大孔吸附樹脂分離純化海蜇ACE抑制肽的工藝研究

崔婷婷，賈愛榮, ，張綿松，劉 雪，白義化，苗佳琳，劉昌衡

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南 250103；2.中澳特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250103；3.威海市宇王集團(tuán)有限公司，山東威海 264500）

高血壓作為最常見的心血管疾病，已成為威脅人類健康的一大殺手。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析可知，近年來全球高血壓的平均發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到了10%～20%，我國(guó)高血壓患病人口也已超過了1.2億，并且處于持續(xù)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1?2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-I-converting enzyme，ACE）作為生物體內(nèi)一類重要的血壓調(diào)節(jié)酶，其由單一肽鏈組成且含有大量的低聚糖，能夠被Zn2+和Cl－激活且底物特異性較寬[3]。在ACE的作用下，血管緊張素I會(huì)生成具有強(qiáng)烈血管收縮作用的血管緊張素II，后者可作用于小動(dòng)脈從而引起血管平滑肌收縮，導(dǎo)致血壓迅速升高；與此同時(shí)，其還能夠促進(jìn)醛固酮的分泌，增強(qiáng)腎臟對(duì)Na+和水的重吸收，使血壓升高[4?5]。

海蜇（Rhopilema esculentum），根口水母科海蜇屬動(dòng)物，其口感美味且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。研究證實(shí)[6?7]，海蜇具有舒張血管、降血壓以及消炎等功效，深受國(guó)內(nèi)外廣大消費(fèi)者的青睞。從海蜇中提取的海蜇ACE抑制肽是經(jīng)蛋白酶處理后得到的具有ACE抑制活性的肽，它們對(duì)ACE活性區(qū)域的親和力大于血管緊張素I和緩激肽對(duì)ACE的親和力，ACE抑制肽與活性區(qū)域相互結(jié)合可有效的抑制ACE的活性，降低血管緊張素II的生成水平，起到降血壓的功效[8]。

為了進(jìn)一步篩選并富集海蜇ACE抑制肽的有效組分，增強(qiáng)降血壓療效，因此有必要對(duì)海蜇酶解液進(jìn)行純化處理。文獻(xiàn)研究表明[9?11]，大孔吸附樹脂在分離純化多肽、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)時(shí)具有良好的選擇性，且試驗(yàn)條件溫和、操作方便、成本較低，近年來被廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)的生產(chǎn)中。目前ACE抑制肽主要通過酶解法制備，除了選擇具有較高特異性的酶之外，對(duì)酶解產(chǎn)物的分離純化也是非常重要的。一般的，海蜇酶解產(chǎn)物成分是比較復(fù)雜的，要想得到純度相對(duì)較高的ACE抑制肽則需要通過純化技術(shù)來富集具有較高ACE抑制活性的肽段[12]。HP20SS型大孔吸附樹脂是將具有良好吸附特性的HP20小粒徑化的產(chǎn)品，其粒徑為63～150 μm，可以實(shí)現(xiàn)高純度精密分離；SP20SS型大孔吸附樹脂是一種粒度小且分布窄的產(chǎn)品；SP207是在芳香族系的骨架上結(jié)合了溴，從而強(qiáng)化了疏水吸附力。本研究采用復(fù)合蛋白酶酶解海蜇，首先通過分子量（MW）為3000 Da的濾膜超濾，富集MW<3000 Da的酶解液，然后以ACE抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比分析HP20SS、SP20SS和SP207三種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂對(duì)海蜇ACE抑制肽的純化效果，為綜合開發(fā)利用海蜇資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三礬海蜇 購自海鮮市場(chǎng)；復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、硼酸、乙腈、乙酸和乙醇 均為分析純，上海源葉生物科技有限公司；ACE抑制肽標(biāo)準(zhǔn)品 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；馬脲酰組氨酰亮氨酸（Hippuryl-His-Leu，HHL） 上海瀚鴻科技股份有限公司；HP20SS、SP20SS、SP207型大孔吸附樹脂 北京綠百草科技發(fā)展有限公司。

