芍藥苷對(duì)酒精戒斷大鼠焦慮樣行為、炎癥因子及腸道菌群的影響

王小龍，武 爽，吳 琦，王 今，趙正林，張春晶, ，李 林,

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 161006）

長(zhǎng)期飲酒會(huì)對(duì)多個(gè)末端器官造成損害，可誘發(fā)大腦功能障礙，造成局部炎癥產(chǎn)生，引起腸道黏膜損傷，增加腸道通透性，導(dǎo)致腸道菌群組成的變化[1]。酒精依賴(lài)患者在停止飲酒后會(huì)出現(xiàn)情緒和自主神經(jīng)不穩(wěn)定行為，其特征是焦慮、激動(dòng)、譫妄等。酒精的使用、戒斷和炎癥之間的關(guān)系是復(fù)雜的，相互作用機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)短期低劑量飲酒戒斷后能夠改變大鼠腸道微生物組成豐度及群落結(jié)構(gòu)，且大鼠酒精戒斷后的腸道微生物與大鼠焦慮樣行為具有相關(guān)性[2]。Gorky等[3]分析認(rèn)為酒精成癮或戒斷會(huì)增加致病菌的豐富度，誘導(dǎo)炎癥信號(hào)和細(xì)胞因子的釋放。 Lowe等[4]同樣認(rèn)為酒精攝入改變了腸道菌群，增加腸道通透性，誘發(fā)了小腸促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。 在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子白介素-6 （IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的改變與情感性癥狀相關(guān)[5]。研究酒精介導(dǎo)下的微生物-腸-腦軸間的相互作用，有助于深入了解酒精對(duì)機(jī)體的作用機(jī)制。

芍藥（Paeonia lactifloraPall.）為毛茛目毛莨科芍藥亞科芍藥屬的多年生植物，品種主要包括白芍和赤芍[6]，兩者藥用功效有所不同，但主要藥用成分均為芍藥苷。芍藥苷是一種單萜類(lèi)苷，在一些中藥配方中被廣泛用于治療抑郁癥[7]。近年來(lái)，芍藥苷被報(bào)道的具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)、抗抑郁的作用[8?10]，這些藥理作用為芍藥苷成為治療潰瘍性結(jié)腸炎、動(dòng)脈粥樣硬化、疼痛、抑郁等多種疾病的潛在藥物奠定了基礎(chǔ)。王欣等[11]研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可以改變腸炎小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，修復(fù)腸屏障損傷、降低炎癥反應(yīng)。大量體外和體內(nèi)研究表明，芍藥苷具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠維持離子濃度和離子通道的平衡，抑制神經(jīng)炎癥，調(diào)節(jié)自噬途徑，預(yù)防線粒體功能障礙等[12?14]。但目前芍藥苷在治療焦慮，特別是能否通過(guò)改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu)緩解酒精戒斷產(chǎn)生的焦慮樣行為目前研究相對(duì)較少。

本研究以大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建長(zhǎng)期低劑量飲酒后戒斷的大鼠動(dòng)物模型，研究在酒精戒斷后芍藥苷給藥治療對(duì)大鼠焦慮樣行為、炎癥因子及腸道微生物的作用，為藥食同源中藥治療酒精戒斷提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芍藥苷（純度>95.0%） 上海麥克林生化科技有限公司；酒精 北京化工廠；快速糞便基因組DNA提取試劑盒 Qiagen；ELISA 檢測(cè)試劑盒 南京建成生物科技有限公司；24只SPF級(jí)雄性SD大鼠 體重（200±20）g，購(gòu)買(mǎi)及飼養(yǎng)由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證（SYXK（黑）2016-001）。

