整合素αvβ1在豬流行性腹瀉病毒（PEDV）侵染Vero細(xì)胞過程中的作用

原冬偉　王一　欒廣宇　張旭

摘要：為明確整合素αvβ1在豬流行性腹瀉病毒（PEDV）侵染過程中的作用，通過對(duì)整合素αvβ1在Vero細(xì)胞表面的過表達(dá)和抑制反應(yīng)，檢測PEDV在侵染過程中的病毒載量和蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞表面整合素αvβ1的過表達(dá)使病毒載量和蛋白質(zhì)表達(dá)量升高，Vero細(xì)胞表面整合素αvβ1基因的沉默使病毒載量和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著降低。整合素αvβ1可促進(jìn)PEDV侵染Vero細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：整合素αvβ1;PEDV;侵染;Vero細(xì)胞

中圖分類號(hào)：S858.282.65+9.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2022）02-0422-07

Role of integrin αvβ1 for porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） infection in Vero cells

YUAN Dong-wei，WANG Yi，LUAN Guang-yu，ZHANG Xu

Abstract：In this study， we detected the viral load and protein expression of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） after overexpression and inhibition of integrin αvβ1 on the surface of Vero cells， and then cleared the role of integrin αvβ1 in the PEDV infection process. The results showed that the viral load and protein expression were significantly increased in the Vero cells which overexpressed integrin αvβ1， and the viral load and protein expression were significantly reduced in the Vero cells with silent integrin αvβ1 gene. Integrin αvβ1 promotes PEDV to infect Vero cells.

Key words：integrin αvβ1;porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）;infection;Vero cells

江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2022年第38卷第2期

原冬偉等：整合素αvβ1在豬流行性腹瀉病毒（PEDV）侵染Vero細(xì)胞過程中的作用

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）是豬流行性腹瀉?。≒orcine epidemicdiarrhea， PED）的病原，易感群體涉及不同年齡和不同品系豬，尤其以引起哺乳仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡為主要特征[1]。PED是有季節(jié)變化且有地方流行趨勢的豬消化道傳染性疾病，上世紀(jì)70年代初期在英格蘭被發(fā)現(xiàn)，目前已傳播至全球36個(gè)國家，遍布?xì)W洲、亞洲、美洲，已經(jīng)成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要腸道傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

PEDV為具有囊膜結(jié)構(gòu)的RNA冠狀病毒，是尼多病毒目（Nidovirales）下冠狀病毒科（Coronaviridae）成員，基因組大小約為28 kb，由5′和3′非翻譯區(qū)（UTR）以及7個(gè)開放閱讀框組成，編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白及3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，排列順序?yàn)?′UTR-ORF1a-ORF1b-纖突糖蛋白基因（S）-ORF3-小包膜蛋白基因（E）-膜糖蛋白基因（M）-核衣殼蛋白基因（N）-3′UTR[3]。PEDV感染宿主細(xì)胞的過程十分復(fù)雜，主要通過病毒表面纖突糖蛋白與宿主細(xì)胞表面膜蛋白及碳水化合物分子的結(jié)合，促進(jìn)病毒感染[4]。豬氨基肽酶N（pAPN）曾被報(bào)道是PEDV的細(xì)胞受體參與病毒感染，開啟了PEDV侵入機(jī)理的深入研究[5-9]。然而，在后續(xù)試驗(yàn)中證實(shí)，在表達(dá)pAPN的豬睪丸細(xì)胞（ST）中并不能形成PEDV的感染，而對(duì)PEDV易感的非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）又不依賴于氨基肽酶N的表達(dá)[10-13]。因此，pAPN不是PEDV感染宿主細(xì)胞必須存在的蛋白質(zhì)，作為病毒感染宿主細(xì)胞受體的理論尚未完全確證，正處在探索階段，PEDV的侵入機(jī)制仍不清楚。另外，大量研究結(jié)果顯示，病毒感染宿主細(xì)胞并非依賴一種受體，大多病毒都可利用多種受體蛋白質(zhì)，包括冠狀病毒成員在內(nèi)許多囊膜病毒，存在多個(gè)細(xì)胞感染受體或細(xì)胞感染相關(guān)蛋白質(zhì)。在PEDV同科的病毒中，豬傳染性胃腸炎病毒、SARS冠狀病毒、人冠狀病毒229E、鼠冠狀病毒和禽傳染性支氣管炎病毒都存在多個(gè)細(xì)胞感染受體的情況[14-17]。

