基于UHPLC-Q-TOF/MS法同時檢測豬肉中主要抗生素類獸藥殘留

裴 斐，韓 萍，王 杰，馬 寧，蘇安祥，楊文建，胡秋輝

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

中國是豬肉生產(chǎn)消費大國，獸藥殘留是影響豬肉食品安全的關(guān)鍵。如何提升獸藥殘留檢測手段、規(guī)范使用獸藥，成為了保證國民食品安全、促進我國食品貿(mào)易的關(guān)鍵。其中，獸藥抗生素類藥物具有防治細菌、真菌感染，提高存活率的作用，常作為飼料添加劑廣泛用于生豬生長養(yǎng)殖[1]。一方面，獸藥抗生素可以通過抑制細菌細胞壁的合成或增強細菌細胞膜的通透性，抑制腐敗微生物的生長[2]；另一方面，它可通過阻斷DNA回旋酶和抑制細菌DNA復(fù)制來實現(xiàn)抗菌作用[3]。如大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素可通過與細菌核糖體或其反應(yīng)底物（tRNA、mRNA）相互作用，來抑制蛋白質(zhì)合成[4]。β-內(nèi)酰胺類抗生素通過阻礙細菌細胞壁的合成，從而導(dǎo)致細菌在低滲透壓環(huán)境下膨脹破裂死亡。這三類抗生素藥物由于其出色的治理能力，常被作為飼料添加劑促進生豬生長養(yǎng)殖。然而，過度使用抗生素會引起細菌耐藥性和動物體內(nèi)殘留問題。過量的抗生素不僅會危害人體和生態(tài)環(huán)境，并且農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留過量會制約中國的出口貿(mào)易[5?6]。因此，建立快速、高效和可信的檢測抗生物類獸藥殘留方法具有重要意義。

動物源性食品存在基質(zhì)復(fù)雜、干擾物多等特點，目標(biāo)化合物因其理化性質(zhì)差異導(dǎo)致其藥代動力學(xué)不同，在動物體內(nèi)分布也不同。由于獸藥殘留在樣品中含量極低，國內(nèi)外檢測標(biāo)準均在向微量化、痕量化發(fā)展，因此樣品前處理技術(shù)是檢測獸藥殘留的關(guān)鍵。QuEChERS方法是以提取劑、吸水劑和吸附劑對樣品進行前處理的一種技術(shù)手段。與消除基質(zhì)效果較差和有機溶劑消耗量大的液液萃取法[7]，易堵塞填料和檢測成本高的固相萃取法[8?10]以及檢測時間長和高含水量樣品回收率較低的基質(zhì)固相分散技術(shù)[11?12]相比，QuEChERS方法省時、操作簡便、提取效果好。獸藥主要由極性或弱極性的小分子化合物組成，動物性食品具有基質(zhì)成分復(fù)雜的特點，因此儀器的高靈敏和高選擇性是獸藥殘留檢測技術(shù)發(fā)展的方向。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是獸藥檢測領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的一種技術(shù)。與精密度差和線性范圍窄的酶聯(lián)免疫法[13?15]、專一性強但無法同時檢測多種藥物殘留的分子印記技術(shù)[16]和靈敏度低，抗干擾能力差的高效液相色譜[17?18]相比，超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（UHPLC-Q-TOF/MS）利用UHPLC的高效分離性和MS檢測器的高靈敏性、高選擇性相結(jié)合，能夠?qū)ΛF藥殘留進行微量、痕量分析[19?22]。朱萬燕等[23]采用QuEChERS結(jié)合UHPLC-Q-TOF/MS的方法，結(jié)果表明該方法簡便、快速、靈敏，適用于豬肉中多類獸藥殘留的同時檢測。李瑋等[24]采用QuEChERS結(jié)合UHPLC-Q-TOF/MS測定辣椒中多種禁用著色劑，結(jié)果表明該方法具有快速、靈敏、準確和高通量等優(yōu)點，可應(yīng)用于實際辣椒樣品中多種禁用著色劑的日常檢測。目前，將QuEChERS樣品前處理方法和UHPLC-Q-TOF/MS快速檢測方法結(jié)合用于抗生素類獸藥檢測鮮有相關(guān)報道。