JJ-1A型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀、RF-20A紫外檢測(cè)器、Apollo 5u色譜柱（250 mm×4.6 mm） 日本島津公司；BS-100A自動(dòng)部分收集器 上海滬西分儀器廠有限公司；AB204-N電子分析天平 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海蜇ACE抑制肽酶解液的制備 將三礬海蜇用清水沖洗去除鹽和其他雜質(zhì)，測(cè)定浸泡后海蜇的清水電導(dǎo)率，直至與自來水的電導(dǎo)率一致時(shí)停止沖洗。將浸泡后的海蜇研磨成勻漿，取10 g海蜇勻漿樣品置于30 mL的蒸餾水中，用氫氧化鈉（0.1 mol/L）或鹽酸（0.1 mol/L）溶液調(diào)節(jié)pH至7.6，加入復(fù)合蛋白酶（酶與底物比例為2.8%）于58 ℃的溫度下酶解3.9 h，同時(shí)伴隨磁力攪拌[13]。待酶解結(jié)束后，將酶解液置于沸水中水浴10 min，滅活復(fù)合蛋白酶，然后冷卻至室溫，于4000 r/min條件下離心處理15 min。將離心后的樣品采用分子量為3000 Da的濾膜超濾，分別收集MW>3000 Da和MW<3000 Da的濾過部分，測(cè)定ACE抑制率，取抑制率相對(duì)較高（MW<3000 Da）的部分進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ACE抑制率的測(cè)定 設(shè)置樣品組和空白對(duì)照組，分別取1.5 mL的離心管，向空白對(duì)照組中加入100 μL濃度為5 mmol/L的HHL，加入硼酸緩沖液（pH8.3）補(bǔ)足至120 μL，置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫5 min，然后加入5 μL濃度為0.1 U/mL的ACE抑制肽標(biāo)準(zhǔn)品開始反應(yīng)；樣品組則加入100 μL濃度為5 mmol/L的HHL和20 μL的酶解液，置于37 ℃的恒溫水浴中保溫5 min，然后加入5 μL濃度為0.1 U/mL的ACE抑制肽標(biāo)準(zhǔn)品開始反應(yīng)[14]。

上述操作完成后將兩組均置于37 ℃的恒溫水浴鍋中保溫處理30 min后，加入200 μL濃度為1 mol/L的鹽酸中止反應(yīng)，補(bǔ)加175 μL的硼酸緩沖液。

待反應(yīng)結(jié)束后，采用高效液相色譜儀測(cè)定對(duì)照組和樣品組樣品的峰面積，檢測(cè)條件如下：色譜柱為Apollo 5u C18（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相為乙腈:0.5%乙酸=35:65；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

ACE抑制率的計(jì)算公式如下：

1.2.3 ACE抑制肽分子量的測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定ACE抑制肽分子量，液相色譜檢測(cè)條件同1.2.2。分別選用Gly-Gly-Gly（MW=189.17 Da）、氧化型谷胱甘肽（MW=612.63 Da）、維生素B12（MW=1355.37 Da）和抑肽酶（MW=6511.51 Da）4種標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣前經(jīng)過0.45 μm的濾膜過濾備用，通過高效液相色譜分析上述4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，以出峰時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量為縱坐標(biāo)繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ACE抑制肽的分子量。

1.2.4 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 以0.5 BV的95%的乙醇分別浸泡HP20SS、SP20SS和SP207型大孔吸附樹脂24 h，用2.0 BV的乙醇以1.0 BV/h的流速通過樹脂，并浸泡3 h；用乙醇以1.0 BV/h的流速洗滌樹脂直至流出液加水不呈現(xiàn)白色渾濁為止；再用蒸餾水以同樣的流速洗凈直至流出液無乙醇味道，樹脂層面上保持2～5 mm的液體，以免干柱，備用。三種大孔吸附樹脂的物理參數(shù)見表1。

