晚期糖基化終末產(chǎn)物的測量分析

王海璇 徐顧航 王智旖

摘要：晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是人體內(nèi)過量糖與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)物。人體內(nèi)AGEs有兩個來源，一種體內(nèi)過量糖與蛋白質(zhì)在體內(nèi)合成AGEs，另一種是通過食物攝入AGEs。體內(nèi)過量AGEs是誘發(fā)慢性炎癥的主要原因，本文就目前AGEs檢測方法進行綜述。

關(guān)鍵詞：晚期糖基化終末產(chǎn)物;熒光檢測法;免疫學檢測法

晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是葡萄糖或其他糖類衍生物與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生的。AGEs促進氧化應(yīng)激反應(yīng)，活化多種轉(zhuǎn)錄因子并產(chǎn)生大量促炎細胞因子。AGEs包括羧甲基賴氨酸（CML）、羧乙基賴氨酸（CEL）、吡咯啉、戊糖苷和甲基乙二醛-賴氨酸二聚體（MOLD）等。目前生物樣本中AGEs的檢測方法主要為色譜法和免疫學法。色譜法包括HPLC/MS、GC-MS和LC-MS/MS等，免疫學法包括ELISA法和免疫印跡法。

AGEs熒光法檢測法非常簡單，是一種無創(chuàng)快速地檢測皮膚內(nèi)AGEs水平的方法。大量臨床研究結(jié)果也證實皮膚中AGEs熒光強度與HPLC法檢測所得血清總AGE濃度存在顯著相關(guān)性。由于糖化血紅蛋白僅能反映1個月以內(nèi)短期血糖水平的異常，而皮膚內(nèi)AGEs自發(fā)熒光水平已經(jīng)被證明是長期糖尿病患者預(yù)測并發(fā)癥發(fā)生的重要指標。不同膚色也影響著皮膚內(nèi)AGEs自發(fā)熒光光水平，深色皮膚受試者AGEs測量值低于淺色皮膚者。皮膚內(nèi)AGEs水平與機體氧化應(yīng)激水平有關(guān)。高水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)會誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，該方法適用于健康人群和患病人群日常健康監(jiān)測。雖然皮膚內(nèi)AGEs自發(fā)熒光水平可以監(jiān)測個體的代謝健康水平，但仍存在局限性，如皮膚內(nèi)還存在各種其他熒光物質(zhì)（煙酰胺腺苷二核苷酸等），具有相同的激發(fā)和發(fā)射光譜范圍（分別為350～410 nm和420～600 nm），會產(chǎn)生干擾效應(yīng)，該技術(shù)在臨床中使用還需要進一步完善。

現(xiàn)有的色譜學技術(shù)，包括質(zhì)譜和氣/液相色譜技術(shù)，可以精確的測定AGEs含量，但這些技術(shù)需要專業(yè)操作人員，且儀器成本也高昂。上述原因?qū)е逻@些技術(shù)難以廣泛使用。LC-MS/MS技術(shù)的靈敏度遠高于熒光檢測法，該技術(shù)可以用于分析檢測樣本中非揮發(fā)性化合物。其一個顯著的特點是通常不需要衍生處理。GC-MS技術(shù)已經(jīng)廣泛用于血漿和尿液中兩種AGEs，包括CML和CEL的檢測分析，并可以精確定量分析食物樣本中 CML含量。目前還有一種基于超高壓液相色譜（UHPLC） 的新技術(shù)，可以實現(xiàn)更高的分辨能力和更快的分析速度。

免疫學方法具有簡便快速等優(yōu)勢，但制備高質(zhì)量的單克隆抗體是關(guān)鍵，但目前仍沒有定量檢測AGEs的標準免疫學方法。雖然ELISA法已廣泛用于檢測血清或其他生物樣本以及食物中的AGEs含量，該方法仍存在局限性，包括現(xiàn)有的抗體缺乏特異性，蛋白質(zhì)糖化交聯(lián)物易導致高檢測背景，以加熱或堿液預(yù)處理樣本易產(chǎn)生無糖化合物干擾。最新研究結(jié)果表明，人血漿或尿液以及各種食物中的CML可以代表總AGEs含量，并且ELISA法檢測CML結(jié)果可靠，與LC-MS/MS法檢測結(jié)果相關(guān)性顯著。此外，血清中AGEs、RAGEs 和sAGEs含量也可以通過蛋白質(zhì)印跡方法來測量。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)較ELISA法具有更高的靈敏度和特異性，能夠檢測到樣品中僅0.1 ng的目的標蛋白質(zhì)。盡管蛋白質(zhì)印跡技術(shù)具有很高的靈敏度和特異性，但它仍可能產(chǎn)生不可靠的結(jié)果。例如當抗體與某種蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)時則可能出現(xiàn)假陽性，當大分子量蛋白質(zhì)沒有足夠時間完全轉(zhuǎn)移至PVDF膜上時則可能會出現(xiàn)假陰性。此外還可能會出現(xiàn)條帶褪色或多條帶等現(xiàn)象，并可能影響結(jié)果的判讀?？偟膩碚f，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的完成需要專業(yè)的實驗人員和實驗室設(shè)備，整個過程耗時耗力，任何一個步驟的細小錯誤就可能會危及整個過程。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)與ELISA技術(shù)的最大區(qū)別在于，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)可以同時檢測多個目標蛋白，而 ELISA法只檢測一種目標蛋白，同時蛋白質(zhì)印跡技術(shù)還可以分析目標蛋白的分子量。因此我們還可以通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分定量分析待檢樣本中AGEs或RAGEs的含量。

總之，檢測樣本中AGEs含量的最佳技術(shù)的選擇取決于以下幾種因素，包括訓練有素的人員、可用的實驗室、資金和研究對象（AGE濃度、樣品數(shù)量、樣品類型等）。選擇合適的AGEs檢測方法可以為臨床診療提供可靠數(shù)據(jù)，而穩(wěn)定可靠的檢測數(shù)據(jù)可以為健康監(jiān)測、糖尿病患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)水平和疾病嚴重程度評估提供可靠的實驗室檢測結(jié)果。

參考文獻

[1] Uribarri J， Cai W， Peppa M， et al. Circulating glycotoxins and dietary advanced glycation endproducts： two links to inflammatory response， oxidative stress， and aging[J]. The Journals of Gerontology Series， 2007， 62（4）：427-433.

[2] Takeuchi M and Yamagishi S. ?Involvement of toxic AGEs （TAGE） in the pathogenesis of diabetic vascular complica- tions and Alzheimer’s disease[J]. Journal of Alzheimer's Disease， 2009， 16（4）：845-858.

[3] Nagai R， Fujiwara Y， Mera K， et al. Immunochemical detection of Nε-（carbox-yethyl）lysine using a specific antibody[J]. Journal of Immunological Methods， 2008， 332（1-2）：112-120.

作者簡介：王海璇（2000—），女，江蘇徐州人，本科在讀，研究方向（糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機制研究）

本論文受江蘇大學大學生科研立項資助（20AD0131）