本文從色譜、質(zhì)譜條件和提取條件等參數(shù)進行優(yōu)化，以期建立QuEChERS凈化結(jié)合UHPLC-QTOF/MS同步測定新鮮生豬肉中10種獸藥殘留批量檢測的分析方法，為今后抗生素類獸藥殘留檢測方面的研究提供必要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

50份新鮮生豬肉樣品 采購于不同省市市場；甲酸、乙酸、乙酸銨、乙腈、甲醇均為色譜純 德國Merck公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、氯化鈉、醋酸鈉、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂和乙二胺四乙酸二鈉均為分析純 國藥集團化學(xué)試劑公司；N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、多點鍵合十八烷基（C18）、C18鍵合鋯膠（Z-SEP+）、佛羅里硅土（Florosil），10種標(biāo)準品（純度≥98%）：吉他霉素（kitasamycin, KTY）、泰樂霉素（Tylosin, TYL）、四環(huán)素（Tetracycline, TC）、土霉素（Oxytetracycline,OTC）、金霉素（Chlorotetracycline, CHTC）、強力霉素（Doxitard, DOX）、青霉素V（Phenoxymethylpenicillin, PEN-V）、阿莫西林（Amoxicillin, AMO）、氨芐西林（Ampicillin, AMP）、頭孢拉定（Cefradine, RAD） 美國Sigma公司。

Triple TOF 5600+飛行時間質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（ESI）及Analyst1.7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國AB公司；Nexer系列超高效液相色譜儀（包括脫氣機（DGU-20A5R）、自動進樣器（SIL-30AC）、紫外檢測器（SPDM-20A）、柱溫箱（CTO-30A）及溶液輸送單元（LC-30AD）） 日本島津公司；Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm） 美國Agilent公司；Accucore Vanquish C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.7 μm） 美國Thermo公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；DL-5C離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；T18均質(zhì)機 德國IKA公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；SL1202N型電子天平 上海民橋科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 標(biāo)準溶液的配制 分別稱取10 mg標(biāo)準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配置成濃度為1000 mg/L的單標(biāo)儲備液，置于?20 ℃冰箱中避光儲存。根據(jù)需要時將單標(biāo)儲備液混合配制成不同濃度的混合標(biāo)準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.2 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的配制 稱取28.41 g磷酸氫二鈉用水溶解，定容至1000 mL，制成磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）。稱取21.01 g檸檬酸用水溶解，定溶至1000 mL，制成檸檬酸溶液（0.1 mol/L）。將1000 mL檸檬酸溶液（0.1 mol/L）與625 mL磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）混合，加入1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=4，制成Mcllvaine緩沖溶液。稱取62.5 g Na2EDTA于1625 mL Mcllvaine緩沖溶液中均勻混合。

1.2.2 樣品制備 參考郭海霞等[25]的方法并稍作改動。取2.00 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后豬肉于50 mL離心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋5 min。隨后加入15 mL 1%甲酸乙腈，渦旋5 min，超聲10 min，10000 r/min低溫冷凍離心5 min。移取上清液至另一離心管，加入2 g NaCl作為鹽析劑和4 g無水Na2SO4作為吸水劑，渦旋5 min，10000 r/min低溫冷凍離心5 min。移取10 mL上清液至50 mL離心管中，加入300 mg C18作為分散劑，重復(fù)上述步驟，取5 mL上清液氮吹至盡干，加入1 mL 0.1%甲酸乙腈-水溶液（1:9，v/v）復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，上機待測。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：0.1%甲酸乙腈；初始濃度：5%B；洗脫梯度：0～1 min，5%B；1～6 min，5%B～55%B；6～12 min，55%B～90%B；12～13 min，90%B；13～14 min；90%B～5%B；14～15 min，5%B。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 參考朱萬燕等[23]的方法并稍作改動。電噴霧離子源（ESI），正離子模式，離子源溫度：550 ℃；電噴霧電壓：5500 V；霧化氣（GS1）流速：40 μL/min；輔助加熱氣（GS2）流速：40 μL/min；氣簾氣（CUR）流速：20 μL/min；去簇電壓（DP）：100 V；離子富集時間：0.05 s；掃描范圍m/z：100～1000。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計軟件Excel 2016和PeakViewTM軟件對檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的篩選 色譜分離優(yōu)化考慮的主要因素有共流出物分離情況和采集時間。為獲得最佳分離效果及最短分離時間，比較Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）與Accucore Vanquish C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）。結(jié)果顯示150 mm色譜柱保留時間較長，分離效果不顯著。同分異構(gòu)體的洗脫分離是色譜條件的優(yōu)化重點，經(jīng)優(yōu)化后的兩組同分異構(gòu)體（四環(huán)素/強力霉素，氨芐西林/頭孢拉定）效果較好，均能達到基線分離（見圖1）。綜合色譜柱保留時間和分離效果等因素，最終選用Infinity Lab Poroshell 120 ECC18色譜柱。

