一測多評法測定線葉金雀花及其制品中3種黃酮類成分的含量

李曉敏，梁淑明，陳菊英

（完美（廣東）日用品有限公司，廣東中山 528400）

線葉金雀花（Aspalathus Linearis（Brum.f.） R.Dahlgren）是僅產(chǎn)于南非西開普頓地區(qū)的一種豆科針狀灌木，又稱南非茶、博士茶[1]，于2014年批準為新食品原料[2]。研究表明，線葉金雀花富含黃酮類、多酚類、酚酸類和多糖類化合物[3]，具有抗氧化[4?6]、保護心血管[7]、降血糖[8?10]、抗炎[11?12]等作用。一般認為，黃酮類成分對抗氧化應激、解痙、抗病毒等作用具有重要意義[13]，線葉金雀花中黃酮類化合物主要為葒草苷、異葒草苷、阿司巴汀和異槲皮苷等[14]。線葉金雀花中葒草苷、異葒草苷中的含量較高，同時，阿司巴汀是至今發(fā)現(xiàn)唯一存在于線葉金雀花的生物類黃酮[15]。阿司巴汀是一種天然的二氫查爾酮，具有較強的抗氧化特性，被認為是線葉金雀花對健康有益的主要成分[16]，不同加工工藝對阿司巴汀、葒草苷和異葒草苷的含量影響較大[17?18]。因此，通過測定葒草苷、異葒草苷和阿司巴汀的含量對線葉金雀花及其制品進行質(zhì)量控制具有積極作用。

目前，文獻報道一般采用外標法測定線葉金雀花中異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀的含量[18?23]。傳統(tǒng)的外標法需要使用異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀三種對照品，但阿司巴汀對照品不穩(wěn)定、較難獲得且價格昂貴，大大增加了檢測成本。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker,QAMS）是一種多指標質(zhì)量評價模式[24]，通過選用1種廉價易得的對照品為參照，建立其他待測成分與該對照品的相對校正因子（relative correction factor,F），來計算其待測他成分的含量[25]，已廣泛應用于食品、保健食品、中藥和化妝品的多成分質(zhì)量評價中[26?30]。因此，本研究采用一測多評技術，選取價廉易得的異葒草苷為參照物，建立其與葒草苷和阿司巴汀的相對校正因子，實現(xiàn)通過只測定異葒草苷的含量，用校正因子計算出葒草苷和阿司巴汀的含量，從而簡便快捷、全面準確地對線葉金雀花及其制品進行多指標的質(zhì)量評價，有助于保證產(chǎn)品的質(zhì)量可控，節(jié)約檢測成本和時間。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

線葉金雀花、線葉金雀花提取物、線葉金雀花茶、按處方比例和工藝制成的不含線葉金雀花提取物的陰性對照樣品 均由完美（廣東）日用品有限公司提供；異葒草苷（批號111974-201401，純度94.0%）、葒草苷（批號111777-201302，純度97.9%） 中國食品藥品檢定研究院；阿司巴汀（批號HWI00319，純度94.84%） HWI Pharma services GmbH；乙醇、甲醇、冰醋酸、甲酸 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈 色譜純，德國默克公司。

1260高效液相色譜儀（配置二極管陣列檢測器）安捷倫科技有限公司；e2695高效液相色譜儀（配置二極管陣列檢測器）、ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀（配置雙波長紫外檢測器） 沃特世科技（上海）有限公司；ML204/02型電子天平（感量為0.1 mg）、MS205DU型電子天平（感量為0.01 mg）梅特勒-托利多有限公司；P180H超聲波清洗儀 德國Elma公司；Milli-Q超純水儀 德國默克密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀對照品適量，加含0.2%維生素C的60%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含異葒草苷質(zhì)量濃度為4.8、9.5、23.8、47.6、95.2、142.8 μg/mL，葒草苷質(zhì)量濃度為4.4、8.9、22.2、44.4、88.8、133.2 μg/mL，阿司巴汀質(zhì)量濃度為1.8、3.7、9.1、18.2、36.5、54.8 μg/mL的混合對照品溶液，并于4 ℃冰箱中避光保存，備用。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 取線葉金雀花提取物0.2 g、線葉金雀花0.5 g以及線葉金雀花茶0.3 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液約20 mL，超聲處理（37 kHz，500 W）30 min，放冷，用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，用0.45 μm有機濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.1.3 陰性對照溶液的制備 按配方比例和工藝，制成不含線葉金雀花提取物的陰性樣品，按“1.2.1.2”項下方法制備陰性對照溶液。

