中藥渣堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)及纖維素降解酶基因表達(dá)量變化特征

杜婕　宋修超　馬艷

摘要：本研究對(duì)不同堆制時(shí)期的中藥渣堆肥樣品進(jìn)行Miseq高通量測(cè)序分析，并對(duì)8種纖維素降解酶基因進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析，以解析中藥渣堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成及纖維素降解酶基因表達(dá)豐度的變化特征。結(jié)果表明，在中藥渣堆肥過程中，不同堆制時(shí)期的微生物群落結(jié)構(gòu)組成不同，并且不同處理間的群落結(jié)構(gòu)也存在差異。對(duì)樣品中微生物群落進(jìn)行主成分分析（PCoA），發(fā)現(xiàn)在中藥渣堆肥過程中，不同處理的組間微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，組內(nèi)群落結(jié)構(gòu)不斷變化并逐漸趨于穩(wěn)定。熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在中藥渣堆肥過程中，纖維素降解酶基因的表達(dá)豐度也處于明顯的變化中。說明，中藥渣堆肥中微生物群落與纖維素降解酶是相互聯(lián)系、相互影響的。

關(guān)鍵詞：中藥渣堆肥;Miseq高通量測(cè)序;群落結(jié)構(gòu);纖維素降解酶基因

中圖分類號(hào)：S141.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2022）02-0352-09

Change characteristics of microbial community structure and cellulose degrading enzyme gene expression level in Chinese medicine residue compost

DU Jie SONG Xiu-chao MA Yan

（1.Institute of Agricultural Resources and Environment， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Key Laboratory of Agro-Environment in Downstream of Yangtze Plain， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210014， China;3.School of the Environment and Safety Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China;4.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry， Zhenjiang 212400， China）

Abstract： In this study， Miseq high-throughput sequencing analysis was performed on samples of Chinese medicine residue compost during different composting periods， and eight kinds of cellulose degrading enzyme genes were analyzed by fluorescence quantitative RT-PCR to explore the composition of microbial community structure and the expression and abundance of cellulose degrading enzyme genes during the composting of Chinese medicine residues. Results showed that during the composting of Chinese medicine residues， the composition of microbial community structure in different periods was different， and the community structure was also different in different treatments. Principal component analysis （PCoA） results indicated that during the composting of Chinese medicine residues， there were significant differences in the microbial community structure among different treatments， and the community structure within the group changed continuously and gradually stabilized. Results of fluorescence quantitative RT-PCR showed that the expression abundance of cellulose degrading enzyme genes also changed significantly during the composting of Chinese medicine residues. In conclusion， the microbial community and cellulose degrading enzymes in Chinese medicine residue compost are interrelated and interacted.

Key words：Chinese medicine residue compost;Miseq high-throughput sequencing;community structure;cellulose degrading enzyme genes

中藥渣是中藥材在加工、炮制過程中以及中成藥生產(chǎn)過程中，或者其他中藥材相關(guān)產(chǎn)品（如保健產(chǎn)品）加工過程中產(chǎn)生的廢棄物[1-2]。近年來，隨著中醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展以及人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，中藥的生產(chǎn)、開發(fā)力度逐年增長(zhǎng)，導(dǎo)致中藥材生產(chǎn)、加工后產(chǎn)生的藥渣也越來越多。中藥渣里含有豐富的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素，大量的多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等生物活性物質(zhì)以及多種微量元素[3-4]，具有重要的再利用價(jià)值。目前大多采取焚燒、堆放、填埋等簡(jiǎn)單粗放的方式對(duì)中藥渣進(jìn)行處理，不僅占用土地、污染環(huán)境，還會(huì)造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。堆肥化處理技術(shù)是國內(nèi)外廣泛采用的一種有機(jī)固體廢棄物資源化利用技術(shù)。對(duì)中藥渣進(jìn)行堆肥化處理是既能減少污染，又能對(duì)其進(jìn)行資源化利用的處理方式。中藥渣堆肥中因含有大量的木質(zhì)素、纖維素等而具有較長(zhǎng)的腐熟周期，因此利用高效、環(huán)保的微生物法對(duì)木質(zhì)素、纖維素進(jìn)行分解和生物轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)中藥渣資源化利用的有效途徑。在此過程中，具有纖維素或木質(zhì)素降解功能的微生物是微生物法實(shí)施的關(guān)鍵[5]，它們可以將纖維素、木質(zhì)素等轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，釋放藥渣中殘留的活性物質(zhì)，有利于實(shí)現(xiàn)中藥渣中大分子物質(zhì)的降解[6]。

