生物絮凝劑改性菌絲球負(fù)載好氧反硝化菌T13強化脫氮

孔祥震　郭海娟　馬放　耿明月　肖霄

摘要：由黑曲霉Y3（Aspergillus niger Y3）形成的菌絲球經(jīng)過生物絮凝劑改性強化后作為生物載體固定好氧反硝化菌T13 （Pseudomonas sp. T13），對其固定前后對全氮的去除效能、菌群的活性進行研究并分析固定化對于生物強化脫氮效果的影響。結(jié)果表明，菌絲球負(fù)載T13后去除全氮效能得到了明顯的提高。當(dāng)改性菌絲球（濕質(zhì)量）與T13菌液（3.5×108CFU/ml）的質(zhì)量體積比 為1∶15時，去除全氮的效能最好。改性菌絲球負(fù)載T13后的表觀圖像和電鏡掃描圖像（SEM）顯示，T13細(xì)菌附著在改性菌絲球的表面，且改性菌絲球載體的結(jié)構(gòu)可以連續(xù)培養(yǎng)45 d后仍保持緊實結(jié)構(gòu)。傅里葉紅外光譜（FTIR）和三維熒光光譜（EEM）結(jié)果顯示，胞外聚合物（EPS）在改性菌絲球固定T13的過程中起到了關(guān)鍵作用。菌絲球的菌絲纏繞形成的結(jié)構(gòu)提供了強有力的機械結(jié)構(gòu)，且具有較大的比表面積和良好的傳質(zhì)性能，改性菌絲球可以作為良好的生物載體用于生物強化。

關(guān)鍵詞：改性菌絲球;強化脫氮;好氧反硝化菌;生物載體

中圖分類號：X52文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0377-10

Enhanced nitrogen removal by bioflocculant combined mycelial pellets loaded with aerobic denitrificans T13

KONG Xiang-zhen GUO Hai-juan MA Fang GENG Ming-yue XIAO Xiao

Abstract：After modifying and strengthening of mycelial pellets formed of Aspergillus niger Y3 by bioflocculant， the mycelial pellets were used as bio-carriers to immobilize aerobic denitrifying bacterium T13 （Pseudomonas sp. T13）. Removing capabilities of total nitrogen （TN） and microflora activities of mycelial pellets before and after immobilizing of Pseudomonas sp. T13 were studied， and the influence of immobilization on the denitrification effect strengthened by biological factors was analyzed. The results showed that， the removal efficiency of mycelial pellets in removing TN was effectively improved after immobilizing of Pseudomonas sp. T13. The mycelial pellets showed the best effect in TN removing when the mass-volume ratio of modified mycelial pellets （wet weight） to T13 bacterial suspension （3.5×108 CFU/ml） was 1∶15. Photograph and scanning electron microscope （SEM） images of modified mycelial pellets after immobilizing of Pseudomonas sp. T13 revealed that， the T13 bacteria attached on the surface of mycelial pellets， and the structure of modified mycelial pellets maintained firm and intact after continuous cultivation for 45 days. Results of Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） and three-dimensional excitation-emission matrix （EEM） suggested that， extracellular polymer substances （EPS） played an important role in the process of immobilization of T13 by modified mycelial pellets. The structures formed by entangling structure of mycelial pellets provided strong mechanic structure， and had large specific surface area and fine mass transfer performance. Modified mycelial pellets can be used as good bio-carrier for biomass immobilization.

Key words：modified mycelial pellets;enhanced nitrogen removal;aerobic denitrifying bacterium;biomass carrier

