雞let-7b在不同生長時(shí)期及不同組織中的表達(dá)及其生物信息學(xué)分析與靶基因預(yù)測

黃正洋　王錢?！↑S華云　李春苗　穆春宇　黎壽豐　趙振華

摘要：為探究let-7b在雞不同生長時(shí)期和不同組織中的表達(dá)規(guī)律及生物信息學(xué)特點(diǎn)，以蘇禽3號肉雞為試驗(yàn)材料，檢測雞let-7b在不同時(shí)期和不同組織中的表達(dá)變化，通過生物信息學(xué)工具對常見脊椎動物的let-7b序列特點(diǎn)及基因組定位進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對靶基因進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明，在雞大腦、心、胸肌和腿肌中，let-7b的相對表達(dá)量較高，且90日齡相對表達(dá)量顯著高于3日齡。let-7b位于1號染色體基因間隔區(qū)，不同物種let-7b的成熟序列同源性較高，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，雞let-7b與鳥類聚為一類。靶基因預(yù)測分析共獲得263個(gè)靶基因，對獲得的靶基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析，發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集到蛋白質(zhì)泛素化、miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制和mRNA 3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合等方面。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，靶基因主要富集到絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）通路和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等通路?？傊ulet-7b在組織中廣泛表達(dá)，物種間較為保守;結(jié)合靶基因富集分析結(jié)果，推測let-7b可能通過靶向MAPK和TGF-β等信號通路參與調(diào)控雞肌肉生長及細(xì)胞增殖分化。

關(guān)鍵詞：let-7b;靶基因;生物信息學(xué);表達(dá)分析;雞

中圖分類號：S831.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0429-09

Expression of let-7b in different growth stages and different tissues of chicken and its bioinformatics analysis and target gene prediction

HUANG Zheng-yang，WANG Qian-bao，HUANG Hua-yun，LI Chun-miao，MU Chun-yu，LI Shou-feng，ZHAO Zhen-hua

Abstract：For the object of exploring the expression pattern and bioinformatics characteristics of let-7b in different growth stages and different tissues of chickens， Suqin 3 broiler was used as experimental animal， and the expression changes of chicken let-7b in different growth stages and different tissues were detected. Bioinformatics tools were used to analyze characteristics and genome location of let-7b sequences of common vertebrates， phylogenetic tree was constructed and target genes were predicted. The results showed that， the relative expression levels of let-7b in the brain， heart， pecloralis muscle and leg muscle of chickens were higher than in other tissues. The relative expression level of let-7b in chickens of 90 days age was significantly higher than in chickens of three days age. Gene mapping analysis revealed that， let-7b of chickens was located in the intergenic region on chromosome 1， and the mature sequences of let-7b in different species showed high homology. Results of phylogenetic tree analysis indicated that， let-7b of chickens and let-7b of birds assembled into one category. Target gene prediction revealed that， a total of 263 target genes were obtained. Through functional enrichment analysis of gene ontology （GO） for the obtained target genes， it was found that， let-7b targeted genes were mainly enriched in protein ubiquitination， miRNA-mediated translation inhibition and mRNA 3′-untranslated region （3′-UTR） binding. KEGG pathway analysis showed that， target genes were mainly enriched in mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway， transforming growth factor-β （TGF-β） signaling pathway and progesterone-mediated oocyte meiosis pathway. In conclusion， let-7b of chicken is widely expressed in tissues and is relatively conserved among species. Considering the results of target gene enrichment analysis， it is speculated that let-7b may participate in the regulation of muscle growth and cell proliferation and differentiation through signaling pathways such as targeting MAPK and TGF-β.

Key words：let-7b;target gene;bioinformatics;expression analysis;chicken

肉雞可以提供肌肉產(chǎn)品，如何提高肌肉的產(chǎn)量和質(zhì)量，是肉雞育種研究的重要領(lǐng)域之一[1]。近年來，在肉雞飼料配方?jīng)]有突破性改進(jìn)的情況下，對于肉雞肌肉生長的研究主要集中在功能基因的研究上。多個(gè)調(diào)控肌肉生長的功能基因被克隆出來，其在各個(gè)組織中的表達(dá)規(guī)律也被研究，但是對這些功能基因的調(diào)控，卻缺乏深入研究[2-3]。研究相關(guān)miRNA在組織中的表達(dá)變化規(guī)律，對其靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，能夠在生物信息學(xué)基礎(chǔ)上深入了解相關(guān)miRNA的調(diào)控機(jī)制。