近年來，宏基因組學(xué)技術(shù)避開傳統(tǒng)微生物的分離培養(yǎng)方法，直接從樣品中提取總DNA進(jìn)行分析，可以更完整、準(zhǔn)確地反映微生物的群落組成特征。目前，DNA高通量測(cè)序已成為現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域常用的研究技術(shù)[7-10]，且近幾年迅速發(fā)展的DNA高通量測(cè)序技術(shù)能檢測(cè)到許多低豐度內(nèi)生細(xì)菌[11]，已成功應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如發(fā)酵食品、海洋環(huán)境、腸道環(huán)境、植物多樣性、人工濕地微生物[12-13]。高通量測(cè)序技術(shù)在奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)多樣性[14]，纖維素降解復(fù)合菌系中微生物的群落結(jié)構(gòu)[15]以及關(guān)鍵降解功能菌[16]的研究中有所應(yīng)用，但利用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)中藥渣堆肥中微生物群落結(jié)構(gòu)組成和變化進(jìn)行研究的報(bào)道較少。本研究擬以中藥渣（青蒿藥渣和金銀花藥渣）堆肥為研究對(duì)象，分析堆肥過程中微生物群落組成及優(yōu)勢(shì)菌群的變化情況，同時(shí)采用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在此過程中與纖維素降解相關(guān)酶基因表達(dá)豐度的變化特征，探索中藥渣堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能基因的變化規(guī)律，以期為中藥渣等堆肥的降解及資源化利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

中藥渣堆肥樣品：中藥渣（青蒿藥渣和金銀花藥渣）堆制于江蘇省連云港東?？h。本研究共設(shè)3個(gè)處理，對(duì)照（CK）：青蒿藥渣∶金銀花藥渣∶混合一∶混合二=2.00∶1.00∶1.00∶1.00（質(zhì)量比）;T1處理：青蒿藥渣∶金銀花藥渣∶混合一∶混合二∶菌劑=2.00∶1.00∶1.00∶1.00∶0.04（質(zhì)量比）;T2處理：青蒿藥渣∶金銀花藥渣∶混合一∶混合二∶回料=2.00∶1.00∶1.00∶1.00∶0.10（質(zhì)量比）。在中藥渣堆制期間，各處理分別取樣10次，每次取3個(gè)樣品。