江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報2022年第38卷第2期

孔祥震等：生物絮凝劑改性菌絲球負(fù)載好氧反硝化菌T13強化脫氮

生物強化技術(shù)在污水處理技術(shù)應(yīng)用的過程中具有獨特的優(yōu)勢，如縮短生化系統(tǒng)的啟動周期、提高污染物的去除效率、減少剩余污泥產(chǎn)量等[1]。生物強化脫氮也是污水處理提標(biāo)改造過程中一項重要的生物強化技術(shù)，且研究者已經(jīng)在國內(nèi)外進行了較為廣泛的研究。生物強化脫氮技術(shù)在污水處理系統(tǒng)中利用具有特定脫氮功能微生物的特性，投加功能性微生物菌劑，增加其生物量并提高其功能性活性，加上調(diào)整工藝運行手段來達(dá)到改善脫氮效能的目的，提高了氮素的脫除效果，從而促進出水水質(zhì)的達(dá)標(biāo)排放[2]。但是在投加功能性生物菌劑時，仍會面臨功能性菌種流失的問題，導(dǎo)致系統(tǒng)強化不夠理想。

在生物強化技術(shù)應(yīng)用的過程中，投加合適的載體使功能性微生物附著其上，得以繁殖并維持其活性是解決菌種流失的有效手段[3]。載體固定化技術(shù)不僅可以有效阻止功能菌種的流失，還使得生化系統(tǒng)的固液分離更加簡便，從而提高生化系統(tǒng)的可操作性。固定化載體材料的選擇是固定化技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵所在，合適的材料應(yīng)當(dāng)能為功能性微生物提供良好的附著性能并為微生物的生長繁殖提供適宜的場所。在以往的研究中，多種固定化材料被嘗試用于脫氮細(xì)菌的固定化，如聚乙烯醇[4]、海藻酸鈉[5]、聚氨酯泡沫[6]等。在有載體的情況下，功能性微生物固定在載體上的生長速率雖然沒有游離狀態(tài)下（未固定在載體上）的高，但是其對底物的攝取速率要明顯高于游離狀態(tài)[7]。目前，也有一些學(xué)者對新型生物載體（如生物質(zhì)炭）展開研究，以期降低載體的成本和提高生物強化的性能[8]，新型的生物載體對環(huán)境也更加友好。

菌絲球是霉菌浸沒式生長過程中在特定水力剪切力條件下自發(fā)纏繞成球形成的顆粒，其作為吸附重金屬離子、染料等難降解有機物的材料已獲得較為廣泛的應(yīng)用[9-10]。菌絲球由于其所具備的沉降速率快、易于固液分離、培養(yǎng)簡便和對環(huán)境友好等特點，被越來越多的學(xué)者在研究中嘗試用作一種新型的生物載體。Zhang等[11]將苯胺降解菌（Acinetobacter calcoaceticus JH-9）、化學(xué)需氧量（COD）快速降解菌與黑曲霉Y3形成的菌絲球混合培養(yǎng)后制成的改性菌絲球顆粒用于序批式反應(yīng)器（Sequencing batch reactor， SBR）運行，對苯胺的降解速率起到了一定的促進作用。Wang等[12]利用黑曲霉Y3形成的菌絲球?qū)a(chǎn)絮菌Agrobacterium tumefaciens F2和Bacillus sphaeicus F6固定后采用半連續(xù)發(fā)酵的方式持續(xù)產(chǎn)絮35個周期，直至改性菌絲球顆粒破碎。Zhao等[13]利用黑曲霉Y3形成的菌絲球固定產(chǎn)氫細(xì)菌Clostridium sp. T2進行產(chǎn)氫效能的研究，結(jié)果表明，經(jīng)過菌絲球載體固定的產(chǎn)氫細(xì)菌的累積產(chǎn)氫量隨著菌絲球載體的加入量增加而增加。此外，菌絲球作為生物載體也被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)能微藻的培養(yǎng)和富集[14]，但是其作為載體在實際廢水處理中的應(yīng)用還需要進一步研究。

本研究將黑曲霉Y3形成的菌絲球作為生物載體用于固定好氧反硝化菌T13，對其固定前后對全氮的去除效能、菌群的活性進行研究并分析固定化對于生物強化脫氮效果的影響。此外，對胞外聚合物（EPS）的變化和固定前后的掃描電鏡圖像（SEM）進行表征。

1材料與方法

1.1菌絲球和好氧反硝化菌的培養(yǎng)

