2020～2021年廣州市售牡蠣中GII型諾如病毒污染情況調(diào)查

楊家樂，薛 亮 ，蔡偉程，李貽靜，高珺珊，陳謀通，葉青華，吳 詩，張菊梅，別小妹 ，吳清平

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省科學(xué)院，華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東廣州 510070；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

諾如病毒（Norovirus，NoV）是一種常見的食源性病毒，人感染后會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀，通常在醫(yī)院、學(xué)校、養(yǎng)老院等人員密集場所易發(fā)生小規(guī)模的聚集性暴發(fā)[1?2]，不但對人體健康產(chǎn)生危害，同時也造成了巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)衣殼蛋白（VP1）的序列，諾如病毒可以分為GI-GX十種基因組，包括48個基因型[3?4]。諾如病毒傳播主要通過糞口途徑，患者的嘔吐物及糞便中一般都有較高濃度的病毒，有較強的傳染性，并通過氣溶膠傳播[5]。近些年國內(nèi)各個省市因感染諾如病毒而出現(xiàn)急性腸胃炎癥狀的患者數(shù)量居高不下[6?9]，其中2013～2017年廣東省報告的散發(fā)諾如病毒感染167例，超過60%的病例是由GII.2、GII.4、GII.17型病毒引起[10]。

諾如病毒能夠在自然環(huán)境中持續(xù)存在并保持感染性，主要通過將未經(jīng)處理或未經(jīng)充分處理的污水排放或泄漏到泉水、河流、水壩或入?？诘人粗卸罱K進(jìn)入環(huán)境中。該病毒常在食品及水中被檢出[11?13]，新鮮的水果、蔬菜表面因接觸污水也存在污染風(fēng)險，雙殼貝類（如牡蠣、貽貝等）一般在近海附近養(yǎng)殖，作為濾食性生物能夠過濾大量的水，對水中的病原微生物起到富集的作用[14]；尤其貝類的消化組織中存在類組織血型抗原[15]，在病毒與貝類組織結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用，因此消化組織是病毒富集的主要部位，富集含量最高[16]。由于貝類中的病毒主要來自于環(huán)境，因此當(dāng)新的病毒流行株在環(huán)境中出現(xiàn)時，貝類中也會檢測到同樣的病毒基因型。由于GII型諾如病毒結(jié)合的組織類型比其他基因型豐富，它可以存在于消化腺、腸道、腮部、外套膜等多個部位[17]，因此需要重點關(guān)注該病毒基因型在牡蠣中的存在情況。

廣東作為貝類養(yǎng)殖大省，但同時市售牡蠣中存在諾如病毒污染問題[18]，食用前如不高溫加熱將其中的病毒滅活，有被感染的風(fēng)險，監(jiān)測相關(guān)貝類產(chǎn)品中諾如病毒的污染水平對于預(yù)防此類事件的發(fā)生有重要意義。因此，為了進(jìn)一步掌握廣州地區(qū)市售牡蠣中GII型諾如病毒污染情況，本研究開展了為期一年的監(jiān)測調(diào)查，以期明確該地區(qū)牡蠣中諾如病毒的污染水平及季節(jié)分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣樣品于2020年6月至2021年5月，在廣州市黃沙水產(chǎn)市場購買牡蠣，挑選體積大小近似（挑選的樣品體長在10～14 cm之間，體寬在6～9 cm之間，牡蠣肉重量（去殼）在14～20 g之間），新鮮且外觀無明顯損傷的牡蠣，每個牡蠣經(jīng)過無菌解剖后取消化腺組織進(jìn)行下一步檢測或保存在?80 ℃冰箱待檢；諾如病毒陽性樣本 來自廣州市急性腸胃炎患者的糞便樣本[19]，經(jīng)過處理后保存在?80 ℃冰箱；鼠諾如病毒（Murine norovirus，MNV） 由廣東省科學(xué)院微生物研究所食源性病毒組提供；蛋白酶K 30 U/mg，Merck公司；聚乙二醇（PEG）6000 kingbio公司；10×磷酸鹽緩沖鹽溶液 PH7.2，上海生工生物工程股份有限公司；Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit（Probe）艾科瑞公司；Premix Taq? （Ex Taq? Version 2.0 plus dye）、One Step Prime Script? RT-PCR Kit（Perfect Real Time ）上海百賽生物技術(shù)有限公司；High Pure Viral RNA Mini Kit試劑盒 廣州美基生物科技有限公司；引物及探針 由北京六合華大基因科技有限公司合成；100 bp DNA Ladder 北京擎科生物科技有限公司。