整合素（Integrin）是一種異源二聚體跨膜蛋白質(zhì)，廣泛分布于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面，可以作為多種病毒（如：人類皰疹病毒、豬瘟病毒、腺病毒、口蹄疫病毒、輪狀病毒、狂犬病毒等）感染受體或輔助受體，促進(jìn)病毒感染宿主細(xì)胞[18]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示，整合素αvβ3能增強(qiáng)PEDV對(duì)非敏感細(xì)胞CHO的黏附，在PEDV感染后表達(dá)水平明顯上調(diào);整合素αvβ3增強(qiáng)了PEDV在Vero細(xì)胞和IECs中的復(fù)制[19-20]。有研究者報(bào)道，細(xì)胞表面蛋白整合素αvβ1在多種病毒侵染細(xì)胞過程中具有促進(jìn)作用[21-23]，而且其與整合素αvβ3為同家族成員，可識(shí)別PEDV S蛋白R(shí)LD配體識(shí)別序列。那么，整合素αvβ1是否也與PEDV感染相關(guān)呢？本研究通過對(duì)整合素αvβ1在Vero細(xì)胞表面的過表達(dá)和抑制反應(yīng)，探索整合素αvβ1在PEDV侵染Vero細(xì)胞過程中的作用，為PEDV侵入宿主細(xì)胞機(jī)制的研究和預(yù)防策略的設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)并指出新的研究方向。

1材料與方法

1.1材料

PEDV標(biāo)準(zhǔn)毒株CV777（GenBank accession no. AF353511.1）、HA標(biāo)記的真核質(zhì)粒（pCAGGS-HA）、表達(dá)整合素αv的真核質(zhì)粒（pCAGGS-αv）、表達(dá)整合素β1的真核質(zhì)粒（pCAGGS-β1）均為前期實(shí)驗(yàn)制備并保存，整合素αv、整合素β1、PEDV N蛋白抗體也為本實(shí)驗(yàn)室制備和保存，非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

1.2試劑

本試驗(yàn)所用到的主要試劑見表1。

1.3siRNA設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中非洲綠猴整合素αv及整合素β1序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成干擾序列siRNA-miαv、siRNA-miβ1、siRNA-NC。siRNA-miαv序列用siRNA A、siRNA B、siRNA C表示，siRNA-miβ1序列用siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3表示，siRNA-NC為試驗(yàn)陰性對(duì)照。siRNA序列見表2。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

常規(guī)方法復(fù)蘇Vero細(xì)胞后用含胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫環(huán)境下培養(yǎng)及傳代。轉(zhuǎn)染前1 d，將傳代Vero細(xì)胞接種于6孔板，次日細(xì)胞生長至70%～80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按Attractene Transfection Reagent（Qiagen）轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別加入待轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)?；騭iRNA序列（100 mg/L）。轉(zhuǎn)染結(jié)束后在37 ℃、5% CO2恒溫環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，間隔6 h后換含胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h收取樣品。每組試驗(yàn)都加設(shè)對(duì)照。

1.5RNA提取及cDNA合成

RNA樣品提取嚴(yán)格遵照病毒RNA提取試劑盒所述步驟執(zhí)行，獲得樣品RNA經(jīng)測定濃度后用于反轉(zhuǎn)錄或-40 ℃保存。樣品RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，反應(yīng)體系參照試劑盒說明書。制備的cDNA于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR

針對(duì)GenBank中整合素αv、整合素β1、PEDV ORF3序列及β-actin序列信息，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（表3），引物由哈爾濱睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。按SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒提供的反應(yīng)體系，分別添加上、下游引物。配制好的反應(yīng)液在避光、低溫條件下混勻、分裝、離心后，放置于ABI QuantStudio 3 RT-qPCR檢測儀中。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，55～60 ℃（根據(jù)引物Tm值選擇退火溫度）30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。檢測完成后，讀取Ct值，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.7免疫印跡分析

首先將完成轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的各組Vero細(xì)胞按試驗(yàn)要求回收，分別加入RIPA細(xì)胞裂解液，在冰浴中裂解30 min，提取細(xì)胞中總蛋白質(zhì)。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度后加入上樣緩沖液，沸水中加熱使蛋白質(zhì)變性，然后取等量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳。蛋白質(zhì)凝膠電轉(zhuǎn)儀上轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，PBS清洗后用5%脫脂乳室溫下封閉2 h，分別加入一抗（整合素αv、整合素β1、PEDV N蛋白抗體）、二抗（HRP標(biāo)記的抗兔、抗鼠IgG），37 ℃孵育2 h。最后加入ECL顯色成像，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。以GAPDH為內(nèi)參，利用Image J圖像分析軟件測定蛋白質(zhì)條帶灰度值，計(jì)算并比較各試驗(yàn)組細(xì)胞樣品中所含蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。

1.8數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 21.0軟件，計(jì)量數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK q檢驗(yàn)，各試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，以P<0.05、P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1整合素αvβ1在Vero細(xì)胞中的過表達(dá)