Infinite M Plex 多功能微孔檢測(cè)酶標(biāo)儀 瑞士Tecan；MS200 多管渦旋震蕩儀 杭州瑞成儀器有限公司；Centrifuge 5424R小型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及酒精成癮模型建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠（動(dòng)審[2021]83號(hào) QMU-AECC-2021-83）入組后，進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)1周，后將其隨機(jī)分為對(duì)照組（NCG，n=8）和酒精處理組（n=16）。酒精處理組以25%乙醇（5 g/kg, 25% v/v）灌胃1次/d，對(duì)照組以等量的蒸餾水灌胃。均連續(xù)灌胃28 d后，酒精處理組隨機(jī)分為兩組：酒精處理模型組（MCG，n=8）和芍藥苷治療組（PAG，n=8）。酒精戒斷3 d[15]，戒斷期治療組每日灌胃一次，PAG給藥劑量為50 mg/(kg·BW)[16]，NCG組和MCG組以等量的蒸餾水灌胃，戒斷3 d后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試、血清和糞便樣品采集。

1.2.2 行為學(xué)測(cè)定 大鼠焦慮樣行為采用高架十字迷宮（elevated plus-maze test，EPM）和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OF）測(cè)定，其中EPM實(shí)驗(yàn)開(kāi)臂時(shí)間百分比（percentage of time spent in open arms，PTO，%）=開(kāi)臂滯留時(shí)間/（開(kāi)臂滯留時(shí)間+閉臂滯留時(shí)間）×100，OF實(shí)驗(yàn)記錄5 min 內(nèi)大鼠的自發(fā)移動(dòng)總距離（total distance，TD），具體實(shí)驗(yàn)方法參照本課題組前期研究方法[2]。

1.2.3 細(xì)胞因子測(cè)定 行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，收集血清，應(yīng)用Elisa試劑盒測(cè)定大鼠血清中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β測(cè)定過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 糞便基因組DNA提取及 16S rDNA 測(cè)序 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，采用無(wú)菌操作采集大鼠糞便，取樣后置于凍存盒中于?80 ℃保存。樣品委托北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行糞便微生物16S rDNA測(cè)序：參照試劑盒要求提取大鼠糞便基因組DNA，評(píng)價(jià)DNA提取質(zhì)量及濃度，質(zhì)量合格的DNA 樣品構(gòu)建細(xì)菌16S rDNA V3+V4 區(qū)文庫(kù)，使用Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

可操作性分類(lèi)單元（operational taxonomic unit,OTU）的提取、細(xì)菌分類(lèi)學(xué)注釋、各分類(lèi)水平下的物種豐度以及群落結(jié)構(gòu)圖、Beta多樣性分析、隨機(jī)森林分析和Spearman相關(guān)性分析焦慮相關(guān)參數(shù)，以及腸道微生物組成的相關(guān)性均使用百邁克云平臺(tái)（www.biocloud.net）計(jì)算獲得。使用Mothur軟件，對(duì)各個(gè)樣品的Alpha多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)）進(jìn)行評(píng)估，為比較樣品間的多樣性指數(shù)，分析時(shí)將樣品所含序列數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用R語(yǔ)言工具進(jìn)行主成分分析（principal componentanalysis，PCA）、非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）和相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）。LDA值>4的物種為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥苷干預(yù)酒精戒斷大鼠焦慮樣行為

相關(guān)研究表明酒精成癮患者通常會(huì)伴隨有精神神經(jīng)病學(xué)的變化，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)都表明酒精戒斷時(shí)會(huì)出現(xiàn)焦慮、抑郁現(xiàn)象[15?16]。大鼠酒精戒斷焦慮樣行為研究結(jié)果表明，EPM實(shí)驗(yàn)中酒精戒斷組模型組（MCG）大鼠PTO顯著低于NCG組（P<0.05），在OF實(shí)驗(yàn)中，大鼠5 min內(nèi)自發(fā)移動(dòng)總距離（TD）MCG組顯著低于NCG組（P<0.05），說(shuō)明酒精戒斷模型造模成功，大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為；芍藥苷給藥后，PAG組PTO值顯著高于MCG組（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)圖1A； PAG組TD值顯著高于MCG組（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)圖1B。說(shuō)明芍藥苷治療能夠有效緩解大鼠焦慮樣行為。