本研究所用的主要試劑和儀器：rTaq DNA酶（TaKaRa公司產(chǎn)品）、T4 DNA聚合酶（TaKaRa公司產(chǎn)品）、土壤DNA提取試劑盒（MP Biomedicals公司產(chǎn)品）、膠回收試劑盒（Axygene公司產(chǎn)品）、凝膠電泳儀（BioRad公司產(chǎn)品）、凝膠成像儀（BioRad公司產(chǎn)品）、PCR儀（Eppendorf公司產(chǎn)品）、核酸測(cè)定儀（Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品）、搖床（南京百思禾生物科技有限公司產(chǎn)品）、振蕩培養(yǎng)箱（南京百思禾生物科技有限公司產(chǎn)品）、ABI 7500型定量PCR儀（ABI公司產(chǎn)品）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1中藥渣堆肥樣品DNA提取利用土壤DNA提取試劑盒（MP Biomedicals公司產(chǎn)品）對(duì)3個(gè)處理中不同堆制時(shí)間的中藥渣樣品進(jìn)行DNA提取，通過NanoDrop 2000超微量核酸測(cè)定儀（Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品）對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.2.2Miseq高通量測(cè)序采用Caporaso等[17]提出的方法對(duì)中藥渣樣品中的微生物進(jìn)行Miseq高通量測(cè)序。利用特異性引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對(duì)樣品中細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：Master Mix （2×） 15.0 μl，F(xiàn)/R引物2.0 μl，模板DNA為10.0 ng，然后再用超純水補(bǔ)齊30.0 μl。PCR程序參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行，采用QIAquick-PCR純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，利用Invitrogen公司的Qubit12.0熒光光度計(jì)對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，純化后的DNA產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina-MiSeq儀器[宜曼達(dá)貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品]進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3中藥渣中微生物信息分析通過拼接、過濾和去除嵌合體3個(gè)步驟將Miseq高通量測(cè)序得到的序列拼接成優(yōu)化序列，并進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。去除標(biāo)記序列和引物序列，將剩余序列聚合成具有97%相似性序列的操作分類單元（OTUs）。用QIIME1.7.0軟件在Greengene數(shù)據(jù)庫（http：//greengenes.secondgenome.com/）中對(duì)這些OTUs進(jìn)行注釋[19-20]。通過多樣性分析，研究不同堆肥時(shí)期中藥渣中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，同時(shí)比較不同處理間中藥渣堆肥樣品微生物群落的組成結(jié)構(gòu)。

1.2.4堆肥過程中纖維素降解酶基因表達(dá)豐度測(cè)定根據(jù)中藥渣堆肥中微生物的種類信息，從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索8種具有纖維素降解功能的降解酶，包括：阿拉伯糖苷酶（α62A）、纖維二糖磷酸化酶（CP）、纖維素水解酶（EC）、內(nèi)切葡聚糖酶（Endo）、纖維素酶（AH18）、纖維素分解酶（CbhB）、幾丁質(zhì)內(nèi)切酶（ChiA）、多糖基水解酶（BLII），根據(jù)降解酶的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1）進(jìn)行熒光定量RT-PCR測(cè)定，檢測(cè)堆肥中微生物纖維素降解酶基因表達(dá)豐度的變化特征。

通過特異性引物對(duì)上述8種纖維素降解酶基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功的目的片段與載體pEASY-T1連接，然后將其轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。利用通用引物M13F（5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′）和M13R（5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′）對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行擴(kuò)增，選擇陽性轉(zhuǎn)化子送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，序列正確的質(zhì)粒用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用熒光定量PCR擴(kuò)增酶對(duì)中藥渣堆肥DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增總體積為20.0 μl，具體為：熒光定量PCR擴(kuò)增酶10.0 μl，Temp DNA 1.0 μl，F(xiàn)/R引物各1.0 μl，超純水（ddH2O）為7.0 μl。加樣混勻后，將PCR反應(yīng)溶液置于ABI 7500型定量PCR儀（ABI公司產(chǎn)品）上進(jìn)行擴(kuò)增，具體程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。根據(jù)熔解曲線，計(jì)算纖維素降解酶基因表達(dá)豐度。

1.3數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1中藥渣堆肥腐熟過程中溫度變化趨勢(shì)

圖1顯示，在中藥渣堆制期間，本研究3個(gè)處理在堆制46 d時(shí)都已經(jīng)進(jìn)入高溫期（溫度≥55 ℃），T2處理的溫度最高，甚至可達(dá)70 ℃。中藥渣堆制88 d時(shí)，3個(gè)處理仍處于高溫期。

2.2不同分類水平上中藥渣堆肥中微生物群落組成變化

對(duì)不同時(shí)期的中藥渣堆肥樣品進(jìn)行Miseq高通量測(cè)序，圖2顯示，在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）在對(duì)照（CK）、T1處理、T2處理中均為優(yōu)勢(shì)菌群并且在整個(gè)堆制期間一直存在，但隨著堆制時(shí)間的延長(zhǎng)其所占比例有所變化。總體而言，與CK相比，T1處理中厚壁菌門所占比例有所增加;與CK、T1處理相比，T2處理中厚壁菌門所占比例在大多數(shù)堆制時(shí)間下較小，且隨著堆制時(shí)間的延長(zhǎng)其所占比例總體呈減少趨勢(shì)。

