超聲輔助低共熔溶劑法提取玉米芯總黃酮工藝優(yōu)化研究

黎 莉，楊景淇，于德涵，曲 男，孫 悅，徐 喆

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化 152061）

玉米芯是玉米脫粒后殘余物，占整個(gè)玉米比重的20%～30%。我國是產(chǎn)玉米大國，每年玉米加工后殘余大約7000萬噸玉米芯。目前，關(guān)于玉米芯應(yīng)用研究的報(bào)道主要集中在以下四個(gè)方面：一是作為工業(yè)原料生產(chǎn)木糖醇、糠醛等物質(zhì)；二是作為培養(yǎng)基料生產(chǎn)食用菌；三是作為飼料；四是經(jīng)過發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等生物燃料[1?4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)階段我國每年對玉米芯的利用量僅為年產(chǎn)量的15%左右[5]，其余絕大多數(shù)都被丟棄或焚燒，不但造成極大浪費(fèi)，還給環(huán)境治理造成很大壓力。

黃酮類化合物是植物細(xì)胞內(nèi)的一類重要次級代謝產(chǎn)物，因其在生物體內(nèi)能清除自由基而表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化、抗衰老功能[6]；另外黃酮類物質(zhì)在降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒等方面也有很好的功效[7?8]；近年來，還有黃酮化合物抗腫瘤方面的應(yīng)用見諸報(bào)道[9]。

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是由Abboot等[10]于2003年提出的一種新型離子液體類似物，它是由一定比例的氫鍵受體和氫鍵供體組成的低共熔混合物，這種混合物多由兩種或者三種組分組成。DES的理化性質(zhì)同離子液體類似，但組成較離子液體簡單，易制備、易保存，且成本更低；和傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，DES不揮發(fā)、安全無毒性，是一種可生物降解的環(huán)境友好型溶劑，生物活性成分在DES中的穩(wěn)定性較有機(jī)溶劑中更高[11]，后續(xù)分離、純化也多采用大孔樹脂吸附，操作簡單、成本低廉。目前，DES已經(jīng)用于如多酚、皂苷、黃酮等多種活性成分的提取[12?14]，而且因其具有的優(yōu)良特性漸有取代有機(jī)試劑、離子液體等常用提取溶劑的趨勢，潛力巨大[15]。

然而，DES雖然在活性物質(zhì)提取方面表現(xiàn)出了良好的研究價(jià)值和前景，但目前DES的應(yīng)用仍處于“試錯”階段，沒有充分的理論依據(jù)和經(jīng)驗(yàn)規(guī)律可以借鑒。因此，本研究以玉米芯總黃酮高效提取為目標(biāo)，篩選出組成和組分比例最優(yōu)的DES作為提取試劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化探索玉米芯總黃酮的最佳提取工藝，旨在為低共熔溶劑在天然產(chǎn)物綠色提取和進(jìn)一步開發(fā)玉米芯資源方面提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米芯 采集于黑龍江省綏化市北林區(qū)，品種為先玉335；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；氯化膽堿、乳酸、葡萄糖、乙二醇、丙三醇、1,3-丁二醇、尿素 皆為國產(chǎn)分析純。

UV-759型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JY92-IIDN型超聲波儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-M6型恒溫水浴鍋 江蘇春蘭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備DES溶液 選擇DES氫鍵受體組分與氫鍵供體組分按照一定的摩爾比，在65～80 ℃的水浴中加熱攪拌至溶液澄明，得到6種DES[16?18]，DES具體組成如表1所示。

表1 不同類型的DESTable 1 Different types of DES

1.2.2 玉米芯總黃酮提取 玉米芯烘干至恒重，粉碎。精確稱量1.0 g玉米芯粉末，加入20 mL DES，于功率120 W、50 ℃條件下超聲提取10 min，提取液過濾，取濾液待測。

1.2.3 DES的篩選 分別用上述不同編號的DES作為提取液，按照1.2.2方法提取玉米芯總黃酮，測定黃酮含量。進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，選擇黃酮提取量較高的DES進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2.4 DES最適摩爾比和含水量篩選 選擇經(jīng)1.2.3篩選出的DES，分別改變該溶劑的組分摩爾比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）和含水量（10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%）后提取玉米芯總黃酮，測定黃酮含量。每組實(shí)驗(yàn)做3組平行。

