨周齡增加而顯著升高，提示基因可能影響肉雞肌肉和脂肪組織生長發(fā)育。李富原等研究發(fā)現(xiàn)隨填飼時間的增加，lncRNA LOC106047490 在朗德鵝肝臟、腹脂和胸肌中的表達(dá)量明顯下降，該基因受高葡萄糖、胰島素和不飽和脂肪酸的誘導(dǎo)且該基因在成年鵝腹脂中的表達(dá)量最高，提示LOC106047490 與脂肪代謝有關(guān)。

在牛上的相關(guān)研究主要關(guān)注脂肪組織的發(fā)育及分化。劉宇利用高通量測序等技術(shù)在秦川牛成年母牛皮下脂肪組織、內(nèi)臟脂肪組織和6 月齡犢牛皮下脂肪組織中分別獲得了大量差異表達(dá)的lncRNA，并對犢牛皮下脂肪組織特異性表達(dá)的lncRNA TCONS_00596625進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證，發(fā)現(xiàn)其存在bta-miR-125b 結(jié)合位點。有研究發(fā)現(xiàn)btamiR-125b 參與牛肉嫩度調(diào)節(jié)，并且在健康奶牛和患乳房炎奶牛的乳腺組織中差異表達(dá)，提示該lncRNA TCONS_00596625 可能通過與bta-miR-125b 的結(jié)合參與到上述生物學(xué)過程中。Li 等通過Ribo-Zero RNAseq 研究體外培養(yǎng)的牛前脂肪細(xì)胞和分化的脂肪細(xì)胞中PolyA+lncRNA 和PolyA－lncRNA，共確定了2 882 個lncRNA，其中l(wèi)ncRNA ADNCR 作為miR-204 的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），增強(qiáng)miR-204 靶基因的表達(dá)，通過與NCoR 和SMART 作用來抑制PPAR的活動，從而抑制脂肪細(xì)胞分化和脂肪合成基因表達(dá)。肖航等對肉牛肌肉和脂肪組織lncRNA 組學(xué)測序分析發(fā)現(xiàn)的lncRNA TCONS-585 進(jìn)行熒光定量PCR 驗證，發(fā)現(xiàn)其在脂肪組織中表達(dá)水平顯著高于其他組織，干擾lncRNA TCONS-585 能下調(diào)具有抑食作用、參與脂肪分化的基因的表達(dá)，從而可能影響牛脂肪組織的分化。

2.3 lncRNA 在肌內(nèi)脂肪沉積中的作用 肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）分布在肌外膜、肌束膜、肌內(nèi)膜，主要由甘油三酯、磷脂和游離脂肪酸組成。IMF 含量增加可提高肉的風(fēng)味、嫩度和多汁性。IMF 沉積使肌肉組織的交織結(jié)構(gòu)松散，增加肌肉嫩度；其中的磷脂可以通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生香味；食物中的IMF 還可以通過刺激人類唾液分泌來增加咀嚼時的適口性。IMF 是畜禽肉品質(zhì)選育的重要指標(biāo)之一。

不同的脂肪組織具有不同的生化特性和肌內(nèi)表達(dá)模式，為研究lncRNA 在雞IMF 和腹脂形成中的功能，Zhang 等采用Ribo-Zero RNA-Seq 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定到1 624 個差異lncRNAs，其中l(wèi)ncAD 與PPAR 信號通路的多個基因共表達(dá)，且其下調(diào)會以順式調(diào)控的方式抑制的表達(dá)，從而減少肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞的成脂分化，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。Χing 等以高IMF 肉雞品系的胸肌和腹脂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過WGCNA（Weighted Correlation Network Analysis）分析對發(fā)育過程中影響胸肌、腹脂沉積的功能基因模塊及其樞紐基因進(jìn)行鑒定，并且篩選到了可能與胸肌IMF 沉積相關(guān)的核心lncRNA ENSGALG00000041996、ENSGALG00 000053368、LOC107050564、ENSGALG00000048510等，其中可能與胸肌早期發(fā)育階段IMF 沉積相關(guān)的lncRNA ENSGALG00000041996，它可能通過調(diào)控與脂肪酸轉(zhuǎn)運相關(guān)的和與催化線粒體脂肪酸氧化有關(guān)的發(fā)揮作用。

Abu-Elheiga 等研究發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠可以防止肥胖和高脂肪誘發(fā)的糖尿病，Zou 等推測可以促進(jìn)脂質(zhì)合成或沉積，并且發(fā)現(xiàn)皖南花豬中l(wèi)incRNA TCONS_00061360 的高表達(dá)可以正向調(diào)節(jié)脂肪酸氧化途徑的必需調(diào)節(jié)劑——的表達(dá)，從而促進(jìn)脂質(zhì)合成或沉積，在背最長肌中形成更高的IMF 含量。Huang 等對脂肪沉積差異顯著的萊蕪豬和大白豬之間IMF 基因表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，共鑒定出54 個lncRNAs 和482 個mRNAs，研究表明ΧLOC_046142、ΧLOC_004398 和ΧLOC_015408 可能分別靶向和，并在豬IMF 形成和脂質(zhì)蓄積中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。ΧLOC_064 871 和ΧLOC_011001 可能通過調(diào)節(jié)和在脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病中起作用。Sun 等對脂肪型和瘦肉型豬種各3 頭仔豬的肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化過程分4 個階段進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出1 932 個差異lncRNAs，其中l(wèi)nc_000414 與脂肪合成密切相關(guān)，該lncRNA 可作為豬IMF 細(xì)胞增殖的抑制劑。

在牛上，Wang 等構(gòu)建了0.5 歲和2.5 歲2 個發(fā)育階段背最長肌以及其肌內(nèi)脂肪的整個轉(zhuǎn)錄組圖譜差異表達(dá)概況，并且根據(jù)2 個組織中共表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建了ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，推測3 個ceRNA 子網(wǎng)（miR-381-y-TCONS-00016416-SIRT1、miR-122-x-TCONS-000617 98-PRKCA、miR-499-y-TCONS-00084092-LPL）可能在IMF 沉積調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

3 小結(jié)與展望

目前，lncRNA 在畜禽脂肪代謝方面的研究仍處于起步階段，已有研究集中在挖掘新lncRNA 以及l(fā)ncRNA 與miRNA 的相互作用機(jī)制。雖然已有研究解析了部分lncRNA 在脂代謝過程中的調(diào)控機(jī)制，但是由于lncRNA 具有保守性低、作用方式多樣的特點，且畜禽個體間差異大，其功能解析成為研究難點。將挖掘到的lncRNA 進(jìn)行功能解析和調(diào)控機(jī)制的研究，最終實現(xiàn)通過靶向調(diào)節(jié)lncRNA 對畜禽脂代謝進(jìn)行定向調(diào)控，將是相關(guān)研究領(lǐng)域的重要方向之一。