菌絲球的培養(yǎng)使用本課題組篩選的黑曲霉Y3作為菌種[15]。培養(yǎng)時采用孢子懸浮液作為接種液。將無菌去離子水加入長有黑曲霉Y3并生成了孢子的固體培養(yǎng)基之上，用經(jīng)消毒的接種環(huán)輕輕將孢子刮下制成孢子懸浮液。將孢子懸浮液裝入經(jīng)滅菌的裝有數(shù)粒玻璃珠的三角瓶內(nèi)，加入適量的無菌去離子水使孢子懸浮液稀釋到一定濃度，旋轉(zhuǎn)振蕩24 h使孢子懸浮液充分混勻分散后在620 nm波長下測量其吸光度OD620。使用孢子懸浮液時的接種量可用下列公式進行計算：

孢子懸浮液接種量=（0.25×0.1%×液體培養(yǎng)基體積）/孢子懸浮液吸光度

菌絲球的培養(yǎng)采用張斯[16]的方法。菌絲球的液體培養(yǎng)基成分為：蔗糖10.0 g，NH4Cl 1.0 g，KH2PO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5g，去離子水1 000 ml。按計算后的接種量接種后，在28 ℃140 r/min 條件下培養(yǎng)48～72 h。

好氧反硝化菌T13的菌種由本課題組篩選[17]。菌種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的菌液在8 000 r/min條件下離心5 min后棄置上清液，將沉淀的菌體使用20 mmol的磷酸緩沖液清洗2次后，使用漩渦振蕩器重新懸浮并充分混勻。制成的T13菌種懸液的含量約為3.5×108CFU/ml。

1.2生物絮凝劑的制備

生物絮凝劑的制備采用產(chǎn)絮細(xì)菌F2[18]。將活化后的絮凝菌F2的菌液按5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，按3∶1的體積比加入無水乙醇使生物絮凝劑析出，棄去無水乙醇，將絮凝劑置入透析袋中，在去離子水中除去乙醇后凍干備用。生物絮凝劑發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為葡萄糖10.0 g，K2HPO4 5.0 g，KH2PO4 2.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，去離子水1 000 ml，pH 7.2～7.5，在112 ℃、30 min條件下滅菌。

1.3改性菌絲球的制備

稱取濕質(zhì)量為30 g的菌絲球放入200 ml、0.2 g/L的生物絮凝劑溶液中，在磁力攪拌器30 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下浸泡12 h，使菌絲球與生物絮凝劑充分接觸后撈出，與30 ml的T13菌種懸浮液混合，在140 r/min、30 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4多糖和蛋白質(zhì)的提取及測定方法

多糖和蛋白質(zhì)經(jīng)加熱后提取[19]。取25 ml充分混勻的樣品置入離心管內(nèi)，在11 000 g、4 ℃條件下離心15 min，棄置上清液，加入0.01%的NaCl溶液并定容至25 ml，使用漩渦振蕩器將離心的沉淀重新完全混勻。將混勻后的樣品在80 ℃水浴條件下加熱30 min，冷卻至室溫后再次在上述條件下離心。離心后，將上清液經(jīng)0.45 μm膜過濾后待測。

蛋白質(zhì)的測定方法采用福林酚法[20]。取1 ml樣品與5 ml試劑Ⅰ充分混合后靜置10 min，然后加入0.5 ml試劑Ⅱ并立即混合，繼續(xù)在室溫下靜置30 min后，使用紫外分光光度計在500 nm波長下測量吸光度。試劑Ⅰ的成分為溶液A與溶液B按50∶1的體積比混合，其中溶液A的成分為Na2CO3 10.00 g、NaOH 2.00 g、KNaC2H2O4·4H2O 0.25 g，定容至500 ml，溶液B的成分為0.5 g CuSO4 ，定容至100 ml。試劑Ⅱ為福林酚試劑。

多糖的測定方法采用苯酚-硫酸法[16]。取1 ml待測樣品裝入10 ml的離心管中，再加入1 ml去離子水和1 ml 6%的苯酚并搖勻，然后快速加入5 ml硫酸（98%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)），靜置10 min并充分混合，繼續(xù)靜置20 min并冷卻至室溫后，使用紫外分光光度計在波長490 nm處測量其吸光度。