Microfuge 20R臺式冷凍離心機 美國Beckman公司；Quant Studio 6 and 7 Flex Real-Time 熒光定量PCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR儀 美國Roche公司；Biometra Tone 96 PCR儀 德國耶拿公司；振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；MY-10/20手持式電動組織研磨器 上海凈信有限公司；SW-CJ-IFD型超凈工作臺 中國蘇凈安泰公司；T500電子天平 美國G&G公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 根據(jù)本實驗室已建立方法進(jìn)行牡蠣樣本的處理[20]，具體如下：每個牡蠣樣品取其消化腺組織0.15 g，分裝在1.5 mL離心管中打碎勻漿，加入10 μL鼠諾如病毒（作為過程控制對照），并加入1.2 mL蛋白酶K溶液（100 μg/mL）渦旋混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱320 r/min振蕩60 min；60 ℃水浴加熱15 min，使蛋白酶K滅活，待冷卻至室溫，10000 r/min離心3 min；吸取上清液，加入600 μL PEG6000（36% PEG6000，0.9 mol/L NaCl）并將混合液放入4 ℃冰箱靜置1 h，然后10000 r/min離心10 min；棄去上清液取沉淀；用140 μL 磷酸鹽緩沖鹽溶液（稀釋為1×）重懸沉淀，用于核酸抽提。

此外，取鼠諾如病毒以及諾如病毒樣本與樣品一起提取RNA，用于計算病毒回收率以及PCR擴增效率。

1.2.2 提取病毒RNA 用High Pure Viral RNA Mini Kit試劑盒提取病毒RNA，按照說明書中的操作步驟提取病毒RNA，直接用于核酸檢測，或置于?80 ℃冰箱保存代用。

提取病毒RNA后采用熒光定量RT-PCR和巢式RT-PCR進(jìn)行檢測，兩種技術(shù)的檢測靈敏度存在差異。其中熒光定量RT-PCR是目前國家標(biāo)準(zhǔn)和ISO標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法，靈敏度較高，而巢式RT-PCR靈敏度相對較低，但其結(jié)合桑格測序能夠獲得目的病毒序列。

1.2.3 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測 如表1和表2，反應(yīng)體系：2 × One Step RT-qPCR Buffer 10 μL，Pro Taq HS DNA Polymerase 0.4 μL，Evo MMLV RTase Enzyme Mix 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），探針0.8 μL（10 μmol/L），RNA模板2 μL，加無RNA酶水至反應(yīng)體系為20 μL。具體反應(yīng)條件：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄300 s，1個循環(huán)；95 ℃預(yù)變性10 s，1個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火，20 s，45個循環(huán)。將諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋（濃度為2×108～2×100copies），根據(jù)拷貝數(shù)與PCR反應(yīng)的Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果判斷：若樣品有S型擴增且Ct值≤40，判為陽性，有S型擴增且Ct值>40或無明顯S型擴增曲線但報告有Ct值，仍判定為陰性。檢測結(jié)果為陽性樣本的Ct值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=?3.428lg(x)+43.15）計算病毒拷貝數(shù)，其中y為熒光定量Ct值，x為病毒拷貝數(shù)。

表1 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time RT-PCR）的引物與探針Table 1 Primers and probes of Real-time reverse transcription polymerase chain reaction