1.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為A：1%冰醋酸，B：乙腈；梯度洗脫程序：0～12 min，12% B；12～25 min，12%～20% B；25～28 min，20% B；28～28.01 min，20%～100% B；28.01～38 min，100% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：288 nm（阿司巴?。┖?50 nm（異葒草苷、葒草苷）；進樣量：5 μL。

1.2.3 色譜條件考察

1.2.3.1 檢測波長的選擇 分別取異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀對照品適量，加入60%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度約為10 μg/mL的溶液。按“1.2.2”色譜條件，同時設置二極管陣列檢測器在210～400 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，取上述對照品溶液注入液相色譜儀，記錄各對照品溶液的光譜掃描圖，考察各對照品溶液的最佳檢測波長。

1.2.3.2 流動相的優(yōu)化 分別采用乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液和乙腈-1%冰醋酸水溶液進行流動相的篩選，考察對待測成分與相鄰未知成分分離度的影響。

1.2.3.3 色譜柱的選擇 分別使用Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Diamonsil C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）四種不同型號的色譜柱對供試品溶液進行檢測，考察對待測成分與相鄰未知成分分離度的影響。

1.2.4 一測多評法的方法學考察 參考文獻[31]進行實驗。

1.2.4.1 專屬性試驗 按“1.2.2”色譜條件，取提取溶劑（60%乙醇溶液）、“1.2.1.1”項下混合對照品溶液、“1.2.1.2”項下供試品溶液、“1.2.1.3”項下陰性對照溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.4.2 線性關系、檢出限和定量限考察 分別精密吸取6個系列濃度的混合對照品溶液，按“1.2.2”色譜條件測定。以各溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行回歸處理，繪制標準曲線。取異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀對照品溶液，逐級稀釋，依照“1.2.2”色譜條件測定，計算信噪比（S/N），以S/N=3時對應的待分析物濃度為檢出限，S/N=10時對應的待分析物濃度為定量限。

1.2.4.3 儀器精密度試驗 精密吸取“1.2.1.1”項下混合對照品溶液，按“1.2.2”色譜條件，連續(xù)測定6次，記錄異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀的峰面積，計算峰面積和保留時間的RSD值。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一對照品溶液和供試品溶液，按“1.2.2”色譜條件，分別于0、8、16、24 h進樣測定。記錄異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀的峰面積，計算峰面積的RSD值。

1.2.4.5 重復性試驗 取線葉金雀花茶（批號為2018 0531-1）、線葉金雀花提取物（批號為20151022）以及線葉金雀花（批號為TLE6124847），按照“1.2.1.2”項下方法分別平行制備供試品溶液6份，按照“1.2.2”色譜條件測定，計算各試樣中異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀的含量和RSD值。

1.2.4.6 加標回收率試驗 分別取已測定的樣品（批號為20180531-1、20151022及TLE6124847）9份，精密稱定，分別精密加入相當于供試品中待測成分含量的80%、100%、120%的混合對照品溶液，按照“1.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.2”色譜條件測定，計算試樣中異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀的回收率和RSD值。

1.2.4.7 相對校正因子（F）和相對保留時間（RRT）的計算 在“1.2.2”色譜條件下，取按“1.2.1.1”項下方法配制的三份6個濃度的混合對照品溶液，分別在不同時間注入不同液相色譜儀，記錄保留時間和峰面積，并繪制標準曲線。以異葒草苷為參照物，通過計算標準曲線斜率的比值，計算葒草苷和阿司巴汀的相對校正因子；通過計算葒草苷、阿司巴汀與異葒草苷的保留時間的比值，計算葒草苷和阿司巴汀的相對保留時間。

1.2.4.8 F及RRT的耐用性考察 取按“1.2.1.2”項下方法制備的供試品溶液，分別考察流速（0.9和1.1 mL/min）、柱溫（23、25和30 ℃）、不同批次色譜柱（批號分別為0314380961、0309372961和0313380991）和不同儀器（Agilent 1260、Waters e2695和 Waters UPLC H-Class）等條件的變化對對葒草苷及阿司巴汀F和RRT的影響。