1.2.5 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸性能考察 分別稱取2.0 g處理好的HP20SS、SP20SS和SP207型大孔吸附樹脂，用濾紙吸干表面水份，裝入100 mL具塞磨口三角瓶中，通過移液管量取已知濃度的海蜇ACE抑制肽酶解液30 mL，于轉(zhuǎn)速為110 r/min恒溫振蕩器中振蕩24 h后過濾，分別收集濾出的液體1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑顯色，避光反應(yīng)30 min后測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算樹脂的靜態(tài)吸附率；將吸附飽和的樹脂用適量蒸餾水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留液體，加入30 mL濃度為70%的乙醇，以150 r/min恒溫振蕩12 h解吸，用濾紙過濾，測(cè)定ACE抑制肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算解吸率。吸附率和解吸率計(jì)算公式如下：

式中：C0表示吸附前溶液中ACE抑制肽的濃度，mg/g；C1表示吸附后溶液中ACE抑制肽的濃度，mg/g；C2表示解吸后溶液中ACE抑制肽的濃度，mg/g；V0表示吸附溶液的體積，mL；V1表示解吸液的體積，mL；W表示樹脂的干重，g。

1.2.6 大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸性能考察

1.2.6.1 酶解液上柱濃度對(duì)ACE抑制肽吸附效果的影響 取預(yù)處理好的HP20SS型大孔吸附樹脂20 g，濕法裝入層析柱（1.60×20 cm）中；分別取濃度為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽酶解液各50 mL，以2.0 BV/h的流速上柱，室溫下吸附3 h，檢測(cè)流出液的ACE抑制率。

1.2.6.2 酶解液上樣流速對(duì)ACE抑制肽吸附效果的影響 取預(yù)處理好的HP20SS型大孔吸附樹脂20 g，濕法裝入層析柱（1.60×20 cm）中；分別取濃度為10.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽酶解液50 mL，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h的流速上柱，室溫下吸附3 h，收集流出液，檢測(cè)并計(jì)算ACE抑制率。

1.2.6.3 洗脫劑濃度對(duì)ACE抑制肽解吸效果的影響 取預(yù)處理好的HP20SS型大孔吸附樹脂20 g，濕法裝入層析柱（1.60×20 cm）中；分別取濃度為10.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽酶解液50 mL，按照最佳吸附方案完成吸附。待吸附完成后，分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇各60 mL，以1.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，檢測(cè)并計(jì)算ACE抑制率。

1.2.6.4 洗脫劑流速對(duì)ACE抑制肽解吸效果的影響 取預(yù)處理好的HP20SS型大孔吸附樹脂20 g，濕法裝入層析柱（1.60×20 cm）中；分別取濃度為10.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽酶解液50 mL，按照最佳吸附方案完成吸附。待吸附完成后，用60 mL濃度為70%的乙醇，分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的流速洗脫。收集洗脫液，檢測(cè)并計(jì)算ACE抑制率。

1.2.7 樣品平均回收率的計(jì)算 計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次取平均值，采用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，3種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附-解吸附性能結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，3種樹脂中僅有HP20SS的吸附率大于60%，且解吸附率達(dá)到了89.51%。由于HP20SS型大孔吸附樹脂解吸率最高，因此表現(xiàn)出最佳的綜合性能。這是因?yàn)镠P20SS大孔吸附樹脂是一種比表面積大、平均孔徑小的非極性樹脂，其對(duì)多肽的吸附作用力主要是疏水性相互作用，雖然SP207型大孔吸附樹脂的孔徑小于HP20SS型大孔吸附樹脂，但較小的孔徑對(duì)大分子存在分子排阻效應(yīng)。因此，選擇HP20SS型大孔吸附樹脂分離純化海蜇ACE抑制肽。此外，樹脂的吸附能力還與其孔徑、比表面積、孔容等物理結(jié)構(gòu)參數(shù)有關(guān)[15]。對(duì)于孔徑較大的樹脂有利于吸附，且吸附率較高，但在某些情況下，吸附作用力強(qiáng)，對(duì)解吸會(huì)造成一定的困難，因此，有些樹脂雖然吸附率較高，但由于解吸率太低，故不適用于分離純化目的產(chǎn)物。