圖1 大鼠焦慮樣行為測(cè)試Fig.1 Anxiety-like behavior test of rats

2.2 芍藥苷對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響

由表1可知，與NCG組對(duì)比，MCD組大鼠炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高（P<0.05），PAG組IL-6和TNF-α水平顯著高于NCG組，IL-1β水平差異不顯著（P>0.05）；與MCD組對(duì)比，PAG組IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著下降（P<0.05）。酒精會(huì)導(dǎo)致黏膜損傷，增加腸道通透性，導(dǎo)致內(nèi)毒素和其他細(xì)菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)位進(jìn)入門(mén)靜脈，提高了血漿中腸源性細(xì)菌產(chǎn)物，刺激促炎介質(zhì)的釋放，如細(xì)胞因子TNFα和IL-1β，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害作用，導(dǎo)致炎癥浸潤(rùn)[17]，本結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)期飲酒戒斷后大鼠血清炎癥因子水平仍然較高，芍藥苷給藥治療能夠有效降低大鼠血清炎癥因子水平。

表1 芍藥苷對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響Table 1 Effect of paeoniflorin on serum inflammatory factors in rats

Paerson相關(guān)性分析表明（表2），血清炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α與PTO值和TD值極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），PTO和TD值越低，大鼠焦慮樣行為越顯著，說(shuō)明血清炎癥因子水平與大鼠焦慮樣行為顯著正相關(guān)。

表2 大鼠血清炎癥因子與焦慮樣行為指標(biāo)相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of serum inflammatory factors and anxiety-like behavior indexes in rats

2.3 芍藥苷對(duì)大鼠腸道菌群多樣性的影響

2.3.1 大鼠腸道菌群α多樣性分析 測(cè)序樣本可操作性分類(lèi)單元覆蓋率均大于99%，采用Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)評(píng)估物種的豐富度和多樣性。由圖2可見(jiàn)，Chao 1和Shannon指數(shù)分析表明，MCG組菌群多樣性略低于NCG組，但差異不顯著（P>0.05），PAG組Shannon指數(shù)高于MCG組，但差異也不顯著（P>0.05）；Simpson指數(shù)酒精戒斷組（MCG和PAG）與NCG三組間差異不顯著（P>0.05）。近期研究以及本課題組前期結(jié)果均表明長(zhǎng)期飲酒和戒酒并沒(méi)有明顯改變微生物的多樣性和豐富度[2,17]，F(xiàn)an等[15]研究同樣表明酒精戒斷組與正常對(duì)照組比較，大鼠結(jié)腸腸道菌群Alpha多樣性有所降低，但差異不顯著。本研究結(jié)果表明酒精戒斷后，芍藥苷給藥治療對(duì)大鼠腸道菌Alpha多樣性影響不顯著， Yu等[18]通過(guò)連續(xù)給藥14 d結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷對(duì)恢復(fù)抑郁癥小鼠腸道菌群豐富度有一定作用，由于本研究給藥時(shí)間僅3 d，可能是產(chǎn)生本研究結(jié)果的主要因素。

圖2 腸道菌群α多樣性分析Fig.2 Alpha diversity analysis of intestinal microorganism

2.3.2 大鼠腸道菌群β多樣性分析β多樣性反映了不同組之間腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果表明，NMDS分析中（圖3A），三組樣本中Stress=0.0706，小于0.2，表明分析具有較高的可靠性。三組處理樣本分別聚集在不同區(qū)域，ANOSIM分析發(fā)現(xiàn)表明組間差異顯著（R2=0.494,P<0.01）；NCG組內(nèi)樣本相對(duì)集中，組間差異小，MCG組和PAG組內(nèi)樣本分布區(qū)域有部分重疊，通過(guò)進(jìn)一步分析結(jié)果表明（圖3B）MCG和PAG兩組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著（R2=0.181,P<0.01）。聚類(lèi)分析結(jié)果表明（圖3C），對(duì)照組與酒精戒斷組首先聚為2支系，其中NCG組單獨(dú)聚為一支，酒精戒斷處理組樣品聚為另外一支后，MCG與PAG之間聚為2個(gè)分支系，PAG組中P1與P3樣品雖與同組其它樣品分支較遠(yuǎn)，但與MCG組樣品也存在明顯差異。以上結(jié)果均說(shuō)明酒精戒斷組與對(duì)照組各樣本間距離交遠(yuǎn)，MCG和PAG組間群落結(jié)構(gòu)也存在顯著差異。目前多項(xiàng)研究表明芍藥苷可以顯著改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu)[19?21]，Chen等[20]研究表明芍藥苷給藥改變了腸道菌群的組成，改善了肥胖小鼠的腸道完整性。結(jié)合本研究結(jié)果說(shuō)明芍藥苷給藥能夠顯著影響酒精戒斷大鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。