分析微生物在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果（圖3）表明，醋酸桿菌屬（Acetobacter）在3個(gè)處理中占比均較高，為優(yōu)勢(shì)菌群，但隨著堆制時(shí)間延長(zhǎng)其所占比例總體呈減少趨勢(shì)。CK中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的占比在堆制0～56 d時(shí)隨著堆制時(shí)間延長(zhǎng)總體呈增加趨勢(shì)，在65～88 d時(shí)其所占比例大大減少;在T1處理中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）在堆肥0～12 d時(shí)占比較大，21～88 d時(shí)占比明顯減少;在T2處理中，隨著堆制時(shí)間的延長(zhǎng)（0～46 d），乳酸桿菌屬（Lactobacillus）總體呈減少的趨勢(shì)，而在56～74 d時(shí)其占比又有所增加。此外，假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）存在于T1、T2處理中，與CK相比，魏瑟拉屬（Weissella）在T1、T2處理中占比較大，且在T1處理中隨著堆制時(shí)間延長(zhǎng)其占比逐漸增加。

2.3中藥渣微生物組成分析和主成分分析

微生物群落組成的熱圖是以顏色梯度代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小，并對(duì)類型、數(shù)量相似的微生物群落進(jìn)行聚類分析[21]。微生物群落豐度不同，則顏色不同，根據(jù)此特征可將樣品中的微生物群落進(jìn)行分類，從而顯示群落結(jié)構(gòu)的相似之處和不同之處。在門水平上對(duì)中藥渣樣品中微生物物種組成和豐度進(jìn)行物種熱圖聚類分析，同一行中顏色深淺代表物種在樣品中的豐度高低，左邊聚類表示物種間的相似度。圖4顯示，3個(gè)處理間中藥渣的微生物群落組成差異較大。同時(shí)，各處理中微生物群落結(jié)構(gòu)組成是不斷變化的，且隨著堆制時(shí)間延長(zhǎng)，各處理中微生物群落的豐度差異逐漸變大，微生物優(yōu)勢(shì)菌群也發(fā)生明顯變化。

對(duì)中藥渣堆肥3個(gè)處理中微生物群落進(jìn)行主成分分析（PCoA），結(jié)果（圖5）表明，隨著中藥渣堆制時(shí)間的延長(zhǎng)，CK、T1處理、T2處理中微生物群落特征發(fā)生明顯變化。堆肥初期（0～12 d，圖5A）和堆肥中期（13～56 d，圖5B）CK、T1處理、T2處理的微生物群落組成不同，T1處理和T2處理的樣品中微生物群落較為集中，因此這2個(gè)處理的微生物群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，但T1、T2處理在堆肥不同時(shí)期的群落結(jié)構(gòu)存在差異，處于變化中。在堆肥末期（57～88 d，圖5C），CK、T1處理、T2處理的微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為組內(nèi)聚在一起，組間分散較大，說明不同處理間群落結(jié)構(gòu)差異更加明顯，并且此時(shí)3個(gè)處理的組內(nèi)群落結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。此外，在同一處理中，微生物群落結(jié)構(gòu)隨著堆制時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生改變，并且這種改變使組內(nèi)群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于穩(wěn)定。同時(shí)，通過對(duì)比堆肥早期、中期、晚期的群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在堆肥進(jìn)程中，3個(gè)處理間的微生物群落結(jié)構(gòu)一直存在較大差異，且隨著堆制時(shí)間的延長(zhǎng)，群落結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)變化中。

