一株引起番石榴黑斑病病原菌的分離與鑒定

郭溪遠(yuǎn)，藍(lán)荷英，林 艷，劉皓良，陳團(tuán)偉

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

番石榴（Psidium guajavaLinn.guava）隸屬桃金娘科番石榴屬，又名芭樂(lè)、雞矢果、拔子、喇叭番石榴、番桃樹(shù)，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，栽培歷史悠久且用途廣泛[1]。番石榴果實(shí)中富含膳食纖維、萜類、礦物微量元素等營(yíng)養(yǎng)功能成分[2?4]，具有生津止渴、收斂止瀉、消炎止血等功效，是一種藥食兩用的果實(shí)[5?7]，已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)最具有發(fā)展前景的重要水果之一。

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）報(bào)道，每年約有14%～21%的果蔬因各種因素被浪費(fèi)[8]。番石榴由于果實(shí)含水量高、營(yíng)養(yǎng)豐富、皮薄等特點(diǎn)[9?10]，在采后的加工及貯藏運(yùn)輸過(guò)程中易受機(jī)械損傷[11]，從而引起病原微生物侵染，導(dǎo)致其腐爛變質(zhì)嚴(yán)重影響其商品價(jià)值和果農(nóng)的種植積極性。其中，黑斑病是番石榴果實(shí)采后腐爛變質(zhì)的主要病害之一，例如張慧麗等[12]從番石榴上分離鑒定出了一株致使番石榴黑斑病病害的芒果球座菌。但目前對(duì)于引起番石榴黑斑病病害的主導(dǎo)病原菌的研究還相對(duì)較少，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)鑒定出番石榴病害的種類主要有炭疫病[13]、瘡痂病[14]、焦腐病[15]等。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病原菌鑒定方法越來(lái)越系統(tǒng)化，形態(tài)學(xué)觀察及PCR技術(shù)相配合越來(lái)越普遍，但結(jié)合生物學(xué)特性對(duì)病原菌鑒定的系統(tǒng)研究相對(duì)罕見(jiàn)。因此，本文擬采用組織分離法對(duì)染病番石榴果實(shí)的病原菌進(jìn)行分離純化及致病性驗(yàn)證，篩選出引起番石榴產(chǎn)生黑斑病的主導(dǎo)病原菌，通過(guò)生理生化研究，初步判斷出其相應(yīng)的生物學(xué)特性，并利用顯微鏡和PCR技術(shù)進(jìn)行克隆擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，所測(cè)序列于GenBank和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)和同源性分析，并于Neighbor-joining建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，實(shí)現(xiàn)番石榴果實(shí)優(yōu)勢(shì)病原菌的分離鑒定，旨在明晰引起番石榴黑斑病病害的主導(dǎo)病原菌對(duì)于采后防治措施的實(shí)施具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

珍珠番石榴 采集于福建省漳州市，自然條件下放至發(fā)病且病狀為發(fā)病中期，即果體表皮出現(xiàn)木質(zhì)化病斑，凹陷，病斑中心顏色為黑色，外圍為棕色；Taq DNA聚合酶TransGen AP221-02試劑盒 北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；細(xì)菌/真菌DNA提取試劑盒（磁珠法） 上海美吉逾華生物醫(yī)藥科技有限公司；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；馬鈴薯葡萄糖（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min；YM（YM Medium）培養(yǎng)基：酪蛋白胨5 g，麥芽浸粉3 g，葡萄糖10 g，酵母浸粉3 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

GI54DS自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器 致微（廈門(mén)）儀器有限公司；PRX-450A智能人工氣候箱 寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；OLYMPUS奧林巴斯顯微鏡 奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；DSHZ-300A旋轉(zhuǎn)式水浴恒溫振蕩器 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GL-12B飛鴿牌高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ABI GeneAmp? 9700型PCR儀 北京賽百奧科技有限公司；FR-1000全功能生物電泳圖像分析系統(tǒng)凝膠成像儀 上海復(fù)日科技有限公司。

1.5 IABP植入和撤除 經(jīng)左或右側(cè)股動(dòng)脈途徑，采用改良Seldinger法在PCI前預(yù)植IABP球囊導(dǎo)管（34mL或40 mL），確定導(dǎo)管位置后連接Datascope CS100型反搏機(jī)，予心電模式1∶1觸發(fā)。IABP植入后，根據(jù)患者臨床情況等，予低分子肝素30 mg或40 mg皮下注射，每12小時(shí)1次。待患者血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后可撤除IABP，撤除IABP的指征為：（1）停用血管活性藥物且血壓穩(wěn)定；（2）尿量 ＞1 mL·kg-1·h-1；（3）呼吸穩(wěn)定或動(dòng)脈血?dú)夥治龈黜?xiàng)指標(biāo)正常；（4）反搏頻率降為1∶2約1 h患者血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)仍然穩(wěn)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.2.5.1 總DNA提取 總DNA提取使用細(xì)菌/真菌DNA 提取試劑盒（磁珠法），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作。將病原菌的孢子懸浮液按1%的接種量加入含有50 mL YM培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，于28 ℃，160 r/min條件下的恒溫振蕩器下培養(yǎng)5 d，8000 r/min，4 ℃下離心10 min，得到病原菌S1的菌絲體。