通過(guò)隨機(jī)森林分析篩選出對(duì)樣品組間差異具有重要影響的特征種屬，基尼平均值（mean decrease gini）系數(shù)越大，表明去除該物種后，對(duì)樣品組間分類(lèi)的準(zhǔn)確性影響越大，結(jié)果表明（圖3D），紅蝽菌目（uncultured_bacterium_o_Coriobacteriales）、dgA-11 gut_group、普雷沃氏菌（Prevotellaceae） Ga6A1 group、Candidatus_Stoquefichus、Candidatus_Saccharimonas、瘤胃球菌屬[Ruminococcus]_gauvreauii_group、Negativibacillus、毛螺菌屬（Lachnospira）、瘤胃球菌UCG-005（RuminococcaceaeUCG-005）、普雷沃氏菌 UCG-004（PrevotellaceaeUCG-004）等種屬在組間差異中貢獻(xiàn)較大。

圖3 基于OTU水平的腸道微生物菌落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of intestinal microbial colony structure based on OTU level

2.4 大鼠腸道微生物群落組成分析

2.4.1 大鼠腸道菌群不同分類(lèi)水平組成分析 腸道98%的微生物屬于四個(gè)細(xì)菌門(mén)之一，即厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)[22]，細(xì)菌Phylum分類(lèi)水平比較結(jié)果表明（圖4A），三組處理厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）是門(mén)水平上的主要菌門(mén)，二者相對(duì)豐度總量在NCG組、MCG組和PAG組中分別達(dá)到了92.45%、88.44%和90.14%；其中MCG組厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、Patescibacteria、放線菌門(mén)（Actinobacteria）高于NCG組；擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）相對(duì)豐度低于NCG組；PAG組擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、螺旋體門(mén)（Spirochaetes）相對(duì)豐度高于MCG組。Bull等[23]基于腸道微生物組宏基因組分析的研究顯示，在酒精喂養(yǎng)的小鼠中，擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)均出現(xiàn)下降，Yan等[24]發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐富的與對(duì)照組相比，飲酒小鼠擬桿菌門(mén)增加，厚壁菌門(mén)減少。以上研究表明酒精攝入與腸道菌群的改變之間存在密切的關(guān)系，飲酒可以改變腸道菌群中主要群落的豐富度；本研究結(jié)果表明芍藥苷給藥治療可以恢復(fù)部分菌群的豐富度。

物種豐度在前15的菌屬中（圖4B），MCG組乳酸菌屬（Lactobacillus）、uncultured bacterium_f_Muribaculaceae、霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）、瘤胃菌屬（RuminococcaccaeUCG-005）、普氏菌屬（Prevotella9）和Allobaculum屬相對(duì)豐度低于NCG組，瘤胃菌屬（RuminococcaccacUCG-014）、LachnospiraccaeNK4A136 group屬、Romboutsia、Candidatus_Saccharimonas相對(duì)豐度高于NCG組；PAG組乳酸菌屬（Lactobacillus）、Romboutsia屬相對(duì)豐度小于MCG組，uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）、瘤胃菌屬（Ruminococcaccae_UCG-005）、羅氏菌屬（Roseburia）、密螺旋體屬（Treponema）相對(duì)豐度高于MCG組（圖4B）。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在酒精處理過(guò)的小鼠腸道內(nèi)，乳酸桿菌的數(shù)量減少，并證實(shí)益生菌在預(yù)防增加腸道通透性、內(nèi)毒素血癥降低炎癥損傷方面的有益作用[25]。