1.2.5 QAMS法與外標法結(jié)果比較研究 采用HPLC法，以異葒草苷作為“一測多評法”的參照成分測定其在線葉金雀花及其制品中的含量，并通過葒草苷和阿司巴汀的F，分別計算出這兩種成分的含量。同時，使用外標法測定線葉金雀花及其制品中葒草苷和阿司巴汀的含量，從而驗證QAMS法用于測定線葉金雀花及其制品中異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀結(jié)果的準確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Agilent 1260儀器配套的Agilent OpenLAB色譜處理軟件和Waters e2695以及Waters ACQUITY UPLC H-Class儀器配套的Empower色譜處理軟件完成數(shù)據(jù)采集、處理和計算，Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)匯總和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 檢測波長的選擇 通過二極管陣列檢測器對對照品溶液在210～400 nm范圍內(nèi)的光譜掃描，結(jié)果見圖1，其中異葒草苷和葒草苷的最大吸收波長約為350 nm，阿司巴汀的最大吸收波長約為288 nm。因此，選擇在288 nm波長下測定阿司巴汀，在350 nm波長下測定異葒草苷和葒草苷。

圖1 異葒草苷、葒草苷、阿司巴汀的光譜圖Fig.1 Spectrogram of isoorientin, orientin and aspalathin

2.1.2 流動相的優(yōu)化 當使用乙腈?0.1%冰醋酸水溶液或乙腈?0.2%甲酸水溶液作為流動相時，在350 nm下異葒草苷峰與相鄰未知峰的分離度小于1.5，在288 nm下阿司巴汀峰與相鄰未知峰的分離度小于1.5。而當使用乙腈?1%冰醋酸水溶液作為流動相時，3種待測成分峰與相鄰色譜峰的分離度良好、峰型良好，且保留時間適中（見圖2）。因此本實驗選用乙腈?1%冰醋酸水溶液作為異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀含量測定的流動相。

2.1.3 色譜柱的選擇 本實驗使用了四種不同型號的C18色譜柱進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種待測成分色譜峰的出峰順序、保留時間、峰型和分離度均有較大差異，這會影響相對校正因子和相對保留時間的計算。當使用Waters Symmetry C18色譜柱時，3種待測成分峰與相鄰色譜峰的分離度良好、峰型良好，保留時間適中（見圖2）。因此，本實驗選擇Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）進行測定。

圖2 線葉金雀花提取物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the extract of Aspalathus linearis

2.2 一測多評法的方法學考察結(jié)果

2.2.1 專屬性試驗 測得提取溶劑色譜圖、陰性對照溶液色譜圖、對照品溶液色譜圖和供試品溶液色譜圖，結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，提取溶劑色譜圖以及陰性對照溶液色譜圖中均未見與對照品溶液色譜圖中異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀相同保留時間的色譜峰，證明提取溶劑以及陰性無干擾。

圖3 288與350 nm下各測試溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram of each solution at 288 and 350 nm

2.2.2 線性關系、檢出限和定量限考察 通過各對照品溶液質(zhì)量濃度對峰面積的回歸處理，各物質(zhì)的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍結(jié)果見表1。結(jié)果表明，異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀這三種成分在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，R2>0.9990。以S/N=3時計算得出檢出限（LOD）為4.6～34.5 ng/mL，S/N=10時計算得出定量限（LOQ）為23.2～137.9 ng/mL（見表1）。

表1 對照品的線性關系、檢出限與定量限Table 1 Linear relationships, LODs and LOQs of reference substance

2.2.3 儀器精密度試驗 測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，3種待測成分的保留時間與峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

表2 儀器精密度試驗結(jié)果Table 2 Results of instrument precision test

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明，3種待測成分的峰面積RSD均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 Results of stability test

2.2.5 重復性試驗 測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，各測試結(jié)果的RSD均小于2%，表明本法具有較好的重復性。

表4 重復性試驗結(jié)果Table 4 Results of repeatability test

2.2.6 加標回收率試驗 測定結(jié)果見表5。結(jié)果表明，回收率在97.4%～101.8%之間，RSD均小于3%，表明本法具有較好的準確度。

表5 加標回收率試驗結(jié)果Table 5 Results of spiked recovery test

2.2.7 相對校正因子（F）和相對保留時間（RRT）的計算 相對校正因子常用計算方法有多點法、斜率法和過原點的曲線斜率法[32]，本實驗采用斜率法。本實驗分別測得異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀的標準曲線斜率，以異葒草苷為參照物，通過計算其與葒草苷和阿司巴汀的標準曲線斜率的比值，得出葒草苷的相對校正因子為1.068，阿司巴汀的相對校正因子為1.165；通過計算其與葒草苷和阿司巴汀的保留時間的比值，得出葒草苷的相對保留時間為1.066，阿司巴汀的相對保留時間為1.168，結(jié)果見表6。