1.5脫氫酶活性的測定方法

脫氫酶活性的測定采用TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）法[21]。取5.0 ml上清液樣品加入5.0 ml Tris-HCl溶液（pH=8.4），再依次加入5.0 ml去離子水和10.0 ml 4%的TTC溶液。同時，在對照組中加入0.5 ml的甲醇。將樣品組和對照組用水浴鍋在37 ℃條件下水浴加熱30 min。加熱結(jié)束后，在樣品組和對照組中同時加入5.0 ml三氯甲烷，密封后振蕩10 min，萃取反應(yīng)生成的TF（1，3，5-三苯基甲臜）。萃取結(jié)束后在3 000 r/min下離心5 min，離心結(jié)束后取下層三氯甲烷溶液在波長485 nm下測量吸光度。在測定菌絲球載體顆粒上的脫氫酶活性時，將樣品搖勻并取5.0 ml的懸浮液，靜置沉淀后將上清液棄置，再加入去離子水并定容至相同體積，后續(xù)步驟同上。

1.6傅里葉紅外光譜（FTIR）樣品的預(yù)處理及檢測

菌絲球載體固定好氧反硝化菌T13前后的FTIR樣品預(yù)處理及測定步驟如下：將菌絲球載體樣品凍干后與溴化鉀（KBr）按1∶100（質(zhì)量比）混合并壓縮，制成樣品后使用Perkin Elmer Spectrum One B傅里葉變換光譜儀進行光譜測量。

1.7三維熒光光譜（EEM）樣品的檢測

三維熒光光譜使用日本Jasco的FP6500熒光光譜儀進行測量，發(fā)射波長為220～500 nm，波長掃描間隔為5 nm，吸收波長在220～600 nm內(nèi)檢測，步進為1 nm。測量速率設(shè)置為2 000 nm/min。

1.8電鏡掃描圖像（SEM）樣品的預(yù)處理及檢測

將樣品置于使用0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH=7.4）配制的4%戊二醛溶液中，在4 ℃下浸泡1 h，對顆粒表面的菌體進行固定，固定后使用相同的緩沖液清洗3次。將樣品依次在50%、70%、80%和90%的乙醇溶液中浸泡15 min進行脫水，最后再在無水乙醇中浸泡15 min。脫水后的樣品置于干燥器中保存待測。測量前，將脫水樣品表面進行噴金處理再上機檢測。

2結(jié)果與分析

2.1改性菌絲球負(fù)載T13對全氮的去除效能

將改性菌絲球（濕質(zhì)量）與T13菌液按1∶30、1∶15、1∶10、1∶6的質(zhì)量體積比分別負(fù)載后進行全氮去除效能的試驗，以未添加改性菌絲球的T13菌液為對照。并在相同負(fù)載比例下與未經(jīng)生物絮凝劑強化的菌絲球負(fù)載T13進行全氮去除效能的對比，結(jié)果如圖1所示。從圖1a中可以看出，培養(yǎng)至13 d時，未經(jīng)生物絮凝劑強化的菌絲球負(fù)載T13后可較為明顯地提升對全氮的去除效能，1∶15、1∶10和1∶6負(fù)載比例下的全氮去除率分別為43.09%、40.90%和40.91%，而T13菌液（對照組）的全氮去除率僅為26.09%。圖1b中經(jīng)過生物絮凝劑改性強化后的菌絲球負(fù)載T13后的全氮去除效能有了更為明顯的提升，培養(yǎng)至13 d時，1∶15、1∶10和1∶6負(fù)載比例下的全氮去除率分別為52.10%、49.36%和50.26%。其中，以1∶15負(fù)載比例的菌絲球負(fù)載T13后的全氮去除率最為穩(wěn)定。