let-7是21世紀(jì)初在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中首先發(fā)現(xiàn)的miRNA，在細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[4]。有研究結(jié)果表明，let-7有高度的保守性、組織特異性和時(shí)空表達(dá)性[5]。目前，共發(fā)現(xiàn)13個(gè)let-7家族成員，廣泛存在于動物各個(gè)組織細(xì)胞中。赫曉燕等[6]研究了成年羊駝耳部和背部皮膚組織中的miRNA差異，發(fā)現(xiàn)let-7b可能參與了皮膚和毛囊更新、生長發(fā)育及毛發(fā)生長品質(zhì)的調(diào)控。吳明林等[7]利用Solexa測序技術(shù)從牙鲆中成功鑒定出let-7家族的10個(gè)成員，研究發(fā)現(xiàn)，let-7是時(shí)序發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子，在促進(jìn)幼體向成體轉(zhuǎn)變的發(fā)育過程中起著極其重要的作用。曹蕊[8]研究了let-7家族在不同類型豬卵泡中的表達(dá)變化，并通過多種試驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證了let-7對顆粒細(xì)胞的影響，推測let-7家族參與調(diào)控豬卵泡閉鎖過程，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。江倩[9]研究了let-7a在絨山羊毛囊發(fā)育周期中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在不同生育時(shí)期均有表達(dá)，且Cmyc和FGF5是let-7a的靶基因。目前對let-7的研究，大部分集中在其對哺乳動物卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡方面，對家禽特別是雞肌肉生長的研究還比較少。

鑒于let-7b與肌肉生長及卵母細(xì)胞增殖分化的關(guān)系密切，本研究以蘇禽3號肉雞為試驗(yàn)材料，通過文獻(xiàn)和miRBase檢索脊椎動物的let-7b序列，利用Ensembl數(shù)據(jù)庫確定典型物種的let-7b在基因組中的位置，根據(jù)let-7b前體序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;使用miRmap、miRDB和TargetScan網(wǎng)站預(yù)測let-7b靶基因，并進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和KEGG信號通路分析;利用RT-qPCR技術(shù)檢測不同生長時(shí)期雞let-7b在各個(gè)組織中的表達(dá)變化，為進(jìn)一步揭示let-7b在雞骨骼肌生長及細(xì)胞增殖分化中的調(diào)控作用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選取江蘇省家禽科學(xué)研究所選育的蘇禽3號肉雞為試驗(yàn)對象，隨機(jī)選取1日齡健康雛雞（母雞）300羽，在相同的管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)，自由采食與飲水，并按常規(guī)免疫程序接種。試驗(yàn)在江蘇省家禽科學(xué)研究所邵伯試驗(yàn)基地進(jìn)行。肉雞3日齡（生長初期）和90日齡（上市前）時(shí)，分別隨機(jī)選取5羽母雞取心、肝、腎、胸肌、腿肌、大腦和卵巢等樣品，液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑與儀器

miRcute miRNA提取分離試劑盒（DP501）、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR211）、miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒（FP411））均購自天根生化科技（北京）有限公司;96孔熒光定量PCR板和 RNase free ddH2O、無酶槍頭、離心管均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。5810R高速離心機(jī)和PCR儀均購自德國Eppendorf公司，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI Applied Biosystems公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)miRbase上雞gga-let-7b序列（登錄號：MIMAT0026503），利用miRNA Design V1.01軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物（加尾法），以U6為內(nèi)參基因，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息如表1所示。

1.4miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成

采用miRNA提取分離試劑盒分別提取各組織樣品總RNA。每個(gè)樣品取3 μl總RNA，采用加A法進(jìn)行miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。20.0 μl反應(yīng)體系為：Total RNA 2 μg，2×miRNA RT Reaction Buffer 10.0 μl，1×miRNA RT Enzyme Mix 2.0 μl，RNase-Free ddH2O補(bǔ)至20.0 μl。反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。合成的cDNA反應(yīng)液可放置于-20 ℃保存，以備下游熒光定量檢測。