圖4 門(mén)水平和屬水平上的物種相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of species at phylum and genus levels

為進(jìn)一步研究芍藥苷對(duì)腸道菌群的影響，共篩選出21種差異顯著菌屬，結(jié)果顯示（圖5A～D），物種豐度在前15的菌屬中，瘤胃菌屬（RuminococcaccaeUCG-005）和霍爾德曼氏菌（Holdemanella）兩個(gè)菌屬相對(duì)豐度PAG組顯著高于MCG組（P<0.05）；羅姆布茨菌（Romboutsia）、Candidatus Saccharimonas相對(duì)豐度顯著低于MCG組（P<0.05）。研究發(fā)現(xiàn)腸道中C18-3OH濃度增加可緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，C18-3OH濃度增加與霍爾德曼氏菌（Holdemanella）的豐度增加相關(guān)[26]；瘤胃球菌能夠促進(jìn)短鏈脂肪酸（SCFA）的產(chǎn)生，并且是將初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化為次生膽汁酸的主要微生物，該菌的缺乏與潰瘍性結(jié)腸炎密切相關(guān)[27]。結(jié)果表明，芍藥苷給藥可以增加與緩解腸炎相關(guān)菌屬（Holdemanella和RuminococcaccaeUCG-005）的相對(duì)豐度。

圖5 屬水平顯著差異菌群相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of flora with significant difference at genus level

圖6 各組樣本的 LEfSe 分析和LDA 值分布柱狀圖Fig.6 LEfSe analysis and histogram of LDA value distribution of each group

2.4.2 大鼠腸道菌群差異微生物分析 LEfSe（Line Discriminant Analysis （LDA） Effect Size）能夠在不同組間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物（Biomarker），圖（6A～B）是從門(mén)到種水平下各組樣本的進(jìn)化分支圖和LDA值分布柱狀圖，柱狀圖的長(zhǎng)度代表差異物種的影響大?。礊?LDA Score），不同顏色表示不同分組的物種。結(jié)果分析表明，NCG組中對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響較大的物種有乳酸菌種（uncultured_bacterium gLactobacillus）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、桿菌綱（Bacilli）、乳桿菌目（Lactobacillales）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）等；MCG組中對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響較大的物種有消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、羅姆布茨菌（Romboutsia）、Candidatus Saccharimonas、Patescibacteria等；PAG組中對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響較大的物種有梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、uncultured_bacterium g Holdemanella菌種、霍爾德曼氏菌（Holdemanella）、瘤胃菌種（uncultured bacterium gRuminococcaceaeUCG-005）、瘤胃菌屬（RuminococcaceaeUCG-005）等。在已有的研究中發(fā)現(xiàn)酒精依賴(lài)和戒斷腸道菌群中乳酸菌、擬桿菌以及瘤胃球菌的豐度和組成發(fā)生顯著變化，并且證實(shí)這些細(xì)菌對(duì)腸道屏障功能具有較大影響[28?30]。

2.5 腸道菌群相對(duì)豐度與炎癥因子相關(guān)性分析

將炎癥因子與微生物門(mén)水平豐富度前10和菌屬豐富度前15物種數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，如圖7所示，在門(mén)水平上，放線菌門(mén)（Actinobacteria）、Patescibacteria與IL-6、IL-1β和TNF-α顯著正相關(guān)（P<0.05），厚壁菌門(mén)（Firmicutes）與TNF-α顯著正相關(guān)（P<0.05），擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）與IL-1β和TNF-α顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）與IL-6顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

圖7 炎癥因子與門(mén)水平和屬水平微生物相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of inflammatory factors with phylum level and genus level microorganism