2.4中藥渣堆肥中纖維素降解酶基因表達(dá)量變化特征

本研究檢測(cè)了8種纖維素降解酶[阿拉伯糖苷酶（α62A）、纖維二糖磷酸化酶（CP）、纖維素水解酶（EC）、內(nèi)切葡聚糖酶（Endo）、纖維素酶（AH18）、纖維素分解酶（CbhB）、幾丁質(zhì)內(nèi)切酶（ChiA）、多糖基水解酶（BLII）]基因在中藥渣堆制期間表達(dá)量的變化，結(jié)果（圖6）表明，T1處理AH18基因表達(dá)量明顯高于CK和T2處理，并隨著堆制時(shí)間的延長(zhǎng)而總體呈增加趨勢(shì)，堆制88 d時(shí)達(dá)到最高值，為1 g 8.841×106拷貝，而CK和T2處理該基因的表達(dá)量整體呈降低趨勢(shì)。EC基因、CbhB基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)相似，均在中藥渣堆制中后期開始有所增加，堆制88 d時(shí)，T1處理EC基因表達(dá)量達(dá)到最大值，為1 g 1.811×106拷貝;堆制65 d時(shí)，T2處理EC基因表達(dá)量最高，為1 g 1.592×106拷貝。在堆制65 d時(shí)，T1處理CbhB基因表達(dá)量最高，為1 g 5.720×1012拷貝。T1處理α62A基因表達(dá)量較高，且在堆制初期其表達(dá)量就有明顯增加，在堆制46 d時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最大值，為1 g 1.070×108拷貝。CK、T1處理和T2處理堆制46 d后，ChiA基因表達(dá)量明顯增加，堆制65 d時(shí)T2處理ChiA基因表達(dá)量為1 g 6.800×108拷貝，高于T1處理，但在堆制88 d時(shí)T1處理ChiA基因表達(dá)量達(dá)到3個(gè)處理的最大值，為1 g 8.22×108拷貝。在堆肥過程中BLII基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)整體表現(xiàn)為先升高后降低，堆制46 d時(shí)，T1處理BLII基因表達(dá)量最高，為1 g 1.841×106拷貝。中藥渣堆制65 d后，CK、T1處理、T2處理CP基因表達(dá)量均總體呈升高趨勢(shì)，并且在堆制88 d時(shí)T1處理的表達(dá)量最高（1 g 3.310×107拷貝），其次為CK，T2處理的表達(dá)量相對(duì)較低。在中藥渣堆肥期間，TI、T2處理Endo基因的表達(dá)量均總體呈升高趨勢(shì)，堆肥88 d時(shí)T1處理Endo基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，為1 g 2.270×1012拷貝。

3討論

本研究以中藥渣堆肥為研究對(duì)象，通過對(duì)不同時(shí)期樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)變化以及腐熟過程中纖維素降解酶基因表達(dá)豐度的變化進(jìn)行測(cè)定，探究中藥渣堆制初期、中期、后期微生物群落結(jié)構(gòu)、纖維素降解酶基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化特征。通過對(duì)中藥渣堆肥溫度進(jìn)行記錄可知，3個(gè)處理的中藥渣堆肥在堆制46 d時(shí)均已進(jìn)入高溫期（溫度≥55 ℃），隨后高溫一直持續(xù)至堆肥后期（88 d）。有研究結(jié)果表明，纖維素和木質(zhì)素的降解主要發(fā)生在高溫期和腐熟期[22]。因此，本研究的中藥渣堆肥具有較長(zhǎng)的高溫腐熟期，可能與其含有大量難降解的纖維素和木質(zhì)素密切相關(guān)。

Miseq高通量測(cè)序結(jié)果表明，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）為中藥渣堆肥在門分類水平上的優(yōu)勢(shì)菌群。醋酸桿菌屬（Acetobacter）為屬分類水平上的優(yōu)勢(shì)菌群，但隨著堆制時(shí)間延長(zhǎng)其所占比例總體呈減少趨勢(shì)。假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）存在于T1、T2處理中，魏瑟拉屬（Weissella）存在于T1處理中，隨著堆制時(shí)間延長(zhǎng)其占比逐漸增加。目前，有很多研究結(jié)果證實(shí)假黃單胞菌屬的細(xì)菌在纖維素降解中發(fā)揮著重要作用。例如，王志方等[23]發(fā)現(xiàn)與棉秸稈腐解有關(guān)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬包括假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas），且其功能預(yù)測(cè)為降解纖維素、木質(zhì)素、果膠類物質(zhì)，提供氮素營(yíng)養(yǎng)。侯麗媛等[24]發(fā)現(xiàn)假黃單胞菌菌株P(guān)seudoxanthoonas sp.J1J1具有木質(zhì)纖維素降解能力，該菌株具有內(nèi)切纖維素酶（CMCase）、濾紙酶（FPase）和β-葡萄糖苷酶（BG）。同時(shí)，馬寧等[25]發(fā)現(xiàn)一株纖維素高效降解細(xì)菌ZJ08，屬于假黃單胞菌屬，是一種具有較強(qiáng)耐酸特性的纖維素降解菌株。上述研究結(jié)果均表明假黃單胞菌屬在纖維素降解中具有重要的作用。