1.5let-7b在雞不同組織內(nèi)的定量表達(dá)檢測

采用SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行miRNA熒光定量檢測，反應(yīng)條件和程序按照miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書操作。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行，U6作為內(nèi)參基因。20.0 μl反應(yīng)體系：2×miRcute Plus miRNA PreMix （SYBR&ROX） 10.0 μl、上游引物 1.0 μl、下游引物 0.4 μl、miRNA第一鏈cDNA 1.0 μl、50×ROX Reference Dye 1.6 μl，加ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 15 min，預(yù)變性;94 ℃變性20 s，60 ℃延伸34 s，45個(gè)循環(huán);熔解曲線分析。每個(gè)樣本重復(fù)3次，采用2-△△Ct計(jì)算miRNA相對表達(dá)量。

1.6let-7b序列的獲得

從miRBase 22.1（http：//www.mirbase.org/）[10]網(wǎng)站下載全部物種miRNA成熟序列，篩選let-7b序列，去除植物以及不常見物種的miRNA序列，只保留脊椎動物的miRNA成熟序列及前體序列。let-7b序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

1.7let-7b基因定位及序列分析

采用Ensembl數(shù)據(jù)庫的BLAST程序（http：//asia.ensembl.org/index.html），以牛、家犬、山羊、斑馬魚、雞、人、小鼠、家兔、綿羊和斑胸草雀等10個(gè)物種的let-7b前體序列作為查詢序列對其基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，以確定let-7b在基因組染色體上的位置。選取46種典型物種的46條let-7b的成熟序列，使用MEGA 11.0軟件[11]（https：//www.megasoftware.net/）中Clustal W程序?qū)et-7b基因的成熟序列進(jìn)行多序列比對（Multiple sequences alignment，MSA），分析序列特點(diǎn)。

1.8系統(tǒng)發(fā)生分析

選取46種典型物種的46條let-7b的前體序列，使用MEGA 11.0軟件中Clustal W程序進(jìn)行多序列比對分析，采用基于距離參數(shù)的鄰接法（Neighbor-joining， NJ），并自展分析（Bootstrap） 1 000次，構(gòu)建let-7b基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.9let-7b靶基因預(yù)測及功能分析

利用3個(gè)在線軟件miRmap[12]（https：//mirmap.ezlab.org/）、miRDB[13-14]（http：//www.mirdb.org/.org/）和TargetScan[15]（http：//www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測gga-let-7b的靶基因。選取在3個(gè)軟件預(yù)測中至少出現(xiàn)2次的基因，既可以防止預(yù)測到的靶基因過少無法進(jìn)行后續(xù)分析，也能夠降低預(yù)測結(jié)果的假陽性。對獲得的靶基因使用在線工具DAVID[16]（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO（Gene ontology，GO）功能分析和KEGG pathway（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway）富集分析。

1.10數(shù)據(jù)處理

采用2-△△Ct法分析let-7b基因在雞不同組織中的相對表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）來表示。用SPSS 26.0軟件單因素方差分析進(jìn)行差異性分析，以P<0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01作為差異極顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果與分析

2.1let-7b在雞不同組織中的表達(dá)檢測

對雞胸肌、腿肌、心和肝等組織中的let-7b表達(dá)變化進(jìn)行了檢測，結(jié)果（圖1）顯示，let-7b在雞大腦、心、胸肌和腿肌中的相對表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05）。對3日齡和90日齡的母雞組織器官中l(wèi)et-7b表達(dá)變化進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與3日齡的雛雞相比，90日齡雞大腦、心、胸肌和腿肌中l(wèi)et-7b的相對表達(dá)量都顯著上升（P<0.05），肝、卵巢和腎中l(wèi)et-7b的相對表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。

2.2let-7b基因定位

通過文獻(xiàn)和miRBase檢索共搜索46種脊椎動物46條let-7b序列，發(fā)現(xiàn)雞、人、小鼠、家犬和綿羊等46種脊椎動物都只具有l(wèi)et-7b一種形式。由于家族基因命名的不同，導(dǎo)致let-7b呈現(xiàn)出以下2種名稱變化：let-7b和let-7b-5p，在雞中也只發(fā)現(xiàn)了一種let-7b的成熟體。