表2 巢式RT-PCR引物Table 2 Nested RT-PCR primers

1.2.4 巢式RT-PCR定性檢測 熒光定量檢測為陽性結(jié)果的樣品，經(jīng)過巢式RT-PCR擴增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，符合目標(biāo)條帶的擴增產(chǎn)物送去測序。第一輪巢式PCR反應(yīng)體系：2×1 Step Buffer （Dye Plus） 10 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，上下游引物各1 μL，RNA模板2 μL，加無RNA酶水至反應(yīng)體系為 20 μL。第一輪巢式PCR反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性4 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。第二輪巢式PCR反應(yīng)體系：Premix Taq? （Ex Taq? Version 2.0 plus dye） 10 μL，上下游引物各1 μL，RNA模板2 μL，加無RNA酶水至反應(yīng)體系為20 μL。第二輪巢式PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，77 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.5 基因序列分析 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后，將陽性擴增產(chǎn)物送于北京六合華大基因科技有限公司直接測序進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至在線基因分型工具（https://www.rivm.nl/mpf/typingtool/norovirus/），并在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST在線比對（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。為進(jìn)一步分析測序毒株，選取諾如病毒的各基因型毒株作為代表毒株進(jìn)行比對，參考株基因序列均來源于Gen-Bank。采用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對，MEGA 7.0.26軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（Neighbor Joining 法），bootstrap 檢驗設(shè)置1000次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究對每份樣品的回收率和PCR擴增效率均進(jìn)行3次平行實驗以確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，若樣品回收率>1%則判定為有效提取，否則不納入數(shù)據(jù)分析；采用EXCEL 2019匯總?cè)康脑假Y料和檢測結(jié)果；應(yīng)用SPSS20.0軟件對諾如病毒檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，每月的平均病毒拷貝數(shù)用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用單因素方差分析對不同季節(jié)的病毒檢出率進(jìn)行比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售牡蠣中諾如病毒檢出情況

檢測結(jié)果顯示（表3和表4），廣州市市售牡蠣中存在諾如病毒污染情況，在2020年6月～2021年5月共計110份的樣品中，實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果陽性樣本數(shù)為58份，全部為諾如病毒GII型，總體陽性率為52.7%。病毒污染含量范圍為1.56×103～1.09×106copies/g（消化腺）。

表3 2020年6月～2021年5月廣州市售牡蠣諾如病毒（GII）檢測情況Table 3 Detection results of norovirus GII in commercial oysters in Guangzhou from June 2020 to May 2021

2.2 市售牡蠣中諾如病毒檢出的季節(jié)分布規(guī)律

如表3所示，在2020年6月～2021年5月期間，病毒檢出陽性率隨季節(jié)變化而變化，冬季陽性率高于其他季節(jié)。如表3所示，在2020年6月～2021年5月期間，春季（3～5月）采集牡蠣樣品30個，其中陽性樣本數(shù)為13；夏季（6～8月）采集牡蠣樣品26個，其中陽性樣本數(shù)為7；秋季（9～11月）采集牡蠣樣品27個，其中陽性樣本數(shù)為17；冬季（12～2月）采集牡蠣樣品27個，其中陽性樣本數(shù)為21；秋季及冬季時檢測到諾如病毒陽性牡蠣樣本數(shù)要高于春季及夏季，所有的陽性樣本中，病毒含量均高于1000 copies/g（消化腺）（圖1）。

從季節(jié)分布來看，春季（3～5月）采集的樣本中諾如病毒平均污染量為2.69×105copies/g（消化腺），夏季（6～8月）采集的樣本中諾如病毒平均污染量為1.97×105copies/g（消化腺），秋季（9～11月）采集的樣本中諾如病毒平均污染量為6.91×104copies/g（消化腺），冬季（12～2月）采集的樣本中諾如病毒平均污染量為4.83×104copies/g（消化腺），不同季節(jié)中檢出的陽性樣本中病毒含量無明顯差異。從不同數(shù)量級病毒中的陽性樣品數(shù)量分布（表5）來看，病毒含量在104～105copies/g之間的樣品最多。

表5 不同數(shù)量級病毒中的陽性樣品數(shù)量分布Table 5 Distribution of positive samples in norovirus of different orders of magnitude

廣東省屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，秋冬季節(jié)溫度較低（平均溫度在20 ℃以下），降雨較少，而春夏季溫度較高，降水較多，對環(huán)境中病毒含量可能會造成一定影響。本文中的結(jié)果在一定程度上反應(yīng)出牡蠣污染病毒的季節(jié)性差異，在下一步持續(xù)工作中，需要提高不同季節(jié)樣本檢測數(shù)量，更加系統(tǒng)的表征季節(jié)對于污染牡蠣的影響。