不同負(fù)載比例條件下生物絮凝劑改性菌絲球負(fù)載T13對去除全氮效能的影響如表1所示。由圖1和表1可見，在沒有菌絲球作載體的情況下，盡管加入了生物絮凝劑，但游離的T13菌液對全氮的去除效能與未添加生物絮凝劑的差異并不顯著（P>0.05），表明添加生物絮凝劑與否對T13游離菌去除效能沒有顯著影響。而在生物絮凝劑改性菌絲球負(fù)載T13之后，全氮的去除效能與未經(jīng)生物絮凝劑改性的菌絲球相比，差異顯著（P<0.05）。結(jié)果表明，在有生物絮凝劑改性強化的情況下，菌絲球負(fù)載T13去除全氮的效能有顯著提高，從經(jīng)濟適用的角度出發(fā)，菌絲球的負(fù)載比例為1∶15較為合適，在滿足全氮去除效能提升的前提下，無需更多菌絲球載體的加入。

2.2改性菌絲球負(fù)載T13的脫氫酶活性變化

由圖2可見，經(jīng)過和未經(jīng)過生物絮凝劑改性強化的樣品中，其上清液中脫氫酶活性隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)急劇下降的趨勢，而菌絲球載體顆粒上的脫氫酶活性則表現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢。在T13固定后培養(yǎng)初期，液體培養(yǎng)基中存有大量的游離T13細(xì)菌，在每天更換50%培養(yǎng)基時，會隨著棄置的液體流失部分菌體，因此上清液中的脫氫酶活性也隨之降低。而顆粒上的菌量隨著培養(yǎng)時間的延長則在不斷增加，因此顆粒上的脫氫酶活性在逐漸升高。對比圖2a、圖2c，可以看出，生物絮凝劑改性與否對菌絲球負(fù)載T13后上清液中的脫氫酶活性影響較小，當(dāng)負(fù)載比例為1∶15時，生物絮凝劑改性的菌絲球比未經(jīng)改性的菌絲球負(fù)載T13后在連續(xù)培養(yǎng)第13 d時的上清液脫氫酶活性高2.55 mg/g。而對比圖2b、圖2d可以看出，培養(yǎng)第13 d時，負(fù)載比例為1∶15時生物絮凝劑改性的菌絲球比未經(jīng)改性的菌絲球負(fù)載T13后的脫氫酶活性高了7.51 mg/g，提高幅度約62.3%。由于脫氫酶活性的強弱代表了T13活性的強弱和菌量的大小，因此這一結(jié)果證明，菌絲球的改性與否對上清液中T13的活性和菌量沒有顯著影響，而改性后的菌絲球使T13的固定化效果得到了較為顯著的提升。

2.3改性菌絲球負(fù)載T13后蛋白質(zhì)和多糖含量的變化趨勢

由圖3可知，蛋白質(zhì)的含量在培養(yǎng)前7 d里呈現(xiàn)出下降的趨勢，然后在后續(xù)的6 d內(nèi)又呈現(xiàn)出了上升的趨勢，負(fù)載比例為1∶15、1∶10和1∶6的改性菌絲球負(fù)載T13后的蛋白質(zhì)含量在培養(yǎng)第13 d時分別達(dá)到了59.93 mg/g、65.23 mg/g和58.55 mg/g。前7 d的培養(yǎng)過程中，有部分菌體隨著更換培養(yǎng)基時棄置的液體流失，因此蛋白質(zhì)含量均降低，而在后6 d的培養(yǎng)過程中，隨著固定在改性菌絲球載體上的T13生長繁殖，蛋白質(zhì)含量升高。多糖的含量在13 d的培養(yǎng)過程中變化不是十分明顯，總體呈現(xiàn)出較為平緩的趨勢，到培養(yǎng)第13 d時除1∶15比例下的多糖含量比培養(yǎng)第1 d升高了3.21%外，1∶30、1∶10、1∶6和對照組中的多糖含量分別下降了4.95%、28.81%、39.84%和21.85%。負(fù)載比例為1∶15時多糖和蛋白質(zhì)含量隨時間變化的影響如表2所示，可以看出，培養(yǎng)至第13 d時，蛋白質(zhì)含量相比于培養(yǎng)初始時有了顯著降低，而多糖的含量在培養(yǎng)第4～7 d時稍有上升，至培養(yǎng)第13 d后又恢復(fù)了初始水平。這是由于作為載體核心菌絲球，其細(xì)胞壁主要組成中含有較大量的多糖[22]，且改性菌絲球負(fù)載T13的活性顆粒的多糖成分的主要來源是菌絲球。同時，培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基成分pH始終保持在6.8～7.0，而制備菌絲球的黑曲霉Y3并不適宜在這種環(huán)境下生長[23-24]，因此，菌絲球在這樣的共培養(yǎng)條件下僅作為生物載體且生長速率極其緩慢。另外，菌絲球載體的結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)過程中可能也有少許破損脫落，因此多糖的含量有少許的降低。