以雞、人、小鼠和斑馬魚等10個(gè)物種的let-7b前體序列作為查詢序列，分別對這些生物的基因組進(jìn)行BLAST搜索，確定各序列在基因組中的位置，基因定位結(jié)果（表3）顯示，let-7b家族的成員均位于基因間隔區(qū)，且主要分布在1號和5號等染色體上，大部分在過氧化物酶體增殖物激活受體基因（PARAA）和無翅型鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）整合位點(diǎn)家族成員7B基因（WNT7B）附近。其中雞let-7b位于1號染色體上WNT7B與PPARA基因間隔區(qū)。

2.3let-7b序列分析

選取46種典型物種的46條let-7b的成熟序列進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果如圖2所示，let-7b的成熟序列同源性很高，序列長度相近，均為21～22 nt，保守的堿基數(shù)18個(gè)，分別為第1～11位堿基、第13～14位堿基、第16～18位堿基以及第20～21位堿基，說明let-7b在不同物種間高度保守。圖2顯示，let-7b在部分物種中第12位和第15位堿基出現(xiàn)了G>U突變，在第19位堿基出現(xiàn)了G>A突變，在第22位末端的堿基存在不同程度的缺失。

2.4let-7b系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

采用MEGA 11.0軟件，以代表性物種的let-7b序列構(gòu)建基于距離參數(shù)的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）顯示，let-7b基因主要分布于哺乳類、鳥類、魚類和兩棲類動物中，而雞的let-7b與斑胸草雀等其他鳥類聚為一類，哺乳動物的let-7b獨(dú)自聚為一類。這表明let-7b基因在鳥類、魚類和哺乳動物中廣泛存在。

2.5let-7b靶基因預(yù)測及功能分析

使用3種miRNA在線靶基因預(yù)測軟件（miRDB、TargetScan和miRmap）分別預(yù)測到564個(gè)、360個(gè)和717個(gè)gga-let-7b靶基因，取3個(gè)軟件預(yù)測結(jié)果中至少出現(xiàn)2次的基因，并集后共得到263個(gè)靶基因（圖4）。

對預(yù)測獲得的靶基因使用在線工具DAVID進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果如圖5所示。在生物學(xué)過程分類中，靶基因主要富集到DNA模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞對氨基酸刺激的反應(yīng)、泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程、蛋白質(zhì)泛素化、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制、蛋白激酶B信號的正調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞對轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）刺激的反應(yīng)等過程。在細(xì)胞組分分類中，靶基因主要富集到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核膜、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合的細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)mRNA加工體、IV型膠原三聚體和干細(xì)胞因子（SCF）泛素連接酶復(fù)合物中。在分子功能分類中，靶基因主要富集到金屬離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性（序列特異性DNA結(jié)合）、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、核苷酸結(jié)合、受體信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、miRNA結(jié)合和mRNA 3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合等分子功能。對靶基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析，結(jié)果如圖6所示，靶基因主要富集到焦點(diǎn)粘連、細(xì)胞外基質(zhì)受體的相互作用、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、TGF-β信號通路和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等通路。

3討論

let-7b是let-7家族的重要成員之一，let-7家族成員在顆粒細(xì)胞的閉鎖及細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，所以let-7b在這個(gè)過程中也發(fā)揮著重要的功能。眾所周知，miRNA是一種起調(diào)控作用的內(nèi)源性基因，參與了多種調(diào)控過程。先前的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA主要是通過序列中的種子序列與靶基因的3′UTR堿基互補(bǔ)配對，從而發(fā)揮調(diào)控功能。

