蘋果梨果皮的7種酚類物質(zhì)對(duì)鏈格孢的離體抑制作用

張婷婷，王調(diào)蘭，李永才

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

鏈格孢（Alternaria alternata）是一種可以引起多數(shù)水果發(fā)生采后病害的真菌病原物，可對(duì)棗[1]、蘋果[2]、柑橘[3]、藍(lán)莓[4]以及蘋果梨[5]等造成嚴(yán)重的病害。由該病原菌引起的黑斑病是蘋果梨主要的采后病害。黑斑病不僅造成蘋果梨的品質(zhì)劣變，而且在果實(shí)體內(nèi)產(chǎn)生的鏈格孢毒素對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅，制約著蘋果梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，合成殺真菌劑被廣泛應(yīng)用于控制果實(shí)采后病害的發(fā)生[6]，其效果雖然較好，但由于廣泛應(yīng)用導(dǎo)致了病原菌耐藥性顯著增加，且對(duì)人類及環(huán)境造成危害[7]。因此研究開發(fā)控制果蔬采后病害的天然防腐劑已勢(shì)在必行。

酚類物質(zhì)作為植物天然次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗氧化、清除自由基、抵御生物和非生物脅迫作用。已有研究表明酚類物質(zhì)可通過限制病原體生長、增加植物抗性的化學(xué)屏障等抵御病原物的侵染[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)蘋果、柑橘、山楂和櫻桃中提取的酚類物質(zhì)可以有效清除果實(shí)體內(nèi)的自由基[9]。同時(shí)果皮中的酚類物質(zhì)對(duì)病原菌的侵染也具有一定的影響，如在未成熟蘋果中的綠原酸，桃果皮和晚熟甜櫻桃中的酚酸能有效抑制盤長孢（Gloeosporium perennans），桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）和A. alternata侵入寄主[10?11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)中的酚類物質(zhì)還可以通過損傷病原物的細(xì)胞膜進(jìn)而延緩其致病性，如對(duì)香豆酸甲酯（乙酯）和水楊酸可以對(duì)A. alternata[12?13]和擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）[14]的質(zhì)膜造成損傷從而促進(jìn)內(nèi)溶物的泄露，降低其對(duì)果實(shí)的致病性。另外酚類物質(zhì)影響A. alternata色素和毒素的產(chǎn)生[10]。但由于果皮酚類物質(zhì)種類、含量及存在狀態(tài)具有較大差異，因此其調(diào)控機(jī)理也呈現(xiàn)復(fù)雜性[15]。雖然已有部分研究報(bào)道了酚類物質(zhì)對(duì)病原真菌的調(diào)控作用，但蘋果梨果皮中的酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata生長以及致病性的調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道，因此在我們前期發(fā)現(xiàn)的蘋果梨果皮中主要7種酚類物質(zhì)的基礎(chǔ)上[16]，本文進(jìn)一步研究評(píng)價(jià)了蘋果梨果皮的7種酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata的生長以及黑色素產(chǎn)生的影響，以期為揭示酚類物質(zhì)調(diào)控該病原物的致病機(jī)理提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鏈格孢（Alternaria alternata） 分離于貯藏中自然發(fā)病的蘋果梨果實(shí)，純化后PDA培養(yǎng)基保存待用；酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、兒茶素、表兒茶素、熊果苷） 上海源葉生物科技有限公司；黑色素標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；瓊脂、Tween-80 柯意哲（上海）機(jī)電工程有限公司；75%酒精 山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原物分離、純化與孢子懸浮液的配制 將有黑斑病的蘋果梨果實(shí)，以75%酒精進(jìn)行果實(shí)表面消毒，再用無菌水沖洗后切取病健交界處的組織，在無菌操作條件下移至馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基上，然后于28 ℃恒溫培養(yǎng)，待其長出分生孢子之后再進(jìn)行分離、純化，并通過回接試驗(yàn)確定其致病性。分離純化的病原物在馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆肹16]。

取PDA上培養(yǎng)5 d的A. alternata菌種，加入含有0.05%的Tween-80的適量無菌水，用無菌涂布器輕輕刮涂平板上的病原菌孢子，然后用4層已滅菌的紗布進(jìn)行過濾，將過濾后的孢子懸浮液轉(zhuǎn)移到無菌三角瓶中，并立即封口。隨后將配制好的孢子懸浮液在漩渦振蕩器上振蕩20 s使孢子分散均勻，并用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，添加無菌水進(jìn)行稀釋，使其達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需不同濃度。最后將配制好的A. alternata孢子懸浮液在6000 ×g條件下離心10 min，并棄去上清液，沉淀用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 蘋果梨果皮的酚類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata生長的影響