1.2.5 提取條件單因素實(shí)驗(yàn) 經(jīng)1.2.3和1.2.4篩選綜合考量，選擇最適DES進(jìn)行玉米芯總黃酮的提取。分別改變提取操作中提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）、超聲功率（40、80、120、160、200 W）和超聲提取時(shí)間（5、10、20、30、40 min）等提取條件，各組實(shí)驗(yàn)除變量條件外，其它操作條件同1.2.2。測定各實(shí)驗(yàn)組黃酮含量，以考察提取條件變化對總黃酮提取效果的影響。每組實(shí)驗(yàn)平行操作3次。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以1.2.5中4個(gè)因素為響應(yīng)因素、單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為因素水平的選擇依據(jù)、總黃酮的提取量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)與編碼Table 2 Box-Behnken factor design and coding

1.2.7 總黃酮含量測定 參考文獻(xiàn)[19]方法，使用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定提取液中總黃酮含量。總黃酮提取量計(jì)算公式為：

式中：Y為單位質(zhì)量玉米芯總黃酮提取量，mg/g；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得出的總黃酮質(zhì)量，mg；M為樣品質(zhì)量，g；Df為稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理使用Design expert 8.0.6；單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用SPSS16.0和Microsoft office excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES組成的篩選

使用6種不同組成的DES提取玉米芯總黃酮，各組提取量見圖1。由圖1可知，DES-4和DES-6的總黃酮提取量都明顯高于另外幾種（P<0.05），其中DES-4的黃酮提取量最大，這是因?yàn)镈ES-4的黏度最?。?0 ℃，1.20 mPa·s）、熔點(diǎn)最低（?66 ℃），黏度小有利于目標(biāo)物的擴(kuò)散和提高傳質(zhì)，而熔點(diǎn)越低也越有利于提取過程中介質(zhì)的傳輸[20]，所以DES-4提取效果最為理想。DES-6的提取量略低于DES-4，差異不顯著（P>0.05），但DES-6的黏度高于DES-4，流動性較差，后續(xù)采用大孔樹脂吸附純化時(shí)，可能會導(dǎo)致上樣流速過慢甚至堵柱，容易對分離、純化操作造成不利影響，不過DES黏度會隨著其比例組成、溫度和含水量等因素的變化而改變，故在后續(xù)操作過程中仍有改善的可能[21?22]。因此，選擇DES-4和DES-6兩種溶劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同DES的總黃酮提取量Fig.1 Extraction of total flavonoids from different DES

2.2 DES組分比例的篩選

2.1 實(shí)驗(yàn)中DES-4和DES-6兩種溶劑的總黃酮提取量差異不顯著（P>0.05），故后續(xù)考察該兩種溶劑的組成成分比例對提取量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，DES-4中氯化膽堿/乙二醇的比例由1:1上升至1:3時(shí)，總黃酮的提取量顯著上升（P<0.05）并至最大值，再繼續(xù)增加乙二醇的含量，總黃酮的提取量顯著下降（P<0.05），這是因?yàn)镈ES中氫鍵供體較少時(shí)，隨著其比例的增加，溶液中兩種組分間的作用力增強(qiáng)，溶液中離子與黃酮化合物之間的親和力增強(qiáng)，所以黃酮提取量上升[23]；另外增加氫鍵供體能使DES的表面張力減小、黏度降低，可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移能力[24]；隨著乙二醇比例的繼續(xù)增大，氯化膽堿在溶劑中比例越來越低，使得黃酮類成分和溶劑的相互作用減弱，從而導(dǎo)致提取量又呈下降趨勢[25]。DES-6組成比例的變化對總黃酮提取量的影響趨勢不同于DES-4，氯化膽堿/1,3-丁二醇比例由1:1升至1:2時(shí)，總黃酮的提取量變化不顯著（P>0.05）；隨著試劑中1,3丁二醇的含量增加，黃酮的提取量又隨之下降，下降幅度也不顯著（P>0.05）。

圖2 DES（氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/1,3-丁二醇）的組成比例對總黃酮提取量的影響Fig.2 Extraction of total flavonoids using the DES (choline chloride/ethylene glycol andcholine chloride/1,3-butyleneglycol)with different ratios

2.3 DES的含水量的影響

DES的含水量影響DES的黏度和極性，對目標(biāo)產(chǎn)物的提取量有很大影響，因此需要對其進(jìn)行含水量考察，實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇氯化膽堿/乙二醇為1:3，氯化膽堿/1,3-丁二醇為1:2，結(jié)果見圖3。

圖3 DES（氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/1,3-丁二醇）的含水量對總黃酮提取量的影響Fig.3 Extraction of total flavonoids using DES (choline chloride/ethylene glycol and choline chloride/1,3-butyleneglycol) with different water content