2.3 市售牡蠣中諾如病毒毒株系統(tǒng)發(fā)育分析

在對市售牡蠣的檢測中，為了確定陽性樣本中的病毒基因型，常利用巢式RT-PCR方法并結(jié)合桑格測序。由于巢式RT-PCR靈敏度相對較低，因此一些陽性樣品無法通過巢式RT-PCR得到病毒序列，在58份陽性樣品中最終得到14份陽性樣本的測序結(jié)果，將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號為OK090974-OK090987。在GenBank上進(jìn)行BLAST比對，構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行基因型鑒定（見圖1）。其中僅一條序列為GII.17基因型，來自12月份的牡蠣樣品，它與2015年美國檢測到的毒株（MT344182）、2016年的巴西檢測到的毒株（MN045198）、2018年在韓國檢測的毒株（MN461158）相似率均超過99%；此外13條序列均為GII.4基因型，分別來自2、3、5月份的牡蠣樣本，它們與2012年廣東省的毒株（MH 469205）、2013年美國檢測到的毒株（KY486271）、2017年澳大利亞檢測的毒株（MK280937）相似率超過90%，與本團(tuán)隊前期研究中檢測到人群中流行的病毒基因型基本一致[9,19]。

圖1 廣州市售牡蠣中諾如病毒序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees for norovirus sequences detected in commercial oysters in Guangzhou

3 討論

近些年世界范圍內(nèi)與食用貝類相關(guān)的諾如病毒胃腸炎疫情層出不窮[25?28]，多數(shù)是因為生食或者食用輕度加熱的貝類所導(dǎo)致。大多數(shù)國家或地區(qū)規(guī)定了貝類組織或貝類養(yǎng)殖水中腸道致病菌的可接受水平，例如在歐盟標(biāo)準(zhǔn)中，對貝類生產(chǎn)區(qū)劃分了A、B、C三個等級，其中規(guī)定A區(qū)中80%以上的產(chǎn)品中大腸桿菌含量必須少于230 個/100 g，B區(qū)中90%以上的產(chǎn)品中大腸桿菌含量少于4600 個/100 g，C區(qū)中全部產(chǎn)品中大腸桿菌含量少于46000 個/100 g[29]，這些標(biāo)準(zhǔn)很好的控制細(xì)菌作為貝類相關(guān)疾病暴發(fā)原因，但未能阻止許多病毒源性疾病的暴發(fā)[30]，因食用貝類而引起的病毒性胃腸炎暴發(fā)的調(diào)查表明，在患者的體內(nèi)或使用過的餐具中檢出了諾如病毒[31?32]。雖然在牡蠣中存在的諾如病毒基因型較豐富，但本研究中主要檢測牡蠣中GII型的諾如病毒，因為大部分患者是以感染GII型諾如病毒為主[33]，廣州地區(qū)市場中的牡蠣普遍存在污染問題，我們通過市售牡蠣監(jiān)測調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)牡蠣中GII型諾如病毒的陽性率達(dá)到了52.7%，病毒含量最高達(dá)到了1.09×106copies/g，最低為1.56×103copies/g，經(jīng)測序確定病毒基因型包括GII.4及GII.17型。由于國內(nèi)消費者更習(xí)慣高溫烹飪而不是直接生食牡蠣，即使病毒檢出率偏高但也不會引起較高的人群感染率，但不能排除在高溫加工后仍有小部分病毒未被滅活，對于免疫力低下的人群如老人及兒童，需要注意此類風(fēng)險。

沿海的國家和地區(qū)因地理和飲食特點等原因經(jīng)常發(fā)生貝類相關(guān)的諾如病毒感染，例如韓國[34]，日本[35]，中國山東[36]，廣東[37]等地都有報道。因此對貝類中諾如病毒的持續(xù)監(jiān)測具有重要意義，很多國家一直在持續(xù)檢測國內(nèi)相關(guān)產(chǎn)品中的諾如病毒污染狀況。意大利的研究人員在2005～2008年間采集的116個雙殼貝類樣本中檢出陽性率10.3%，其中GII.4-2004和GII.b為主要基因型[38]。在意大利的另一個監(jiān)測調(diào)查中，貝類樣本中諾如病毒的檢出率為13.2%（31/235）[39]。荷蘭為期兩年的監(jiān)測中，在牡蠣和貽貝樣本中諾如病毒的檢出率為16.7%（7/42份），包括GII.4等[40]。2017年7月到2018年8月在對中國山東省兩個牡蠣養(yǎng)殖區(qū)為期一年的采樣檢測中，諾如病毒GII基因型陽性率為31.7%（19/60）[41]。越來越多的國家意識到監(jiān)測牡蠣中食源性病毒的重要性，不僅可以控制病毒引發(fā)的疾病風(fēng)險，為貝類產(chǎn)品中病毒凈化方法提供參考標(biāo)準(zhǔn)，還為預(yù)測可能的病毒流行株提供了相關(guān)數(shù)據(jù)。