為明確整合素αvβ1對(duì)PEDV侵染Vero細(xì)胞的影響，我們將質(zhì)粒pCAGGS-αv、pCAGGS-β1利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)染在Vero細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCAGGS-HA作為對(duì)照組。然后利用熒光定量PCR方法和Western blot技術(shù)對(duì)Vero細(xì)胞表面整合素αvβ1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，整合素αvβ1轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比較，整合素αv和整合素β1 mRNA表達(dá)水平均極顯著升高（圖1）;整合素αvβ1轉(zhuǎn)染組蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果與整合素αv和整合素β1 mRNA表達(dá)水平一致，在整合素αvβ1轉(zhuǎn)染組蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)，灰度分析結(jié)果顯示蛋白質(zhì)表達(dá)水平與對(duì)照組差異顯著或極顯著（圖2）。所得結(jié)果表明整合素αvβ1在Vero細(xì)胞中過表達(dá)成功。

2.2過表達(dá)整合素αvβ1對(duì)PEDV侵染vero細(xì)胞的影響

將共轉(zhuǎn)染整合素αvβ1的Vero細(xì)胞接種PEDV，37 ℃孵育6 h后洗滌更換培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于接種后24 h和48 h收取樣品，熒光定量PCR檢測PEDV ORF3 mRNA表達(dá)水平，Western blot技術(shù)檢測PEDV N蛋白質(zhì)表達(dá)水平。試驗(yàn)過程中將HA標(biāo)記的轉(zhuǎn)染組設(shè)為試驗(yàn)對(duì)照。結(jié)果顯示，在病毒感染24 h和48 h后，試驗(yàn)組PEDV ORF3 mRNA表達(dá)水平極顯著升高（圖3）。Western blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示，在病毒感染24 h和48 h后，試驗(yàn)組蛋白質(zhì)表達(dá)條帶明顯增強(qiáng)，灰度分析結(jié)果顯示試驗(yàn)組PEDV N蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨感染時(shí)間延長而升高且與對(duì)照組相比呈顯著差異（圖4）。所得結(jié)果表明，整合素αvβ1的過表達(dá)能夠促進(jìn)PEDV侵染，使PEDV在Vero細(xì)胞內(nèi)的含量明顯增加。

2.3siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)整合素αvβ1在Vero細(xì)胞中表達(dá)的影響

分別將整合素αv和整合素β1的特異性siRNA及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，利用熒光定量PCR 和 Western blot技術(shù)檢測siRNA干擾效果。整合素αv和整合素β1 mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果（圖5）顯示，與siRNA-NC對(duì)照組相比，靶向αv的siRNA A、siRNA B、siRNA C組整合素αv的mRNA水平極顯著下降，靶向β1的siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3組整合素β1的mRNA水平極顯著下降。整合素αv和整合素β1蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測結(jié)果（圖6）顯示，與siRNA-NC對(duì)照組相比，靶向αv的siRNA A、siRNA B、siRNA C組整合素αv蛋白質(zhì)水平均顯著降低，靶向整合素β1的siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3組β1蛋白質(zhì)水平均極顯著降低。以上結(jié)果表明本研究所設(shè)計(jì)的siRNA對(duì)整合素αv和整合素β1在Vero細(xì)胞表面的干擾效果明顯。

2.4整合素αvβ1 siRNA干擾后對(duì)PEDV侵染vero細(xì)胞的影響

為確定降低細(xì)胞表面整合素αvβ1的表達(dá)對(duì)PEDV侵染Vero細(xì)胞的影響，利用干擾效果較好的siRNA分別下調(diào)Vero細(xì)胞表面的整合素αv和整合素β1的表達(dá)，然后感染PEDV，通過熒光定量PCR檢測PEDV感染的Vero細(xì)胞整合素αv、整合素β1以及PEDV感染后PEDV ORF3基因mRNA水平，Western blot技術(shù)檢測siRNA干擾后感染PEDV的Vero細(xì)胞中整合素αv、整合素β1以及PEDV感染后PEDV N蛋白質(zhì)表達(dá)水平。熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖7）顯示，與siRNA NC對(duì)照組相比，試驗(yàn)組整合素αv、整合素β1以及病毒感染后PEDV ORF3基因mRNA表達(dá)水平均降低且差異極顯著。Western blot技術(shù)檢測結(jié)果（圖8）顯示，siRNA干擾試驗(yàn)組整合素αv、整合素β1以及病毒感染后PEDV N蛋白質(zhì)表達(dá)水平與siRNA NC對(duì)照組相比較均明顯降低且差異極顯著。上述結(jié)果表明，整合素αvβ1被干擾表達(dá)后可降低PEDV對(duì)Vero細(xì)胞的侵染。