各指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次，用Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析；將獲得相似度較高的序列用MEGA7.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，共循環(huán)1000次。

1.2.2.1 菌落的形態(tài)觀察 將純化后的S1菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，置于智能生化培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)5～14 d進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，記錄其菌落顏色和形態(tài)特征并拍照。

1.2.4.3 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 參照1.2.4.1取病原菌S1菌塊于PDA培養(yǎng)基上，分別置于20、24、28、32、36 ℃的生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑。

1.2.3 病原菌致病性測(cè)定 參照董漢松[16]的方法，將分離純化得到的病原菌S1回接到健康的番石榴果實(shí)上。選取16顆健康無(wú)病害的番石榴果實(shí)并將其在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡30 s，無(wú)菌水漂洗3次，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干。用經(jīng)高壓蒸汽滅菌的打孔器在果實(shí)底部中心處打直徑為7 mm的傷口，取100 μL由血球計(jì)數(shù)板配制成濃度為104CFU/mL孢子懸浮液接種于打孔部位，以接種100 μL無(wú)菌水于打孔部位為空白組，接種后將其放于密封的塑料盒中，并放置于28 ℃，90%濕度條件下的智能人工氣候箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分2組，每組8顆，共16顆番石榴果實(shí)。每隔24 h觀察病害癥狀及發(fā)病程度，選取病害明顯的果實(shí)再次采用1.2.1組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化，通過(guò)形態(tài)觀察初步判斷其與所接病原菌S1是否一致。

1.2.4 病原菌的生長(zhǎng)特性

1.2.4.1 pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 用0.1 mol/L HCl與NaOH溶液調(diào)節(jié)滅菌后的PDA培養(yǎng)基至不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），用無(wú)菌打孔器取直徑為7 mm的病原菌S1菌塊，移入調(diào)節(jié)pH后的PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑。

病原菌S1配制成104CFU/mL孢子懸浮液回接到健康的番石榴果實(shí)上進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)，如圖3所示。結(jié)果表明，回接S1孢子懸浮液后，5 d左右開(kāi)始出現(xiàn)病狀，發(fā)病癥狀打孔位置的顏色為黑色，孔徑外圍顏色為微棕色，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，病斑逐漸擴(kuò)大，并向四周擴(kuò)散（圖3a）；回接8 d病斑更加明顯，黑化部位由打孔位置擴(kuò)散出來(lái)，病健交界處仍為微棕色（圖3b）；回接14 d時(shí)，顏色為暗褐色或黑色，病健交界處呈棕色木質(zhì)化，稍有凹陷（圖3c）；發(fā)病過(guò)程中所出現(xiàn)的癥狀與自然條件下黑斑病的發(fā)病癥狀較為一致（圖3d）；然而，14 d時(shí)空白組所出現(xiàn)癥狀為果實(shí)表皮發(fā)生褐變（圖3e），未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組所產(chǎn)生病狀，與自然發(fā)病癥狀也不符。實(shí)驗(yàn)后期全果軟化，流汁，果體表面黑化腐爛，此結(jié)果與國(guó)內(nèi)外關(guān)于番石榴黑斑病病害[18?19]發(fā)病癥狀報(bào)道相似。從番石榴病健交界處組織上重新分離病原菌，通過(guò)形態(tài)觀察，重新分離、純化后的病原菌與所接病原菌S1形態(tài)一致。由此證明病原菌S1是造成福建省漳州珍珠番石榴采后腐爛的病原菌。

1.2.2.2 病原菌孢子的顯微形態(tài)觀察 將分離純化后的病原菌S1接種于含PDA培養(yǎng)基的平板上，于智能生化培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，待其長(zhǎng)滿整個(gè)平板，用無(wú)菌藥匙輕輕刮取表面孢子，于無(wú)菌研缽中進(jìn)行研磨后，加入無(wú)菌水，利用已滅菌的四層紗布過(guò)濾，即為病原菌S1孢子懸浮液。將孢子懸浮液滴一滴于無(wú)菌載玻片上，用鑷子取出蓋玻片并蓋上，用生物顯微鏡對(duì)病原菌S1的分生孢子進(jìn)行形態(tài)觀察和拍照。