本研究的樣品主要來自廣東省陽江、茂名、臺山、湛江、順德等地，在采樣時選擇體積大小相近，新鮮有活力的牡蠣樣品，對牡蠣進(jìn)行無菌解剖取其消化腺組織。根據(jù)文獻(xiàn)報道，在大多數(shù)的病毒污染牡蠣的調(diào)查中，檢測的組織是消化腺，因為該組織中病毒含量較其他部位高，相對容易檢出[16]。本研究中市售牡蠣諾如病毒總檢出率為52.7%（58/110），結(jié)果表明廣州市售牡蠣中諾如病毒污染水平較高，檢出率高于北京市（37.5%，21/56）[42]和連云港市（26.67%，48/180）[43]，這可能和樣本前處理方法或結(jié)果判斷條件有關(guān)，本研究使用實驗室前期建立的檢測方法，病毒回收率是ISO/TS 15216-2:2013方法的7倍[20]，對病毒含量偏低的牡蠣樣本有較好的檢測效果。同時，在對同一地區(qū)中牡蠣污染率增加的調(diào)查表明，陽性率的增加（2.7%上升至20.7%）可能與牡蠣產(chǎn)區(qū)的污染增加有關(guān)[44]。

秋冬季檢測的牡蠣中病毒的陽性率普遍比春夏季要高，而病毒含量水平卻沒有較大差異，這一情況與其他研究中的結(jié)果相似[45]。由于冬季環(huán)境溫度有利于諾如病毒持續(xù)在環(huán)境中存在[46]，且冬季是諾如病毒流行的高峰時間段，因此在一定程度上會造成環(huán)境中如污水中病毒含量升高，濾食性雙殼貝類如貽貝、蛤和牡蠣在近?？诘貐^(qū)生長時，會受到污水排放影響而富集水中的諾如病毒[47]，構(gòu)成了人-環(huán)-食傳播路徑。

測序結(jié)果顯示檢測的樣本中大多數(shù)為GII.4型毒株，GII.4型毒株是全球范圍內(nèi)感染人體和在環(huán)境中檢測到的主要毒株，在70.0%～80.0%的急性胃腸炎患者的排泄物中都有檢測出該基因型的諾如病毒，并且GII.4基因型的變異株也陸續(xù)出現(xiàn)[48?49]，另有一株GII.17型，近幾年GⅡ.17型逐漸成為世界范圍內(nèi)的優(yōu)勢流行株，Pu等[50]發(fā)現(xiàn)GII.17型毒株在污水、牡蠣和腸胃炎病例中的同時存在和占主導(dǎo)地位。在對北京市售牡蠣中諾如病毒檢測結(jié)果中同樣檢出該基因型，與人感染的GⅡ.17 毒株相似性高達(dá) 99.2%～100.0%[51]。

諾如病毒感染人體所需的劑量極低（18～2800個拷貝數(shù)）[52]，根據(jù)本文的研究結(jié)果，廣州市售牡蠣中諾如病毒含量達(dá)到1.56×103～1.09×106copies/g（消化腺），因此食用時加工不徹底或者直接生食牡蠣，存在較大的諾如病毒感染風(fēng)險。

4 結(jié)論

貝類是全球重要的經(jīng)濟水產(chǎn)品，同時也是食源性諾如病毒傳播的重要載體。通過對市售牡蠣中諾如病毒污染狀況的監(jiān)測研究，發(fā)現(xiàn)GII型諾如病毒陽性檢出率達(dá)52.7%，且GII.4型為優(yōu)勢基因型，與病毒的臨床流行存在緊密聯(lián)系。因此，直接食用未加工或加工不徹底的市售貝類仍存在較大食品安全風(fēng)險。本研究建議持續(xù)加強貝類中食源性病毒污染的長期監(jiān)測工作，將有助于進(jìn)一步推動我國貝類產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展，保障民眾健康。