由圖3可知，DES-4和DES-6兩種溶劑的含水量由10%遞增至40%時(shí)，總黃酮的提取量都有顯著的變化（P<0.05），皆呈先上升后下降的趨勢，而且都是在含水量為30%時(shí)，總黃酮的提取量達(dá)到最大值，其中DES-4的最高提取量顯著高于DES-6（P<0.05）。含水量會影響DES的極性，當(dāng)提取試劑與玉米芯黃酮有相似的極性時(shí)，提取效果更為理想[26]。另外，在含水量較低時(shí)，DES黏性較大，隨著溶劑中含水量的增加，黏性改善使得總黃酮的提取量提升顯著；含水量過高，溶液中的水分子會破壞氫鍵受體和供體之間形成的超分子化合物，并且使溶劑的極性偏離合適范圍[27]，從而導(dǎo)致總黃酮的提取量降低。從結(jié)果來看，含水30%的氯化膽堿/乙二醇組合提取玉米芯總黃酮量最高。

綜合篩選結(jié)果，選擇含水量為30%、氯化膽堿/乙二醇為1:3的DES作為玉米芯總黃酮的提取試劑。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用上述最優(yōu)配比的DES，分別考察提取溫度、液料比、超聲功率和提取時(shí)間對玉米芯總黃酮提取量的影響。

2.4.1 提取溫度對提取量的影響 溫度會影響DES的黏度，從而影響分子的移動和擴(kuò)散速度，更會改變DES中氫鍵受體和供體之間的相互作用，對提取量造成影響。如圖4所示，溫度對玉米芯總黃酮的提取影響顯著。提取溫度不高于60 ℃時(shí)，此時(shí)溫度相對較低，隨著溫度的上升，DES的黏度和表面張力都變小，黃酮在溶液中的傳輸能力上升，故提取量上升；當(dāng)溫度超過60 ℃后，分子運(yùn)動速度過快，溶液中氫鍵供體和受體兩種成分間氫鍵穩(wěn)定性降低[28]，導(dǎo)致目的物溶出能力下降。另外，溫度升高會導(dǎo)致DES極性降低，高溫時(shí)DES極性與玉米芯總黃酮極性差異過大也是導(dǎo)致提取量下降的原因[29]。綜上，60 ℃時(shí)黃酮的提取量最高，為3.967 mg/g。

圖4 提取溫度對提取量的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction amount

2.4.2 液料比對提取量的影響 考察液料比各變量對玉米芯總黃酮提取量的影響，以確定響應(yīng)面試驗(yàn)液料比的優(yōu)化范圍，結(jié)果見圖5。液料比值較小時(shí)，目的物的提取量隨著該值的上升顯著提高，在液料比達(dá)到20:1 mL/g時(shí)，提取量達(dá)到最高值，之后再增加試劑用量，提取量下降。這是因?yàn)樘崛≡噭┯昧可贂r(shí)，目的成分傳質(zhì)不充分，其在固相中殘留率高[30]；而提取試劑過多時(shí)，大量的提取試劑會吸收一部分超聲輻射，從而減少輻射能量對材料的作用而妨礙有效成分的溶出[31]。另外，雜質(zhì)的溶出也會導(dǎo)致目的物的溶解度降低。故最理想的液料比為20:1 mL/g，此時(shí)黃酮提取量達(dá)到3.675 mg/g。

圖5 液料比對提取量的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on extraction amount

2.4.3 超聲功率對提取量的影響 空化效應(yīng)是超聲提取時(shí)促使目的物溶出的主要因素，超聲功率會影響空化效應(yīng)的強(qiáng)度。結(jié)果見圖6。超聲功率改變對總黃酮提取量的變化影響顯著。超聲功率較低時(shí)，空化效應(yīng)不強(qiáng)，對細(xì)胞壁的破壞能力弱，黃酮溶出速度慢、溶出量?。怀暪β试黾訒r(shí)，空化效應(yīng)加強(qiáng)，細(xì)胞壁破碎加劇，分子的運(yùn)動速度增加，擴(kuò)散加快[32?33]。所以，目的物的提取量會隨著超聲功率的增強(qiáng)而增加，超聲功率達(dá)到120 W時(shí)，提取量最高，再繼續(xù)增加超聲強(qiáng)度，提取溶液會發(fā)生“飽和效應(yīng)”，大功率的超聲作用下會導(dǎo)致有效成分結(jié)構(gòu)和DES超分子結(jié)構(gòu)的破壞[34]，使提取量下降；另外，大功率下雜質(zhì)的大量溶出也會導(dǎo)致目的物的溶出受阻，降低提取量。因此，最優(yōu)超聲提取功率為120 W，該功率條件下黃酮的提取量為3.158 mg/g。