2.4改性菌絲球負(fù)載T13后傅里葉紅外（FTIR）光譜的變化

菌絲球和改性菌絲球負(fù)載T13后的FTIR光譜如圖4所示，識別出的主要吸收峰如表3所示。兩者的FTIR光譜吸收曲線大致相似，但在改性菌絲球負(fù)載T13后，也有幾處波數(shù)下的吸收峰發(fā)生了變化。光譜在3 320 cm-1處的吸收峰較寬且深，是羥基基團中O-H鍵的伸縮振動引起的，在2 927 cm-1處的銳峰是C-H鍵的伸縮振動引起的。在1 154 cm-1處的吸收峰在改性菌絲球負(fù)載T13的曲線中變得更加銳利，這是典型的多糖中-O-C-O基團伸縮振動引起的吸收峰，結(jié)合3 320 cm-1處的寬峰，可以推斷出菌絲球中含有大量的多糖類物質(zhì)。在1 655 cm-1處的吸收峰是C=O和C-N （酰胺Ⅰ帶）的伸縮振動引起的，1 540 cm-1處的吸收峰則是C-N的伸縮振動和N-H的形變振動（酰胺Ⅱ帶）引起的，這2處吸收峰是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)特有的FTIR吸收峰，并且在改性菌絲球負(fù)載T13的測定中吸收峰更加銳利，表明蛋白質(zhì)在改性菌絲球負(fù)載T13的過程中起到了重要作用。1 400 cm-1處的吸收峰是天冬氨酸特有的去質(zhì)子化的羧基中C=O的對稱振動引起的，且該吸收峰在改性菌絲球負(fù)載T13時顯現(xiàn)得更加明顯，也表明蛋白質(zhì)在菌絲球固定功能菌的過程中起到了作用。1 075 cm-1處的吸收峰則是多糖中C-O的不對稱伸縮振動引起的，866 cm-1、541 cm-1和528 cm-1處的吸收峰則表明在改性菌絲球中不飽和鍵數(shù)量的增加。有研究結(jié)果表明，羧基和胺基與細(xì)菌附著固定在固體表面時的過程有關(guān)[25-27]。

2.5改性菌絲球負(fù)載T13后EEM的變化

選擇1∶15負(fù)載比例條件下的改性菌絲球，取樣后測定EEM隨培養(yǎng)時間延長的變化，結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，樣品的EEM圖包括了4個明顯的峰。第1個主峰是激發(fā)/發(fā)射波長（Ex/Em），位于280 nm/340～345 nm處的A峰，第2個主峰是Ex/Em，位于230 nm/330～340 nm處的B峰。據(jù)報道，這2個峰的熒光與蛋白質(zhì)類物質(zhì)的存在相關(guān)，A峰所在的位置主要和芳香類、蛋白質(zhì)類物質(zhì)的存在相關(guān)，B峰位置則主要和色氨酸類、蛋白質(zhì)類物質(zhì)相關(guān)[28-30]，熒光的強度與物質(zhì)的含量密切相關(guān)，熒光的強度越高，則峰所在位置代表的物質(zhì)含量越高。A峰和B峰的熒光強度在起初7 d的培養(yǎng)時間里有略微的減弱，在后續(xù)7 d的培養(yǎng)過程中又有明顯的增強。這一結(jié)果表明，在前7 d里，有部分的T13菌體還沒有固定在改性菌絲球表面，隨著置換的培養(yǎng)基被一起排出體系，而在后續(xù)7 d的培養(yǎng)過程中，隨著固定在表面的菌體的生長繁殖，此類蛋白質(zhì)類化合物的數(shù)量也有升高。