圖1 4種抗生素類獸藥的提取離子流圖（Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18柱）Fig.1 Extracted ion chromatogram of four kinds of antibiotic veterinary drugs （Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18 column）

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 采用針泵進樣方式分別將1 mol/L單標(biāo)直接進樣，在正離子模式下，母離子為[M+H]+，質(zhì)量偏差窗口為3 ppm，時間偏差為±0.1 min。通過測定各單標(biāo)精確質(zhì)量數(shù)后，優(yōu)化二級質(zhì)譜去簇電壓及碰撞能量（表1），使定性定量離子豐度達到最高。在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜下，分別進樣1 mol/L單標(biāo)，以所得數(shù)據(jù)建立篩查譜庫。

表1 10種抗生素類的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Parameters for UHPLC-Q-TOF/MS analysis of the ten antibiotics

PeakViewTM軟件是Q-TOF通過精確質(zhì)量數(shù)及數(shù)據(jù)庫定性篩查識別目標(biāo)化合物的重要手段[26]。置信因子判斷條件包括質(zhì)量數(shù)誤差、保留時間誤差、同位素豐度比誤差、譜庫匹配誤差和分子式計算誤差[27]。為提高篩查準確性，減少假陽性和假陰性結(jié)果，本研究通過數(shù)據(jù)庫與基質(zhì)加標(biāo)溶液比對（表2）實驗驗證置信因子窗口參數(shù)。結(jié)果表明，10種獸藥均能被正確識別。

表2 空白樣品中10種抗生素定性篩查結(jié)果Table 2 Qualitative screening results of ten antibiotics in blank samples

2.2 提取條件優(yōu)化

由于豬肉中含有大量脂肪和蛋白質(zhì)，因此減少基質(zhì)干擾是提取溶劑選擇的重點。四環(huán)素類藥物含有四個并聯(lián)環(huán)，容易與金屬離子如：鈣、鎂離子螯合影響回收率，因此本實驗應(yīng)保證在避光、低溫恒溫條件下進行，通過加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液可以競爭基質(zhì)中的金屬離子，調(diào)節(jié)緩沖液pH至4.0可以減小四環(huán)素類藥物溶解性，使其能夠更好地被分配至有機相中，提高提取效率[28]。乙腈作為常用有機溶劑具有良好的沉淀蛋白能力，提取溶劑的pH會影響酸堿兩性物質(zhì)的電離[29]。本實驗分別研究了不同酸度乙腈對回收率的影響，結(jié)果如圖2所示，由于β-內(nèi)酰胺類藥物在酸堿兩性下不穩(wěn)定，極易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，其回收率隨著酸度增加而降低[30]。與此同時，大環(huán)內(nèi)酯隨著酸度的增加而增加，0.5%甲酸乙腈回收率最高。綜合考慮化合物在不同酸度下的平均回收率，選擇0.1%甲酸乙腈與Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液組合作為本實驗的提取溶劑。