1.2.2.1 外源酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)的影響 無菌條件下，用打孔器取直徑為9 mm的2%的水瓊脂培養(yǎng)基，然后將其置于已滅菌的載玻片上，在1.2.1中得到的孢子懸浮液（1×106個(gè)/mL）的沉淀中分別加入等量的綠原酸（1、2、4 mg/mL）、咖啡酸（0.2、0.4、0.6 mg/mL）、阿魏酸（0.5、1、2 mg/mL ）、對(duì)香豆酸（0.3、0.6、1.2 mg/mL）、兒茶素（0.5、1、2 mg/mL）、表兒茶素（0.2、0.4、0.8 mg/mL）以及熊果苷（7.5、15、30 mg/mL）溶液，混合均勻后，分別在水瓊脂培養(yǎng)基上用移液槍滴加20 μL的混合溶液，此濃度來源于前期實(shí)驗(yàn)研究得到的基于蘋果梨果皮的7種酚類物質(zhì)含量[16]。置于28 ℃下培養(yǎng)，分別在萌發(fā)2、4、6、8 h時(shí)鏡檢觀察A. alternata萌發(fā)率，直至對(duì)照完全萌發(fā)。以無菌水處理作為對(duì)照。每次鏡檢100個(gè)孢子，重復(fù)3次。

1.2.2.2 外源酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata菌絲生長的影響 分別將不同濃度的上述酚類物質(zhì)溶液加入無菌的PDA培養(yǎng)基中，混合均勻，倒入無菌的培養(yǎng)皿中，分別接種28 ℃培養(yǎng)7 d的直徑為8 mm的A.alternata菌餅，然后于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d，每天測量菌落直徑。以無菌水作為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)平行，重復(fù)3次。

1.2.2.3 外源酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata菌絲生物量的影響 上述酚類物質(zhì)溶液加入無菌的PDA培養(yǎng)基中，混合均勻，倒入無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固后在培養(yǎng)基表面鋪上無菌的玻璃紙，分別接種28 ℃培養(yǎng)7 d的直徑為8 mm的A. alternata菌餅，然后于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后取下玻璃紙，稱重。以無菌水作為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)平行，重復(fù)3次。

1.2.3 外源酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata黑色素的影響

1.2.3.1 黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別配制濃度為0、10、20、30、40、50 mg/L的黑色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在400 nm處測定吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

伊匹單抗是一種抑制CTLA-4的完全人源化IgG1單克隆抗體[47]，F(xiàn)DA 最終于2011年批準(zhǔn)伊匹單抗用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。伊匹單抗治療過程中出現(xiàn)的孤立性心臟不良反應(yīng)已見報(bào)道，除了發(fā)生率<1%的心肌炎，心包積液和罕見心臟不良反應(yīng)(心律失常，例如心房顫動(dòng)等)也可能發(fā)生[48]。1例使用伊匹單抗治療的患者出現(xiàn)了心肌纖維化伴肝炎[1]，另1例由伊匹單抗導(dǎo)致的心臟驟停也被報(bào)道[49]。1例接受4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)劑量伊匹單抗治療的83歲女性轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者被診斷出患Takotsubo綜合征，這與CTLA-4失活所致的自身免疫性心肌炎有關(guān)[50]。

1.2.3.2 黑色素的提取 按照1.2.2.3中的方法，將培養(yǎng)5 d的A. alternata菌絲取下后，稱取0.25 g置于研缽中，加入液氮，研磨，置于30 mL 1 mol/L NaOH的錐形瓶中，進(jìn)行沸水浴5 h提取，每30 min左右晃蕩一次，注意補(bǔ)充NaOH。?20 ℃冷卻20 min，雙層濾紙過濾，濾液用7 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH2.0，10000 ×g離心15 min，得到沉淀為黑色素粗提物。

1.2.3.3 黑色素的純化與測定 向1.2.3.2中得到的黑色素粗提物加入5 mL 7 mol/L HCl，充分混勻，沸水浴2 h，10000 ×g離心15 min，沉淀用1 mol/L NaOH溶解，再用7 mol/L HCl調(diào)pH至2.0，10000 ×g離心15 min，重復(fù)3次。沉淀用1 mol/L NaOH溶液定容。以1 mol/L NaOH為空白，用紫外分光光度計(jì)于400 nm處測定溶液的吸光值。A. alternata菌絲中黑色素含量（y，mg/g），x為吸光值，計(jì)算公式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，Origin 2021作圖，用SPSS 23.0軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s多重差異顯著分析。圖中豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤，相同字母表示差異不顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果梨果皮酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)的影響