表1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附與解吸附結(jié)果比較Table 1 Comparsion of static adsorption and desorption capacity of different hydrophobic resin

2.2 HP20SS大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附曲線

從圖1可知，HP20SS大孔吸附樹脂對(duì)海蜇ACE抑制肽上柱液的吸附為快速平衡型，起始階段的海蜇ACE抑制肽上柱液吸附率較低，在3 h后基本達(dá)到平衡，HP20SS大孔吸附樹脂對(duì)海蜇ACE抑制肽上柱液具有良好的吸附動(dòng)力學(xué)特性，適用于海蜇ACE抑制肽的分離純化。

圖1 HP20SS大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static absorption curve of HP20SS hydrophobic resin

2.3 HP20SS大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解吸附性能考察

由圖2A可知，當(dāng)上樣濃度為50和5.0 mg/mL時(shí)，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)在40 mL左右，不利于疏水樹脂對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的吸附，容易達(dá)到飽和吸附。而當(dāng)上樣濃度為1.0、10.0、100.0 mg/mL時(shí)，泄漏點(diǎn)均出現(xiàn)在70 mL左右，且上樣濃度為10.0 mg/mL時(shí)，ACE抑制率達(dá)58.76%，大于1.0 mg/mL的47.43%和100.0 mg/mL的39.98%。因此，本實(shí)驗(yàn)選取最佳上樣濃度為10.0 mg/mL。在大孔樹脂的吸附過程中，上柱液濃度對(duì)吸附效果的影響也較為顯著，這是因?yàn)楹ｒ孛附猱a(chǎn)物中還含有糖類、鋅、鎂、鈣等金屬元素以及海蜇毒素等，當(dāng)上樣濃度過高時(shí)，所含雜質(zhì)過多，雜質(zhì)會(huì)與ACE抑制肽競(jìng)爭(zhēng)吸附活性位點(diǎn)，也會(huì)造成層析柱濾膜的堵塞，從而影響吸附效果[16]；而上樣濃度過低則會(huì)導(dǎo)致吸附不充分，造成樣品浪費(fèi)[17]。當(dāng)上柱液濃度為10.0 mg/mL時(shí)，多肽與樹脂接觸越充分，單位表面積內(nèi)與大孔樹脂接觸的ACE抑制肽的含量較大，吸附量也就越大。

由圖2B可知，流量為0.5和1.5 BV/h，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)在50 mL左右；當(dāng)流量為2.0 BV/h時(shí)，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)在80 mL左右，且ACE抑制率達(dá)到了79.65%，因此，本實(shí)驗(yàn)選取最佳上樣流量為2.0 BV/h。一般的，上樣液流速越慢，化學(xué)成分才能更有效地?cái)U(kuò)散到樹脂內(nèi)部和表面，HP20SS樹脂表面存在具有較強(qiáng)疏水性能的基團(tuán)，這些基團(tuán)對(duì)疏水性較大的海蜇ACE抑制肽具有較強(qiáng)的親和吸附作用[18?20]。過快的流速顯然不利于HP20SS樹脂與被吸附成分的充分接觸而導(dǎo)致泄露增加，產(chǎn)率顯著下降[21]。在實(shí)際生產(chǎn)操作中，需要盡量縮短吸附時(shí)間才能兼顧到生產(chǎn)效率。