通過對(duì)中藥渣堆肥中微生物群落進(jìn)行主成分分析（PCoA），發(fā)現(xiàn)隨著中藥渣堆制時(shí)間的延長(zhǎng)，CK、T1處理、T2處理中微生物群落特征發(fā)生明顯變化。同時(shí)，在堆肥末期，3個(gè)處理間群落結(jié)構(gòu)差異更為明顯，但3個(gè)組內(nèi)的群落結(jié)構(gòu)更趨于穩(wěn)定。這說明，隨著中藥渣腐熟降解進(jìn)程的推進(jìn)，不同處理間微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，微生物優(yōu)勢(shì)菌群也發(fā)生明顯變化。同時(shí)，這種改變使不同處理的組內(nèi)群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于穩(wěn)定。艾士奇等[15]對(duì)復(fù)合菌系降解纖維素過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在同一組別中，微生物群落特征隨著時(shí)間的變化也發(fā)生著明顯改變，不同降解時(shí)期的微生物群落分別分布在不同象限中，且相互之間存在一定的距離，表明在纖維素降解的不同時(shí)期，其復(fù)合菌系的微生物群落結(jié)構(gòu)具有差異性。

本研究對(duì)中藥渣堆制過程中纖維素降解酶基因的表達(dá)量變化也進(jìn)行了檢測(cè)。參與降解纖維素的微生物菌群可以分泌外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[26]等，它們協(xié)同降解纖維素大分子[27]。目前被廣泛認(rèn)可的纖維素降解理論為：首先，內(nèi)切酶在纖維素分子的無定形區(qū)對(duì)β-1，4糖苷鍵進(jìn)行隨機(jī)切斷，使長(zhǎng)鏈纖維素產(chǎn)生大量反應(yīng)末端。其次，外切酶作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)，依次從纖維素分子末端切下纖維二糖或葡萄糖[28]，這樣在內(nèi)切酶和外切酶的協(xié)同作用下，釋放出聚合度很低的可溶性糖[29]。最后，由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖等水解為葡萄糖。通過幾種酶的協(xié)同作用可以徹底將聚合度高、分子量大的纖維素降解為溶于水的葡萄糖[30]。本研究在中藥渣堆肥中選取了8種纖維素降解酶，包括：纖維素酶（AH18）[31]、纖維素水解酶（EC）[32]、纖維素分解酶（CbhB）[33]、阿拉伯糖苷酶（α62A）、幾丁質(zhì)內(nèi)切酶（ChiA）、多糖基水解酶（BLII）、纖維二糖磷酸化酶（CP）、內(nèi)切葡聚糖酶（Endo）。T1處理AH18基因表達(dá)量明顯高于CK和T2處理，并隨著堆制時(shí)間的延長(zhǎng)而總體呈增加趨勢(shì)，堆制88 d時(shí)達(dá)到最高值。纖維素酶在纖維素剛降解時(shí)就已經(jīng)開始發(fā)揮作用了，該酶基因的高表達(dá)量一直持續(xù)到堆肥末期，表明纖維素酶在整個(gè)纖維素分解過程中均發(fā)揮著重要作用，具有纖維素酶基因的微生物菌群應(yīng)該為中藥渣堆肥中始終存在的微生物菌群。EC基因和CbhB基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，均在中藥渣堆制中后期開始有所增加，說明具有這2種酶基因的微生物菌群在堆肥初期發(fā)揮的降解作用不明顯，直至堆肥的中后期，具有這2種酶基因的微生物菌群在整個(gè)微生物菌群中所占比例增加，而此時(shí)中藥渣堆肥中仍含有大量未降解的纖維素物質(zhì)，從而發(fā)揮重要的降解作用。