第3個峰是Ex/Em，位于365～370 nm/450～460 nm處的C峰，C峰所在位置主要與類腐殖酸物質(zhì)相關(guān)。第4個峰是Ex/Em，位于280～285 nm/450～460 nm處的D峰，主要與類富里酸物質(zhì)相關(guān)[31]。對比改性菌絲球負(fù)載T13第13 d時和第1 d時的最大熒光強度峰的位置，可以發(fā)現(xiàn)C峰和D峰有較為明顯的藍(lán)移，C峰從Ex/Em=360 nm/466 nm藍(lán)移至Ex/Em=360 nm/444 nm處，D峰則從Ex/Em=285 nm/460 nm藍(lán)移至Ex/Em=285 nm/455 nm處。熒光強度最高峰的位置變化表明，EPS中的部分物質(zhì)在共培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了變化，可能是由于T13的生長代謝產(chǎn)生了新的代謝產(chǎn)物。

2.6改性菌絲球負(fù)載好氧反硝化菌T13的變化及SEM圖像

將改性菌絲球負(fù)載T13后連續(xù)培養(yǎng)45 d，每天取出培養(yǎng)瓶靜置沉淀后拍攝圖像。如圖6所示，改性菌絲球負(fù)載好氧反硝化菌T13后的變化較為明顯。圖6a所示為培養(yǎng)24 h后的菌絲球在未經(jīng)生物絮凝劑改性時的情況，圖6b所示為經(jīng)過生物絮凝劑改性后的菌絲球負(fù)載T13培養(yǎng)第4 d時的情況，可見顆粒已經(jīng)由白色變?yōu)闇\黃色。經(jīng)過15 d的培養(yǎng)后，顆粒顏色逐漸加深，且有少量渾濁出現(xiàn)，這是由于改性菌絲球表面的T13生長繁殖后，菌量變大而進入培養(yǎng)基中，也有少量斷裂的菌絲攜帶附著的T13從菌絲球表面剝落所致。連續(xù)培養(yǎng)至第45 d時，改性菌絲球顆粒仍能保持完整的結(jié)構(gòu)，顆粒直徑相比于純菌絲球有略微的增大，但顆粒的顏色已經(jīng)由淺黃色變?yōu)辄S褐色，且培養(yǎng)基中有大量的黃褐色絮體，結(jié)合2.2節(jié)中得出的脫氫酶活性隨培養(yǎng)時間延長而提升，表明在改性菌絲球顆粒培養(yǎng)的過程中，T13的菌量有明顯的提升，不僅在改性菌絲球顆粒的表面附著生長，且進入液體培養(yǎng)基的游離菌體能夠形成具有活性的絮體。

改性菌絲球負(fù)載T13的SEM圖像也可以表明菌絲球固定T13強化后的效果。由圖7a、圖7 b可以清晰看出，改性菌絲球表面負(fù)載了大量的T13細(xì)菌，能夠維持較為完整的顆粒狀結(jié)構(gòu)，橫截面SEM圖像（圖7c、圖7 d）表明，改性菌絲球的內(nèi)部是由菌絲纏繞在一起形成的緊密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為顆粒的整體提供了支撐，且能為改性菌絲球提供較大的比表面積和良好的傳質(zhì)性能，使得T13細(xì)菌得以在改性菌絲球表面附著生長。黑曲霉Y3形成的菌絲球作為生物載體也被用于固定產(chǎn)氫細(xì)菌[32]和產(chǎn)絮菌[12]以提高氫氣和生物絮凝劑的產(chǎn)量，在這些研究中，產(chǎn)氫細(xì)菌和產(chǎn)絮菌也成功地固定在了菌絲球的表面。