圖2 不同酸度提取溶劑回收率Fig.2 Recoveries of extraction solvents with different acidities

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價及消除

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)共提物與目標(biāo)分析物競爭電離所產(chǎn)生的影響[31]。本實驗分別配制基質(zhì)標(biāo)準曲線與對應(yīng)濃度的溶劑標(biāo)準曲線（加標(biāo)量：1、5、10、20、50、100 μg/kg），根據(jù)其比值來評價基質(zhì)效應(yīng)當(dāng)比值在0.8～1.2時，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；當(dāng)比值大于1.2時，表明有基質(zhì)增強效應(yīng)；當(dāng)比值小于0.8時，表明有基質(zhì)抑制效應(yīng)。從表3中可以看出，10種抗生素基質(zhì)效應(yīng)均在0.8～1.2范圍內(nèi)。然而，為了獲得更好的定量效果，本實驗仍使用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準曲線來抵消基質(zhì)效應(yīng)[32]。

表3 10種抗生素的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限Table 3 linear equations, correlation coefficients (r), matrix effect, LODs and LOQs of the 10 antibiotics

2.4 線性度、線性范圍、檢出限和定量限

將豬肉樣品按1.4方法，配制5個梯度水平（5、10、20、50、100 μg/kg）的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準溶液上機測定。以定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)軸，質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)軸做定量工作曲線，得到線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r為0.99031～0.99932，在5.0～100.0 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3倍信噪比（S/N）計算得到檢出限（LOD）為0.25～1.0 μg/kg，10倍信噪比算得定量限（LOQ）為0.5～5.0 μg/kg。

2.5 準確度和精密度

本實驗在空白豬肉樣品中添加10種獸藥的混合標(biāo)準溶液（加標(biāo)量：5、10、20 μg/kg），分別進行日內(nèi)實驗（重復(fù)6次）和日間實驗（連續(xù)3 d，每天重復(fù)3次）。如表4所示，各化合物回收率72.3%～117.3%，日內(nèi)RSD為0.9%～10.4%，日間RSD為1.1%～13.4%，結(jié)果滿足方法學(xué)要求。

表4 豬肉中10種抗生素的回收率和精密度Table 4 Recovery and RSD for 10 antibiotics spiked into pork

2.6 實際樣品檢測

為了驗證本方法在實際樣品中的應(yīng)用效果，對采購自不同省市的50份新鮮生豬肉樣品進行篩查分析，結(jié)果顯示有1份豬肉樣品中四環(huán)素呈陽性，含量為75.4±1.8 μg/kg。同時采用國標(biāo)GB/T 21317-2007進行驗證，檢測結(jié)果為77.8±2.3 μg/kg，經(jīng)t檢驗法分析，P>0.05，兩種方法所測結(jié)果無顯著性差異，表明本方法可以作為豬肉中抗生素類獸藥殘留的定性定量測定。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS凈化結(jié)合UHPLC-QTOF/MS法同時篩查豬肉中10種抗生素類獸藥殘留量的分析方法。采用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液-0.1%甲酸乙腈-NaCl-無水Na2SO4-C18的提取凈化組合，通過Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱對10種抗生素類獸藥進行分離，并利用高分辨質(zhì)譜建立了篩查譜庫，縮小了確證誤差。從方法學(xué)驗證所得結(jié)果來看，本方法基質(zhì)效應(yīng)為0.80～1.15，相關(guān)系數(shù)r為0.99031～0.99932，LOD為0.25～1.0 μg/kg，LOQ為0.5～5.0 μg/kg。在不同加標(biāo)濃度下，平均回收率為72.3%～117.3%，日內(nèi)RSD為0.9%～10.4%，日間RSD為1.1%～13.4%。與現(xiàn)行國家標(biāo)準相比，本方法對于實際陽性樣品檢測結(jié)果與國標(biāo)相近，且操作簡便縮短檢測時間，準確度與精密度均滿足方法學(xué)要求，為抗生素類獸藥殘留檢測提供了切實有效的篩查方法，也為食品安全提供了技術(shù)保障。同時也為其他動物源性食品中抗生素類獸藥殘留的檢測提供方法參考，以期實現(xiàn)在待測樣品物理化性質(zhì)差異較大的條件下快速篩查和測定。