1.2.1 病原菌的分離純化 選取顏色、大小、發(fā)病癥狀一致的番石榴病果，參照董漢松[16]的組織分離法對(duì)番石榴黑斑病病原菌進(jìn)行分離、純化。取發(fā)病中期的番石榴，用無(wú)菌手術(shù)刀片切取病健交界處組織，75%酒精表面消毒2 min，無(wú)菌水清洗3次，后接種于含PDA培養(yǎng)基的平板上，將平板置于智能生化培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，采用平板劃線法對(duì)病原菌進(jìn)行分離，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)情況，若無(wú)其他雜菌生長(zhǎng)，即為病原菌純菌種；用無(wú)菌接種環(huán)將帶有孢子的培養(yǎng)基切下移入新的PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，待其萌芽后再挑取培養(yǎng)，反復(fù)幾次操作直至無(wú)其他雜菌生長(zhǎng)，即為純化后的病原菌，并命名為S1。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)幾十年的發(fā)展，我國(guó)水利建設(shè)已經(jīng)邁入新的階段，規(guī)劃、設(shè)計(jì)、施工、運(yùn)行與管理的理論與技術(shù)水平已經(jīng)有了顯著提高，部分領(lǐng)域已達(dá)到世界領(lǐng)先水平。目前，我國(guó)已經(jīng)開(kāi)始從傳統(tǒng)水利向現(xiàn)代水利轉(zhuǎn)變，其中資源水利、環(huán)境水利與生態(tài)水利成為民生水利的主線，水利科技也隨之得到迅猛發(fā)展。

1.2.5.2 rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增 rDNA-ITS區(qū)擴(kuò)增采用真菌ITS通用引物ITS1（ITS1：TCCGTAGGT GAACCTGCGG）和ITS4（ITS4：TCCTCCGCTTATT GATATGC）對(duì)病原菌S1的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。20 μL PCR反應(yīng)體系（所有試劑的終濃度）：10×Ex Taq buffer為2 μL、5u Ex Taq為0.2 μL、2.5mmol/L dNTP Mix為1.6 μL、5p Primer1為1 μL、5p Primer 2為1 μL、DNA模板約為0.5 μL，ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)熱5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，穩(wěn)點(diǎn)電壓5 V/cm，電泳20 min，于凝膠成像儀分析結(jié)果。

法比跑到《圣經(jīng)》工場(chǎng)，開(kāi)始往閣樓上攀登時(shí)，突然想到．剛才趙玉墨沒(méi)有叫他“副神甫”，而是叫他“法比”，把“法比”叫成了一個(gè)地道的中國(guó)名字。

我愛(ài)菊花，正因它婀娜多姿，香味芬芳；正因?yàn)樗晃穱?yán)寒，傲視寒霜。我們做人就要像菊花那樣不怕困難，知難而進(jìn)，不斷地把自己磨成一個(gè)有用的人。

1.2.5.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序 采用TransGen AP221-02試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并根據(jù)Sanger測(cè)序法[17]將獲得的兩端原始序列（Raw sequence）分別進(jìn)行質(zhì)控去除低質(zhì)量的堿基，獲得干凈的序列（Clean sequence）后進(jìn)行拼接獲得組裝序列。

1.2.5.4 測(cè)序結(jié)果分析 經(jīng)校正后的測(cè)序結(jié)果于Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）同源性比對(duì)分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），比較測(cè)試S1菌株序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有序列的相似程度，并獲得相似度較高的序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理

針對(duì)可燃外墻保溫材料，除滿足相應(yīng)的SBI單體燃燒試驗(yàn)和可燃性試驗(yàn)的判定指標(biāo)要求外，還新增加了氧指數(shù)的要求。其中，B1級(jí)保溫材料的氧指數(shù)要求≥30%；B2級(jí)保溫材料的氧指數(shù)要求≥26%。

據(jù)各種估計(jì)，斯沃琪集團(tuán)子公司一直以來(lái)幾乎占瑞士標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械機(jī)心產(chǎn)量的四分之三，具有五六百萬(wàn)之多。入門(mén)級(jí)和中檔產(chǎn)品的替代廠商很少，尤其是單價(jià)低于200瑞士法郎的機(jī)心。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 菌落的形態(tài)觀察結(jié)果 將病原菌S1接種到PDA培養(yǎng)基中，置于智能生化培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)5～14 d的形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，剛分離出的S1菌株表面初期為橄欖綠色（圖1a），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落菌絲以接種點(diǎn)為中心向四周呈圓形擴(kuò)散，具有較多的氣生菌絲，14 d左右可長(zhǎng)滿直徑為90 mm的平板，表面凹凸不平，含有顆粒狀的灰白色孢子，邊緣呈凹陷狀（圖1b）。其顏色隨著時(shí)間逐漸加深直至變成墨綠色或黑色，菌落背面顏色呈墨綠色或黑色（圖1c），菌落的形態(tài)特征與前人研究的番石榴黑斑病病原菌形態(tài)特征較為一致[18?19]。