表6 相對校正因子和相對保留時間的計算結(jié)果Table 6 Results of relative correction factor and relative retention time

2.2.8 F及RRT的耐用性考察

2.2.8.1 不同流動相流量對F及RRT的影響 考察了不同流量（0.9、1.0、1.1 mL/min）對各成分F及RRT的影響。結(jié)果見表7，各成分F的RSD分別為0.44%、2.64%，各成分RRT的RSD分別為0.24%、0.86%。結(jié)果表明體積流量的微小變化對葒草苷及阿司巴汀的F及RRT均無明顯影響。

表7 不同流量對F和RRT的影響Table 7 F and RRT factors of different flow rates

2.2.8.2 不同色譜柱溫度對F及RRT的影響 考察了不同色譜柱溫度（23、25和30 ℃）對各成分F及RRT的影響。結(jié)果見表8，各成分F的RSD分別為0.28%、2.60%，各成分RRT的RSD分別為0.58%、1.63%。結(jié)果表明色譜柱溫度的微小變化對葒草苷及阿司巴汀的F及RRT均無明顯影響。

表8 不同色譜柱溫度對F和RRT的影響Table 8 F and RRT factors of different column temperatures

2.2.8.3 不同批次色譜柱和不同儀器對F及RRT的影響 在色譜條件的優(yōu)化試驗中，確定了采用Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）進行測定。因此，本試驗在1.2.2色譜條件下，考察了不同批次色譜柱（批號分別為0314380961、0309372961和0313380991）和不同儀器（Agilent 1260、Waters e2695和 Waters UPLC H-Class）對各成分F及RRT的影響，結(jié)果見表9，各成分F的RSD分別為0.53%、1.74%，各成分RRT的RSD分別為0.25%、0.22%。結(jié)果表明葒草苷及阿司巴汀的F及RRT在不同批次色譜柱上的重現(xiàn)性較好，儀器的更換對葒草苷及阿司巴汀的F及RRT均無明顯影響。

表9 不同批次色譜柱和不同儀器對F和RRT的影響Table 9 F and RRT factors of columns in different batches and different instruments

2.3 QAMS 法與外標法結(jié)果比較研究

采用QAMS法和外標法測定線葉金雀花及其制品中異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀的含量結(jié)果見表10，將2種方法所得含量經(jīng)秩和檢驗[33]分析二者差異，結(jié)果葒草苷兩組數(shù)據(jù)間P值為0.739，阿司巴汀兩組數(shù)據(jù)間P值為0.075，均大于0.05，故葒草苷、阿司巴汀外標法實測值與一測多評法計算值間無顯著性差異，表明建立的QAMS法準確可行。

表10 QAMS法與外標法測定線葉金雀花及其制品中3種成分的比較Table 10 Comparison of three components in Aspalathus linearis and its products by QAMS and external standard method

3 結(jié)論

本實驗建立了線葉金雀花及其制品中異葒草苷、葒草苷和阿司巴汀的一測多評檢測方法，考察了專屬性、儀器精密度、穩(wěn)定性、重復性以及回收率，結(jié)果陰性無干擾，儀器精密度、穩(wěn)定性和重復性RSD值均小于3%，回收率在 97.4%～101.8%之間；同時，該方法在不同流動相流量、不同色譜柱溫度、不同批次色譜柱和不同高效液相色譜儀等條件下均有良好的重復性，耐用性良好。本實驗還對外標法測得值和QAMS法計算值進行了秩和檢驗分析，結(jié)果2種方法所得含量之間無顯著性差異（P>0.05），表明建立的QAMS法準確可行。線葉金雀花及其制品中化學成分眾多，以外標法測定各成分含量需要對照品的數(shù)量多，部分對照品價格昂貴且難以獲取，采用QAMS法測定各成分含量能極大地減少對照品使用數(shù)量，節(jié)約成本，增加檢測便利性。因此，QAMS法用于線葉金雀花及其制品的質(zhì)量控制具有極高的實用性、便利性和科學性。