羅文[17]通過篩選參與調(diào)控雞成肌細(xì)胞增殖和分化的候選miRNAs，發(fā)現(xiàn)let-7b和miR-128的表達(dá)以及MAPK通路活性在不同類型骨骼肌中存在顯著差異。趙博文[18]基于公開的魚類小RNA組信息，系統(tǒng)分析了魚類let-7的系統(tǒng)進(jìn)化，并以團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）為研究對象，探討了let-7對魚類生長和性腺發(fā)育的表達(dá)調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7a/b在團(tuán)頭魴不同發(fā)育時(shí)期卵巢、腦和垂體中表達(dá)量最高，let-7a/b在團(tuán)頭魴性腺發(fā)育過程中可能扮演著重要角色。路璐等[19]對鵝不同生殖周期內(nèi)的let-7表達(dá)變化以及基因序列進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7g與let-7h在就巢期的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期，說明let-7在鵝生殖周期內(nèi)有著一定的調(diào)節(jié)作用。王建蒙等[20]以內(nèi)蒙古絨山羊皮膚為試驗(yàn)材料，探索了褪黑激素（MT）對let-7家族成員及其靶基因周期性表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)褪黑激素可通過影響let-7家族重要成員的表達(dá)水平，進(jìn)而在皮膚毛囊的周期性生長過程中發(fā)揮重要作用。在本研究中，對雞胸肌、腿肌、心和肝等組織的let-7b表達(dá)變化進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7b在雞大腦、心、胸肌和腿肌中的相對表達(dá)量高于其他組織。對3日齡和90日齡的母雞組織器官中l(wèi)et-7b的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與3日齡的雛雞相比，90日齡母雞的大腦、心、胸肌和腿肌中l(wèi)et-7b相對表達(dá)量都顯著上升，肝、卵巢和腎臟中l(wèi)et-7b的相對表達(dá)量差異不顯著。這表明，在雞生長發(fā)育的早期，新陳代謝活動旺盛，抑制因素較少;但是到了生長發(fā)育的中期，個(gè)體已經(jīng)到達(dá)成熟期，有多個(gè)因素制約生長發(fā)育活動，此時(shí)let-7b表現(xiàn)為高表達(dá)。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)let-7b存在于不同的物種之中，有多個(gè)靶基因，如GHR[21]、IGF2BP3[22]、EDA[23]、TGFβR I[24]、Penk1[25]、MAP3K1[26]、和FGF5[27]等。這表明，let-7b可能具有多個(gè)靶基因，其作用的發(fā)揮可能是通過作用多個(gè)靶基因，從而從多個(gè)通路來調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的過程。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在46種常見的脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)46條let-7b序列，也就是說幾乎所有物種都只有1條成熟序列;對let-7b進(jìn)行基因定位分析，發(fā)現(xiàn)雞let-7b位于1號染色體上的PPARA與WNT7B基因間隔區(qū)。結(jié)構(gòu)決定功能，這說明let-7b的功能正常發(fā)揮，可能與PPARA與WNT7B基因關(guān)聯(lián)密切。常見物種let-7b成熟序列多序列比對分析結(jié)果表明，不同物種let-7b的序列較為保守，這表明let-7b可能發(fā)揮著重要的生理功能。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，雞let-7b與斑胸草雀等其他鳥類聚為一類，這表明let-7b在鳥類進(jìn)化過程中是保守的。let-7b靶基因預(yù)測和功能分析發(fā)現(xiàn)共有263個(gè)靶基因。GO功能富集分析結(jié)果表明，靶基因主要富集到DNA模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞對氨基酸刺激的反應(yīng)、泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程、蛋白質(zhì)泛素化、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制、蛋白激酶B信號的正調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞對TGF-β刺激的反應(yīng)等生物學(xué)過程，細(xì)胞質(zhì)mRNA加工體、IV型膠原三聚體和SCF泛素連接酶復(fù)合物等細(xì)胞組分，金屬離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性（序列特異性DNA結(jié)合）、受體信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、miRNA結(jié)合和mRNA 3′-UTR結(jié)合等分子功能。KEGG pathway分析結(jié)果表明，靶基因主要富集到焦點(diǎn)粘連、細(xì)胞外基質(zhì)受體的相互作用、MAPK信號通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、TGF-β信號通路和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等通路。這些通路均與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)。本研究首次研究了let-7b在雞不同生長階段和不同組織中的表達(dá)規(guī)律，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，預(yù)測了其在雞肌肉生長過程中的功能，但是let-7b的作用機(jī)制及其靶基因的靶向關(guān)系驗(yàn)證尚待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]文杰. 我國黃羽肉雞品種改良最新進(jìn)展及未來發(fā)展方向[J]. 飼料與畜牧， 2019（8）： 22-25.

[2]辛翔飛，鄭麥青，文杰，等. 2020年我國肉雞產(chǎn)業(yè)形勢分析、未來展望與對策建議[J]. 中國畜牧雜志， 2021， 57（3）： 217-222.

[3]趙桂蘋. 肉雞種業(yè)技術(shù)發(fā)展趨勢[J]. 北方牧業(yè)， 2021（11）： 23.

[4]SU J， CHEN P， JOHANSSON G， et al. Function and regulation of let-7 family microRNAs[J]. Trends in cell biology， 2012， 18（10）： 505-516.