2.1.1 酚酸類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)的影響A. alternata孢子萌發(fā)率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，不同濃度的酚酸類物質(zhì)處理后A. alternata萌發(fā)率均顯著低于對(duì)照（P<0.05），且存在濃度依賴性（圖1），對(duì)照組和處理組的孢子萌發(fā)率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增加，且對(duì)照組與處理組之間存在顯著性差異（P<0.05）。在培養(yǎng)8 h后，四個(gè)酚酸類物質(zhì)對(duì)A.alternata的孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用（圖1），其中2 mg/mL阿魏酸、1.2 mg/mL對(duì)香豆酸、4 mg/mL綠原酸和0.6 mg/mL咖啡酸處理組的孢子萌發(fā)率分別較對(duì)照降低了98.5%、86.0%，41.5%和6.5%。

圖1 酚酸類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of phenolic acids treatment on spore germination of A. alternate

2.1.2 黃酮類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)的影響 由圖2可知，在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，孢子萌發(fā)率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增加，不同濃度的表兒茶素和兒茶素處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)率均有一定的抑制作用，且濃度越大抑制作用越強(qiáng)。在培養(yǎng)2～6 h時(shí)，抑制作用明顯，培養(yǎng)8 h時(shí)，抑制作用減弱，0.8 mg/mL表兒茶素和2 mg/mL兒茶素處理組與對(duì)照之間存在顯著性差異（P<0.05），孢子萌發(fā)率分為對(duì)照的11.9%和6.7%。

圖2 黃酮類處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effect of flavonoids treatment on spore germination of A. alternata

2.1.3 熊果苷處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)的影響 熊果苷是蘋果梨果皮中含量最豐富的一種酚類物質(zhì)。由圖3可知，在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，不同濃度熊果苷處理A. alternata后，對(duì)其孢子的萌發(fā)無抑制作用，與對(duì)照相比無明顯差異。

圖3 熊果苷處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effect of arbutin treatment on spore germination of A. alternata

2.1.4 酚酸類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響 由圖4可知，在整個(gè)培養(yǎng)期間，A. alternata的菌絲生長受到酚酸類物質(zhì)的顯著抑制，且隨著處理濃度的增加，抑制作用越強(qiáng)，在培養(yǎng)4 d后，高濃度酚酸類物質(zhì)處理A. alternata后，其菌絲生長狀況與對(duì)照組相比，均有顯著地抑制作用，其中阿魏酸處理抑制作用最強(qiáng)，以4 mg/mL綠原酸、0.6 mg/mL咖啡酸、2 mg/mL阿魏酸和1.2 mg/mL對(duì)香豆酸處理組分別較對(duì)照降低了24.8%、6.5%、8.2%和29.4%。圖5表示A. alternata由4種酚酸類物質(zhì)處理之后的菌落顏色為墨綠色，邊緣白色為菌絲，且圖片顯示4種酚酸類物質(zhì)均不同程度得抑制了A. alternata的菌落生長，且統(tǒng)計(jì)結(jié)果為圖4所示。

圖4 酚酸類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響Fig.4 Effect of phenolic acids treatment on mycelia growth of A. alternata

圖5 酚酸類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響Fig.5 Effect of phenolic acids treatment on mycelia growth of A. alternata

2.1.5 黃酮類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響 黃酮類物質(zhì)表兒茶素處理A. alternata后，培養(yǎng)4 d后，由圖6可知，其菌絲生長狀況與對(duì)照相比無明顯差異，而兒茶素處理后高濃度具有顯著地抑制作用，2 mg/mL處理后較對(duì)照降低了8.2%（P<0.05）。圖7則分別為兒茶素和表兒茶素處理之后A. alternata的菌落生長4 d的形態(tài)，通過圖片結(jié)果顯示，2種黃酮類物質(zhì)處理之后，其中2 mg/mL的兒茶素處理抑制了A. alternata的菌落生長，表兒茶素處理之后對(duì)其抑制作用不明顯，但2種黃酮類物質(zhì)處理之后，A.alternata的孢子產(chǎn)生均被抑制其中兒茶素抑制性較表兒茶素強(qiáng)，且具有濃度效應(yīng)。

圖6 黃酮類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響Fig.6 Effect of flavonoids treatment on mycelia growth of A. alternata

圖7 黃酮類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響Fig.7 Effect of flavonoids treatment on mycelia growth of A. alternata