3討論

菌絲球作為生物載體在以往的研究中被用于其他一些功能微生物的固定，并用于強化污染物的去除，Dong等[33]利用黃孢原平毛革菌DH-1形成的菌絲球負(fù)載光合細(xì)菌PSB-1D，用于強化2-氯酚的去除，發(fā)現(xiàn)用同時培養(yǎng)法形成的混合菌絲球在7 d內(nèi)對2-氯酚的降解率可達(dá)89%以上。林勝紅等[34]使用煙曲霉形成的菌絲球固定另一株產(chǎn)漆酶的熒光假單胞桿菌后處理剛果紅廢水，結(jié)果表明，被固定后的混合菌絲球?qū)U水的脫色效能和染料的降解效率都有了明顯提升。在本研究中，菌絲球負(fù)載T13對全氮的去除效能有較大的提升，在未經(jīng)生物絮凝劑改性強化的情況下，當(dāng)負(fù)載比例為1∶15時，可使全氮的去除率提升約17.00%，而經(jīng)過生物絮凝劑改性強化后，全氮的去除率在相同條件下又可提升9.01%。生物固定強化技術(shù)主要目的在于提升體系中功能微生物的生物量，提高其在系統(tǒng)中的活性[35]。從脫氫酶活性的變化可以看出，T13可以在菌絲球的表面附著生長，菌絲球載體顆粒表面的脫氫酶活性在逐漸升高，而在生物絮凝劑改性強化菌絲球之后，僅培養(yǎng)7 d后，載體表面的脫氫酶活性就有明顯的提高，同時去除全氮的效能相比于游離菌也有較大改善，說明經(jīng)過生物絮凝劑改性的菌絲球可以強化好氧反硝化菌T13的固定，增強T13在體系中的菌量和活性。

有研究結(jié)果表明，在微生物負(fù)載在載體表面的過程中，EPS起到了重要作用。王鑫等[36]用膨脹石墨-海藻酸鈣法固定石油菌T4的過程中發(fā)現(xiàn)，T4附著在載體表面的時候會分泌大量的EPS。田秀梅等[37]采用乙酸改性苧麻纖維為載體吸附固定石油降解菌時也發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外聚合物增強了對載體材料的黏附。而在膜生物反應(yīng)器的研究中也發(fā)現(xiàn)，通過減少EPS的產(chǎn)生可以有效預(yù)防微生物群體附著在膜的表面，有效減少膜污染的發(fā)生[38]。在本研究中，F(xiàn)TIR的圖譜分析結(jié)果表明，多個蛋白質(zhì)或多糖中含有的基團的吸收峰在改性菌絲球負(fù)載T13前后產(chǎn)生了變化。而從EEM分析結(jié)果中可以看出，EPS的含量在13 d的培養(yǎng)中經(jīng)歷了先降低后升高的過程，盡管在前7 d中被固定的T13菌量有少許下降，但在后續(xù)的培養(yǎng)過程中其菌量和活性都有所提高，這一結(jié)果表明，EPS在改性菌絲球負(fù)載T13的過程中起到了關(guān)鍵作用，特別是蛋白質(zhì)，有助于T13在菌絲球表面的固定。

改性菌絲球培養(yǎng)過程中的表觀圖像及SEM圖像表明，改性菌絲球可以作為生物載體將好氧反硝化菌T13有效固定在其表面。經(jīng)過45 d的培養(yǎng)后，改性菌絲球載體仍能保持完整、良好和緊實的結(jié)構(gòu)，菌絲纏繞形成的表面提供了較大的比表面積供細(xì)菌附著，而T13菌體附著后也可以繼續(xù)生長繁殖，且從載體表面脫離下來的菌體也能夠形成具有活性的絮體，避免在固液分離的過程中被排出系統(tǒng)導(dǎo)致流失。

致謝：本項目受黑龍江省“頭雁”計劃項目《寒區(qū)生態(tài)環(huán)境保障理論技術(shù)》資助，特此感謝！

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-08-13

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（52070054）

作者簡介：孔祥震（1989-），男，安徽宿州人，博士研究生，研究方向為環(huán)境微生物、生物強化技術(shù)。（E-mail）kxz_19890510@163.com

通訊作者：馬放，（E-mail）mafang@hit.edu.cn