在屬水平上，Candidatus Saccharimonas和羅姆布茨菌（Romboutsia）與IL-6、IL-1β和TNF-α顯著正相關(guān)（P<0.05），瘤胃菌屬（RuminococcaceaeUCG 0014）與IL-6顯著正相關(guān)（P<0.05），毛螺菌屬（LachnospiraceaeNK4A136 group）與TNF-α顯著正相關(guān)（P<0.05）；霍爾德曼氏菌（Holdemanella）與IL-6顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），普氏菌屬（Prevotella）與IL-1β顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

芍藥苷作為不良反應(yīng)小、毒副作用較少的藥食同源的一種免疫調(diào)節(jié)藥，同時(shí)具備抗炎、抗氧化、腦保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)等作用。細(xì)胞因子是宿主對(duì)炎癥和免疫系統(tǒng)反應(yīng)的主要信號(hào)蛋白，包括白介素、趨化因子、生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、干擾素和集落刺激因子。研究表明芍藥苷降低炎癥反應(yīng)的作用方式涉及調(diào)節(jié)NF-κB通路，這可能是芍藥苷抗炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。NF-κB調(diào)控的基因包括編碼IL-2、IL-6、IL-8、IL-2受體TNF-α、干擾素-γ的基因（IFN-γ）和c-Myc[31?33]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期飲酒患者血清中IL-6和TNF-α水平明顯升高，焦慮、心理壓力與外周血IL-6和TNF-α水平呈正相關(guān)[34?35]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)酒精戒斷大鼠血清炎癥因子水平與焦慮樣行為正相關(guān)，芍藥苷給藥治療可以顯著緩解焦慮樣行為，降低血清炎癥因子水平。

腸道菌群在人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮著重要作用，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，參與了許多精神疾病的發(fā)病機(jī)制；腸道微生物同時(shí)可以調(diào)節(jié)焦慮、情緒、認(rèn)知和疼痛[36]。在酒精依賴(lài)中存在腸-腦軸的作用關(guān)系，腸道微生物群可以改變腸道屏障，影響酒精依賴(lài)行為的嚴(yán)重程度，酒精的攝入會(huì)導(dǎo)致腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)和失調(diào)，影響腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的改變[29]。慢性乙醇給藥導(dǎo)致大鼠生態(tài)失調(diào)，小鼠瘤胃球菌科[37]水平下降， 厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的增加[38]。Sophie等研究認(rèn)為短期酒精戒斷會(huì)改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，特別是改變瘤胃球菌的豐富度 ，但是對(duì)物種的多樣性影響較小。瘤胃菌屬與緩解結(jié)腸炎密切相關(guān)，并且與炎癥患者的焦慮正相關(guān)，而與記憶負(fù)相關(guān)[39]，前期研究發(fā)現(xiàn)瘤胃菌屬與 PTO、TD 顯著負(fù)相關(guān)，表明該菌屬也可能參與到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷給藥能夠顯著增加瘤胃菌屬（RuminococcaccaeUCG-005），和緩解炎癥反應(yīng)相關(guān)的霍爾德曼氏菌（Holdemanella）的相對(duì)豐度。Yu等[18]同樣發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有顯著的抗抑郁活性，并且通過(guò)增加益生菌的豐度來(lái)緩解抑郁癥狀。LEfSe分析表明酒精戒斷組Candidatus Saccharimonas和Patescibacteria對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響較大，其中Candidatus Saccharimonas屬于條件性致病菌，而Patescibacteria在結(jié)腸炎小鼠模型相對(duì)豐度高于正常組[40]，相關(guān)性分析同樣表明Candidatus Saccharimonas與IL-6、IL-1β和TNF-α均顯著正相關(guān)（P<0.05）。這進(jìn)一步說(shuō)明芍藥苷可以通過(guò)降低腸道中致病菌的豐度，增加有益菌的豐度，緩解炎癥反應(yīng)，這也可能成為芍藥苷緩解酒精戒斷焦慮樣行為的一種作用方式，使其成為治療酒精戒斷焦慮的潛在藥物。