2.4.4 提取時(shí)間對提取量的影響 提取時(shí)間的長短會決定目的物質(zhì)能否充分溶出，其對提取量的影響見圖7。通過圖7可以看出，提取時(shí)間短時(shí)，目的物溶出量小；提取時(shí)間從5 min提高到20 min時(shí)，提取量不斷上升且前期升幅顯著；提取時(shí)間超過20 min后，提取量會有明顯下降。這是因?yàn)榭栈?yīng)不僅受超聲功率的影響，隨著超聲時(shí)間的延長和能量的積累，空化效應(yīng)也會增強(qiáng)，從而破壞細(xì)胞壁，使目的物溶出量加大，在提取時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，大多數(shù)目的物溶出，繼續(xù)延長超聲時(shí)間提取量不會明顯變化，甚至可能會有大量雜質(zhì)溶出導(dǎo)致目的物溶出受限；另外，更長時(shí)間的超聲輻射和熱效應(yīng)的積累還容易導(dǎo)致產(chǎn)物“雙重降解”[35?36]。綜上所述，提取時(shí)間選擇20 min最為理想，此時(shí)黃酮的提取量為3.907 mg/g。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化分析

2.5.1 回歸模型建立與顯著性檢驗(yàn) 按照Box-Behnken試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了包含16個(gè)析因點(diǎn)、5個(gè)中心點(diǎn)和8個(gè)軸點(diǎn)在內(nèi)的總計(jì)29組實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of experiment

對上表數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，4因素回歸方程式如下：

其顯著性檢查與方差分析見表4。

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis for regression equation

從方差分析表可知，該回歸模型P<0.01，表明其可靠程度高、結(jié)果有效。R2=0.9853、校正系數(shù)R2Adj=0.9706、失擬項(xiàng)P=0.9995>0.05不顯著，表明模型擬合度高，即擬合值與實(shí)際結(jié)果高度相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。模型的C.V.值0.92%、信噪比為26.24，表明模型的實(shí)驗(yàn)精度高、可靠性好，模型能真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在所有考察因素中，提取溫度、液料比和超聲功率對提取量影響顯著；其中，對玉米芯總黃酮的提取量影響最大的是A（提取溫度），其次為C（超聲功率）和B（液料比），影響最小的是D（提取時(shí)間）。

2.5.2 數(shù)學(xué)模型及響應(yīng)面分析 根據(jù)所得到的模型對提取溫度（A）、液料比（B）、超聲功率（C）和提取時(shí)間（D）的交互作用進(jìn)行分析。響應(yīng)曲面和等高線的陡峭和平緩程度與上述各因素之間相互作用的強(qiáng)弱是正相關(guān)的。各參數(shù)交互作用的響應(yīng)曲面見圖8。

由圖8可知，在A、B、C、D四個(gè)因素中任意兩個(gè)因素的交互作用時(shí)，其中一個(gè)因素條件不變時(shí)，總黃酮的提取量都是隨著另一因素的增加先提高后降低的，影響玉米芯中的總黃酮提取量的各交互作用因素順序?yàn)锳D>AB>BD>BC>CD>AC。

圖8 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of interaction of various factors

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，經(jīng)過Design Expert 8.0優(yōu)化后的最佳提取工藝為：提取溫度61.18 ℃、液料比為20.40:1 mL/g、超聲功率137.30 W、超聲提取時(shí)間19.34 min，理論預(yù)計(jì)提取量4.21 mg/g。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，考慮實(shí)際條件，將操作工藝參數(shù)調(diào)整為提取溫度61 ℃、液料比20:1 mL/g、超聲功率137 W、提取時(shí)間19.5 min，作5組平行實(shí)驗(yàn)。上述條件下玉米芯總黃酮提取量的實(shí)際值為4.180 mg/g，與軟件模擬預(yù)測值誤差為0.71%，實(shí)際與模型優(yōu)化符合良好，證實(shí)了模型的有效性。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助低共熔溶劑提取玉米芯中總黃酮。經(jīng)過對多種組成、配比和含水量的DES的篩選，最終選擇含水量30%、氯化膽堿/乙二醇比例為1:3的溶劑作為實(shí)驗(yàn)提取試劑。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立數(shù)字模型方程，得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取溫度61 ℃、液料比20:1 mL/g、超聲功率137 W、提取時(shí)間19.5 min，此條件下總黃酮的提取量為4.180 mg/g，與模型的預(yù)測值相近，本實(shí)驗(yàn)得到的玉米芯總黃酮提取量分別比常麗新等[37]和劉曉飛等[38]報(bào)道的玉米芯黃酮提取量高45%和31%。與傳統(tǒng)溶劑提取方法相比，DES提取法成本低、安全性好、對環(huán)境友好，輔以超聲可對目的成分高效浸出，所需溶劑少，可重復(fù)利用，是一種快速、高效提取黃酮類物質(zhì)的理想方法。