由圖2C可知，50%的乙醇洗脫液的海蜇ACE抑制率過低，僅有70.14%；80%的乙醇洗脫時(shí)泄漏點(diǎn)出現(xiàn)在40 mL左右；60%和90%的乙醇洗脫劑用量達(dá)80 mL左右時(shí)ACE抑制率僅僅達(dá)到80%左右。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，溶解性能不同，洗脫的物質(zhì)基礎(chǔ)也有所差異，因而對(duì)洗脫產(chǎn)物的ACE抑制率也會(huì)存在一定的影響，故確定濃度為70%的乙醇溶液為動(dòng)態(tài)洗脫的最佳濃度。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)不同，極性大小也不同，ACE抑制肽和大孔吸附樹脂之間存在一定的范德華力，兩物質(zhì)的極性越相似則范德華力越大[22?23]。乙醇的體積分?jǐn)?shù)越大，極性越小，樹脂中大量的醇溶性雜質(zhì)就會(huì)越多[24?25]，從而使ACE抑制肽的純度下降，而70%的乙醇可能與ACE抑制肽的極性相似，洗脫效果較好。

由圖2D可知，當(dāng)固定洗脫劑的用量時(shí)，洗脫時(shí)流速越小，與樹脂接觸時(shí)間較長(zhǎng)，洗脫效果越好，可見洗脫劑流速低有利于海蜇ACE抑制肽的解吸，故選擇洗脫劑的流速為1.0 mL/min。另外，隨著洗脫液流速加快，洗脫帶變窄，拖尾現(xiàn)象不明顯，洗脫效果較好，洗脫液體積相對(duì)減少；流速過慢，洗脫時(shí)間增加，洗脫液的體積也相應(yīng)地增加[20,26]。

圖2 HP20SS大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解吸附曲線Fig.2 Dynamic adsorption and desorption curves of HP20SS macroporous adsorption resin

2.4 純化前后海蜇ACE抑制肽的ACE抑制活性對(duì)比分析

以卡托普利作為陽性對(duì)照[27]，對(duì)比分析了純化前后海蜇ACE抑制肽的IC50值和ACE抑制率。由表2可知，純化前海蜇ACE抑制肽的ACE抑制率顯著小于純化后海蜇ACE抑制肽的ACE抑制率（P<0.05），純化后海蜇ACE抑制肽的IC50值為1.02 mg/mL，表明HP20SS分離純化ACE抑制肽的效果較好。并且，海蜇ACE的活性與多肽的極性有關(guān)，疏水性氨基酸含量越高，其ACE抑制活性也就越高[28?29]。

表2 純化前后海蜇ACE抑制肽的IC50值和ACE抑制率對(duì)比分析Table 2 IC50 value and ACE inhibition ratio of the upper column solution and the purified sample

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照最佳條件操作，即取質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽上柱液，以2.0 BV/h上樣，靜置吸附3 h，用濃度為70%的乙醇按照1.0 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液，測(cè)定其ACE抑制率為92.18%，所得色譜圖見圖3。同時(shí)完成3次平行試驗(yàn)。富集后的ACE抑制肽分子量為2.65×103Da，純度為89.16%，樣品的平均回收率為94.76%，RSD為0.63%，表明HP20SS大孔吸附樹脂對(duì)海蜇ACE抑制肽有較好的分離純化效果，該工藝合理可行且重現(xiàn)性好。

圖3 對(duì)照品和海蜇ACE抑制肽上柱液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC of reference substance and ACE inhibitory peptide from jellyfish

3 結(jié)論

HP20SS型大孔吸附樹脂對(duì)海蜇ACE抑制肽具有良好的富集作用和解吸效果。HP20SS型大孔吸附樹脂純化海蜇ACE抑制肽最佳動(dòng)態(tài)吸附和解吸條件為：海蜇酶解液的濃度為10.0 mg/mL、上樣流速為2.0 BV/h、靜置吸附3 h、洗脫劑為70%的乙醇溶液、洗脫劑流速為1.0 mL/min。高效液相色譜結(jié)果表明，純化后海蜇ACE抑制肽的抑制率達(dá)到了92.18%，顯著高于純化前的69.21%（P<0.05），且IC50值為1.02 mg/mL。該研究結(jié)果為今后探究純化后ACE抑制肽結(jié)構(gòu)變化奠定了研究基礎(chǔ)，也為海蜇ACE抑制肽作為原料開發(fā)保健食品與藥品提供了科學(xué)依據(jù)。