阿拉伯糖苷酶（α62A）和多糖基水解酶（BLII）均為可分解多糖的降解酶類。本研究中，T1處理的阿拉伯糖苷酶基因表達(dá)量在堆肥初期就有明顯增加，在堆制46 d時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最大值。多糖基水解酶基因在T1處理中表達(dá)量的變化趨勢(shì)與阿拉伯糖苷酶基因類似，均為先緩慢升高，在堆肥中期（46 d）達(dá)到最大值后開始降低。此類多糖基水解酶基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)可解釋為在堆肥初期大量纖維素類物質(zhì)剛剛開始降解，此時(shí)起主要作用的是纖維素酶，將其初步分解產(chǎn)生大量的纖維素末端或降解為多糖類物質(zhì)，隨著堆肥的進(jìn)一步腐熟，伴隨纖維素的初步降解，大量多糖類物質(zhì)被阿拉伯糖苷酶或多糖基水解酶降解，此時(shí)堆肥已經(jīng)進(jìn)入腐熟中期，其內(nèi)存在大量具有阿拉伯糖苷酶或多糖基水解酶的微生物，可對(duì)堆肥初期已經(jīng)分解的纖維素物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分解。

纖維二糖磷酸化酶[34]和內(nèi)切葡聚糖酶[35]均為可將多糖徹底降解為葡萄糖的重要酶類，其基因的表達(dá)在本研究中表現(xiàn)為：T1處理CP基因在堆肥中后期的表達(dá)量逐漸升高，至堆肥末期（88 d）達(dá)到最高值。與之類似，T1處理Endo基因表達(dá)量在堆肥中后期開始明顯增加，在堆肥末期（88 d）達(dá)到最高值。說明，這2種酶基因表達(dá)量的大幅度增加是基于堆肥前期到中期大量的纖維素類物質(zhì)分解為多糖類物質(zhì)的基礎(chǔ)上。隨著中藥渣堆肥的不斷腐熟和降解，中后期存在大量具有阿拉伯糖苷酶或多糖基水解酶的微生物，可將多糖繼續(xù)降解為分子量更小的纖維二糖或多聚糖，而隨著中藥渣堆肥腐熟度的進(jìn)一步提高，堆肥末期具有纖維二糖磷酸化酶和內(nèi)切葡聚糖酶的微生物菌群則開始成為優(yōu)勢(shì)菌群，發(fā)揮重要的分解作用，因此這2種降解酶類的基因表達(dá)量在堆肥末期最大。

4結(jié)論

本研究對(duì)中藥渣堆肥樣品進(jìn)行Miseq高通量測(cè)序，檢測(cè)其內(nèi)微生物群落組成的變化。同時(shí)，對(duì)在中藥渣堆肥腐熟過程中參與纖維素降解的重要降解酶基因的表達(dá)豐度也進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，隨著中藥渣堆肥中纖維素類物質(zhì)的腐熟降解，其內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，具有纖維素降解功能的酶基因的表達(dá)量也發(fā)生相應(yīng)變化，該變化隨著堆制時(shí)間和堆肥溫度的變化而不同。由此說明，中藥渣堆肥中具有纖維素降解功能的微生物群落之間是相互聯(lián)系、相互作用的。

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（責(zé)任編輯：王妮）

收稿日期：2021-08-27

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0800200）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（17）2025];中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2018M632255）;江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年支持項(xiàng)目（2020kj011）

作者簡(jiǎn)介：杜婕（1985-），女，山東泰安人，博士，講師，主要從事降解功能微生物研究。（E-mail）dujiekycg@163.com

通訊作者：馬艷，（E-mail）myjaas@sina.com