2.1.6 熊果苷處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響 由圖8可知，不同濃度外源熊果苷處理A. alternata后，培養(yǎng)4 d時(shí)，其菌絲生長狀況與對(duì)照相比無顯著性差異（P>0.05）。表明外源熊果苷處理后對(duì)A.alternata的菌絲生長無抑制作用。由圖9可以看出，熊果苷處理A. alternata后，菌落直徑與對(duì)照相比無明顯差異，但菌落顏色對(duì)照為墨綠色，處理組為褐色。

圖8 熊果苷處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響Fig.8 Effect of arbutin treatment on mycelia growth of A. alternata

圖9 熊果苷處理對(duì)A. alternata菌絲生長的影響Fig.9 Effect of arbutin treatment on mycelia growth of A. alternata

2.2 蘋果梨果皮酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata生長的影響

2.2.1 酚酸類物質(zhì)對(duì)A. alternata菌絲生物量的影響 不同濃度的外源酚酸類物質(zhì)處理A. alternata后，均一定程度的降低了A. alternata的菌絲干重，且隨著濃度的增加菌絲生物量被降低的程度越強(qiáng)。在培養(yǎng)4 d后（圖10），以4 mg/mL綠原酸，0.6 mg/mL咖啡酸，2 mg/mL阿魏酸和1.2 mg/mL對(duì)香豆酸處理組較對(duì)照分別降低了52.9%、42.5%、22.2%和32.8%。

圖10 酚酸類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata菌絲生物量的影響Fig.10 Effect of phenolic acids treatment on mycelia biomass of A. alternata

2.2.2 外源黃酮類物質(zhì)對(duì)A.alternata菌絲生物量的影響 由圖11可知，不同濃度兒茶素處理A. alternata后（圖11A），對(duì)其菌絲干重的影響程度不同，其中2 mg/mL處理后與對(duì)照相比菌絲生物量降低了18.1%。然而，不同濃度表兒茶素處理A. alternata后（圖11B），與對(duì)照相比菌絲生物量無明顯差異。

圖11 黃酮類物質(zhì)處理對(duì)A. alternata菌絲生物量的影響Fig.11 Effect of flavonoids treatment on mycelia biomass of A. alternata

2.2.3 外源熊果苷處理質(zhì)對(duì)A. alternata菌絲生物量的影響 在蘋果梨果皮酚類物質(zhì)中，熊果苷含量最高。由圖12可知，培養(yǎng)4 d時(shí)，以不同濃度外源熊果苷處理A. alternata后，隨著熊果苷濃度增加，菌絲生物量含量逐漸下降。其中30 mg/mL熊果苷處理后較對(duì)照降低了19.6%。

圖12 熊果苷處理對(duì)A. alternata菌絲生物量的影響Fig.12 Effect of arbutin treatment on mycelia biomass of A. alternata.

2.3 蘋果梨果皮酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata黑色素含量的影響

由表1可知，培養(yǎng)4 d時(shí)，不同濃度外源酚類物質(zhì)處理A. alternata后，其黑色素含量均不同程度的增加，且總體上隨著酚類物質(zhì)濃度的增加黑色素含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。其中兒茶素、表兒茶素和熊果苷對(duì)黑色素形成的促進(jìn)作用最強(qiáng)，0.4 mg/mL 咖啡酸、2 mg/mL兒茶素、0.6 mg/mL表兒茶素和30 mg/mL熊果苷處理后，A. alternata黑色素含量分別是對(duì)照的2.53倍、3.00倍、2.05倍和1.53倍。但綠原酸、阿魏酸和對(duì)香豆酸處理A. alternata后，黑色素的含量略有增加。

表1 不同酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata黑色素含量的影響Table 1 Effect of different phenolic compounds on the content of melanin in A. alternata