3討論

PED是PEDV感染后引起的一種豬急性、流行性消化道傳染病。PEDV靶向感染小腸絨毛上皮細(xì)胞，造成小腸絨毛萎縮、上皮細(xì)胞變性壞死脫落，腸黏膜充血、腫脹，吸收不良和嚴(yán)重腹瀉。自2010年10月PED在中國大面積暴發(fā)以來，2013年以后美國、加拿大、墨西哥等北美國家，韓國、日本等亞洲國家及中國臺(tái)灣地區(qū)也相繼暴發(fā)PED，目前已經(jīng)席卷亞洲、歐洲、美洲的大部分地區(qū)，給世界主要生豬養(yǎng)殖地區(qū)和國家?guī)韲?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

闡明PEDV侵染宿主細(xì)胞的機(jī)制是預(yù)防PED發(fā)生的重要基礎(chǔ)性研究。PEDV感染宿主細(xì)胞的過程十分復(fù)雜，主要通過病毒表面纖突糖蛋白與宿主細(xì)胞表面膜蛋白及碳水化合物分子的結(jié)合，促進(jìn)病毒感染[4]。pAPN曾被報(bào)道是PEDV感染宿主細(xì)胞的受體并開展了大量病毒侵入機(jī)制的研究，但隨后pAPN又被證實(shí)只是一種與病毒感染相關(guān)的宿主蛋白質(zhì)[9]。目前認(rèn)為病毒感染并非依賴一種受體蛋白質(zhì)，而是利用位于細(xì)胞表面的多個(gè)受體蛋白質(zhì)，才能完成病毒感染過程。整合素是一種廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的黏附分子，在多種病毒感染宿主細(xì)胞的過程中都起到促進(jìn)或輔助作用，如：整合素α2β1與艾柯病毒1（EV1）的感染有關(guān)[24]，整合素α5β1、αvβ3、αvβ6都可在FMDV感染過程中起到促進(jìn)作用[25]，整合素αvβ3可促進(jìn)日本腦炎病毒（JEV）的感染[26]。整合素β1可以與α亞基結(jié)合，廣泛分布于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞[18， 27]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染Vero細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選結(jié)果顯示整合素αvβ1和整合素αvβ3與病毒感染有關(guān)，且與整合素αvβ1同源的整合素αvβ3已被證明可促進(jìn)PEDV感染細(xì)胞[19- 20]。整合素αvβ1在PEDV主要侵染的仔豬小腸絨毛上皮細(xì)胞中存在[23]，同時(shí)在PEDV高度敏感的Vero細(xì)胞中也存在。本研究在Vero細(xì)胞上通過過表達(dá)和抑制整合素αvβ1的表達(dá)來闡明PEDV在侵染Vero細(xì)胞過程中所受整合素αvβ1的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在Vero細(xì)胞中過表達(dá)αvβ1后，PEDV的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)，證明整合素αvβ1能夠促進(jìn)PEDV侵染細(xì)胞，使PEDV在Vero細(xì)胞內(nèi)的含量明顯增加。RNA干擾技術(shù)（RNAi）是一種基因沉默技術(shù)，是通過導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA同源的雙鏈RNA，來誘發(fā)同源靶mRNA高效、特異性地降解，從而導(dǎo)致靶基因沉默且表達(dá)下降的現(xiàn)象[28-29]。本研究通過siRNA干擾試驗(yàn)反向驗(yàn)證整合素αvβ1與PEDV侵染細(xì)胞的關(guān)系。由于RNAi技術(shù)存在不同位點(diǎn)效應(yīng)，相應(yīng)的序列抑制mRNA降解效率會(huì)有差異，甚至有些序列根本起不到抑制的作用。因此本研究分別設(shè)計(jì)3個(gè)整合素αv與整合素β1基因的siRNA序列，通過檢測轉(zhuǎn)染后Vero細(xì)胞各基因蛋白質(zhì)及核酸水平的變化，篩選出最佳siRNA序列。利用最佳siRNA沉默Vero細(xì)胞表面整合素αvβ1，結(jié)果顯示在被干擾的Vero細(xì)胞感染PEDV 48 h后，PEDV的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下調(diào)，說明整合素αvβ1的干擾可降低PEDV對(duì)Vero細(xì)胞的侵染。綜上所述，整合素αvβ1能夠促進(jìn)PEDV侵染Vero細(xì)胞，由于整合素αvβ1是位于細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，因此整合素αvβ1是否可能作為一種受體蛋白與PEDV的S蛋白相結(jié)合，在病毒的黏附、內(nèi)化過程中起到促進(jìn)作用有待繼續(xù)研究。本研究所獲結(jié)果為PEDV侵入機(jī)制的解析和抗病毒策略設(shè)計(jì)提供了新的研究方向和理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：張震林）

收稿日期：2021-09-16

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2018049）;黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（XYB2014-11）;黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)三橫三縱支持計(jì)劃資助項(xiàng)目（ZRCPY201907）

作者簡介：原冬偉（1980-），男，吉林吉林人，博士，講師，主要從事動(dòng)物傳染病機(jī)制及診斷方法研究。（E-mail）yuandongwei@163.com