[5]ROUSH S， SLACK F J. The let-7 family of microRNAs[J]. Trends in cell biology， 2008， 18（10）： 505-516.

[6]赫曉燕，郝歡慶，劉丹丹，等. 青年羊駝耳部和背部皮膚組織中miRNA差異表達(dá)研究[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， 2010， 26（11）： 1016-1022.

[7]吳明林，施志儀，付元帥，等. Let-7d在牙鲆變態(tài)發(fā)育期間的表達(dá)及靶基因預(yù)測[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 21（3）： 344-350.

[8]曹蕊. Let-7家族miRNA調(diào)控豬卵泡閉鎖的分子機(jī)制研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

[9]江倩. miR-let-7a在遼寧絨山羊毛囊發(fā)育周期中的差異表達(dá)及其靶基因功能鑒定[D]. 長春：吉林大學(xué)， 2015.

[10]KOZOMARA A， BIRGAOANU M， GRIFFITHS-JONES S. Mirbase： from microrna sequences to function[J]. Nucleic Acids Research， 2019， 47（1）： 155-162.

[11]TAMURA K， STECHER G， KUMAR S. MEGA11： Molecular evolutionary genetics analysis version 11[J]. Molecular Biology and Evolution， 2021， 38（7）： 3022-3027.

[12]VEJNAR C E， ZDOBNOV E M. miRmap： Comprehensive prediction of microRNA target repression strength[J]. Nucleic Acids Research， 2012， 40（22）： 11673-11683.

[13]CHEN Y，WANG X. Mirdb： an online database for prediction of functional microRNA targets[J]. Nucleic Acids Research， 2020， 48（1）： 127-131.

[14]LIU W J，WANG X W. Prediction of functional microrna targets by integrative modeling of microRNA binding and target expression data[J]. Genome Biology， 2019， 20（1）： 18.

[15]AGARWAL V， BELL G W， NAM J W， et al. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs[J]. eLIFE，2015， 4： e05005.

[16]JIAO X， SHERMAN B T， HUANG D W， et al. DAVID-WS： a stateful web service to facilitate gene/protein list analysis[J]. Bioinformatics， 2012， 28（13）：1805-1806.

[17]羅文. miRNAs介導(dǎo)的信號通路對雞成肌細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[18]趙博文. 魚類let-7家族的系統(tǒng)進(jìn)化及表達(dá)與團(tuán)頭魴生長和性腺發(fā)育的相關(guān)性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

[19]路璐，顧天天，劉然，等. let-7基因家族序列分析及其在鵝生殖周期內(nèi)的表達(dá)變化[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2018， 26（9）： 1557-1566.

[20]王建蒙，付紹印，麗春，等. 褪黑激素對內(nèi)蒙古絨山羊皮膚中l(wèi)et-7家族及其靶基因的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2019， 50（7）： 1367-1379.

[21]劉咸，劉燊，岳孝亭，等. 雞miRNA let-7b靶向調(diào)控GHR基因的雙熒光素酶驗(yàn)證[J]. 中國家禽， 2019， 41（5）： 11-15.

[22]岳孝亭，劉燊，楊承忠，等. let-7b介導(dǎo)IGF2BP3表達(dá)抑制雞成肌細(xì)胞增殖效果的研究[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào)， 2018， 39（2）： 12-17.

[23]劉寧. let-7b通過下調(diào)靶基因EDA調(diào)控羊駝毛發(fā)生長的研究[D]. 太原：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[24]申艷. let-7b通過其靶基因TGFβR Ⅰ調(diào)控羊駝毛生長的研究[D]. 太原：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

[25]李蒙. let-7b通過靶向Penk1基因調(diào)控大鼠電針耐受[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

[26]楊娟. let-7b過表達(dá)通過MAP3K1靶基因調(diào)節(jié)綿羊FGC的凋亡與增殖[D]. 蘭州：西北民族大學(xué)， 2020.

[27]王婷. let-7b介導(dǎo)FGF5表達(dá)調(diào)控羊駝毛生長的研究[D]. 太原：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-07-26

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-41-Z05）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（20）2012];江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（BA2019049）

作者簡介：黃正洋（1987-），男，河南信陽人，博士，助理研究員，主要從事家禽遺傳育種研究。（E-mail）zyhuang@qq.com

通訊作者：趙振華，（E-mail）zzh0514@163.com