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)蘋果梨果皮的酚酸類物質(zhì)顯著地抑制了A. alternata的孢子萌發(fā)、菌絲生長及生物量，這與Lee等[11]發(fā)現(xiàn)在未成熟的桃果實(shí)皮中的綠原酸對(duì)M. fructicola作用結(jié)果相一致。類似的如Sanzani等[3]和白雪娜等[17]研究發(fā)現(xiàn)傘形花內(nèi)酯能有效抑制蘋果P. expansum、Botrytis cinerea和M. fructicola的生長。Li等發(fā)現(xiàn)800 μg/mL的對(duì)香豆酸甲酯（乙酯）顯著地延緩了A. alternata孢子萌發(fā)以及菌絲生長，進(jìn)而延緩棗果實(shí)病害的發(fā)生[12?13]。本文研究結(jié)果顯示，阿魏酸和對(duì)香豆酸對(duì)A. alternata生長的抑制效果最佳，在處理8 h后發(fā)現(xiàn)，2 mg/mL阿魏酸和1.2 mg/mL對(duì)香豆酸處理的A. alternata孢子萌發(fā)率分別較對(duì)照降低了98.5%以及86.0%；培養(yǎng)4 d時(shí)，這兩個(gè)酚類物質(zhì)處理組的A. alternata菌落直徑與對(duì)照相比分別降低了29.4%和8.2%，相類似的研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸處理可有效控制西瓜采后病原真菌Fusarium oxysporum引起的枯萎病[18]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，2 mg/mL的兒茶素對(duì)A. alternata的生長同樣具有抑制作用，Pane等[19]在辣椒中也有類似發(fā)現(xiàn)。根據(jù)本研究的具體結(jié)果，分析可能的原因與酚類物質(zhì)處理病原菌后破壞了其細(xì)胞膜完整性有一定的關(guān)聯(lián)，由于植物酚類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式上存在的羥基（-OH）連接在苯環(huán)或其復(fù)雜的芳香環(huán)上[20]，因此其更具有親脂性，而羥基可作用于細(xì)胞膜通過氧化磷酸化解偶聯(lián)進(jìn)而優(yōu)先進(jìn)入膜內(nèi)[21]。由此酚類物質(zhì)的抗真菌機(jī)制在于其影響病原物細(xì)胞脂蛋白膜的功能，損傷細(xì)胞膜完整性，細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)以及液泡，胞質(zhì)pH的變化[22-23]，類似的研究發(fā)現(xiàn)水楊酸處理后損傷P. expansum細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致質(zhì)膜蛋白質(zhì)，糖以及核酸的滲透泄露[24]。

黑色素是病原真菌致病過程中重要的毒力因子，具有抗氧化、抗溶菌酶、吸收紫外線、抵御宿主免疫攻擊等生物學(xué)功能[25]，雖然對(duì)真菌生長和繁殖的影響較弱，但能夠降低病原菌對(duì)寄主所分泌的代謝產(chǎn)物的敏感性，從而提高其在寄主中的生存能力[26]，如Bacillus anthraci、Magnaporthe grisea、Acanthosporium cucurbitum、Acanthopanax senticosus和Acanthopanax graminearum等入侵寄主時(shí)產(chǎn)生的黑色素能激發(fā)附著胞產(chǎn)生膨壓，有利于病原菌在寄主體內(nèi)定殖[27]，同時(shí)，Pihet等[28]和Chai等[29]研究發(fā)現(xiàn)Cryptococcus neoformans黑色素缺失突變菌株喪失了致病性，在M. grisea[30]和A. alternata[31]中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。而黑色素增強(qiáng)病原真菌的生命力主要是由于其具有菌體胞外氧化還原緩沖劑的作用，可以中和病原物侵入寄主時(shí)造成的由于環(huán)境壓力產(chǎn)生的氧化劑,并且研究觀察到，黑色的C. neoformans細(xì)胞在氮和氧衍生的氧化劑作用下比非黑化的細(xì)胞存活率高出約10倍，這表明黑色素通過保護(hù)病原體免受免疫產(chǎn)生的自由基而有助于其致病,同時(shí)在對(duì)Wangiella dermatidis以及A. alternata的氧化損傷研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑色素在這兩種病原菌中的氧化還原性質(zhì)與C.neoformans中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致[32]。然而，酚類物質(zhì)對(duì)病原菌黑色素的研究鮮有報(bào)道，我們研究發(fā)現(xiàn)，梨果皮的7種酚類物質(zhì)處理A. alternata后，不同程度的刺激了該病原菌黑色素的產(chǎn)生，有趣的是，酚酸類物質(zhì)處理后顯著地延緩A. alternata的生長，然而其對(duì)黑色素的產(chǎn)生無明顯影響，相反的是兒茶素、表兒茶素和熊果苷處理后使A. alternata生長過程中黑色素明顯增加，其高濃度處理后黑色素含量分別是對(duì)照的3.00倍、2.05倍和1.53倍。其具體調(diào)控機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

除熊果苷外，蘋果梨果的酚類物質(zhì)處理對(duì)A.alternata的生長均具有不同程度的抑制作用，其中酚酸類物質(zhì)的抑制效果較明顯，阿魏酸的抑制作用最強(qiáng)。此外，酚類物質(zhì)處理后，均顯著地激發(fā)了A.alternata致病過程中黑色素的產(chǎn)生量，兒茶素、表兒茶素和熊果苷對(duì)A. alternata產(chǎn)生黑色素的促進(jìn)作用較強(qiáng)。表明蘋果梨果皮酚類物質(zhì)對(duì)A. alternata的生長以及致病性具有重要的調(diào)控作用。