天津?yàn)I海新區(qū)是國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略的重要一極，是中國(guó)的，更是世界的。一個(gè)面向世界的國(guó)際化城市不能沒(méi)有自己的城市品牌，特別是在西方發(fā)達(dá)城市普遍重視建設(shè)自己的城市品牌的形式下，天津?yàn)I海新區(qū)城市品牌的建設(shè)顯得尤為重要，也尤為迫切。

2.1.2 病原菌的顯微形態(tài)觀察結(jié)果 取S1菌株于顯微鏡下進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果如圖2所示。在顯微鏡100×下可以看到S1的氣生菌絲蓬松且致密，呈絨毛狀，其形態(tài)呈不規(guī)則網(wǎng)狀且具有分支結(jié)構(gòu)（圖2a）；在顯微鏡200×下可以明顯看到菌絲及孢子，其菌絲形態(tài)類似竹竿狀具有分節(jié)，孢子形態(tài)呈圓形或者橢圓形，大小均勻（圖2b）；在顯微鏡400×下觀察S1的分生孢子，可以看到其呈現(xiàn)狀態(tài)為單孢且透明，大小約為（6～10） μm×（6～7） μm（圖2c），此結(jié)果與Arafat K[18]從番石榴黑斑病中分離出優(yōu)勢(shì)病原菌的顯微形態(tài)結(jié)果較為相似，將其孢子形態(tài)及大小與《真菌鑒定手冊(cè)》[20]進(jìn)行比對(duì)，初步判斷出其為葉點(diǎn)霉菌屬。

圖2 病原菌的顯微形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of pathogens

2.2 病原菌致病性測(cè)定結(jié)果

1.2.4.2 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 參照1.2.4.1取病原菌S1菌塊，移入PDA培養(yǎng)基上，并分別放于連續(xù)光照（光照強(qiáng)度為300 lx）、12 h連續(xù)光照與12 h完全黑暗交替、和完全黑暗三種光照條件下28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑。

圖3 分離純化菌株對(duì)番石榴的致病性Fig.3 Pathogenicity of isolated and purified strains to guava

2.3 病原菌的生長(zhǎng)特性

2.3.1 pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌S1在5個(gè)不同pH下均能生長(zhǎng)，如圖4所示，以pH為7.0～8.0較適宜菌絲的生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH為8.0，菌落直徑達(dá)74 mm，這與研究學(xué)者[21?22]對(duì)葉點(diǎn)霉屬菌的最適生長(zhǎng)條件研究成果較為相似，從而表明了病原菌S1較為適合在偏堿性條件下生長(zhǎng)。

圖4 pH對(duì)病原菌菌絲的影響Fig.4 Effect of pH on the hyphae of pathogenic bacteria

2.3.2 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌S1在三種培養(yǎng)條件下均可生長(zhǎng)，不同處理對(duì)于S1菌絲的影響不同，如圖5所示。28 ℃完全黑暗處理培養(yǎng)7 d時(shí)，菌落生長(zhǎng)直徑達(dá)71.3 mm，比連續(xù)光照和12 h光暗交替處理下的病原菌菌落生長(zhǎng)速度快，由此可見(jiàn)，光照不利于番石榴病原菌菌絲生長(zhǎng)。這與葉點(diǎn)霉屬菌所表現(xiàn)出的生物學(xué)特性[22?23]相符。

圖5 光照對(duì)病原菌菌絲的影響Fig.5 Effect of light on the hyphae of pathogenic bacteria

2.3.3 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌S1在5個(gè)不同溫度條件下均能生長(zhǎng)，如圖6所示，以溫度為24～28 ℃較適合菌絲生長(zhǎng)，此時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)到最快，高于36℃則不利于菌絲生長(zhǎng)，由圖可知，病原菌S1的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，此時(shí)菌落直徑達(dá)到最大為61 mm。因此，病原菌S1于常溫下較為適宜生長(zhǎng)，在溫度偏低或偏高下生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)[22]。

圖6 溫度對(duì)病原菌菌絲的影響Fig.6 Influence of temperature on the hyphae of pathogenic bacteria

2.4 分子鑒定結(jié)果

2.4.1 病原菌rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果 用細(xì)菌/真菌DNA 提取試劑盒（磁珠法）對(duì)病原菌S1提取總DNA，并利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果所顯示的PCR產(chǎn)物分子質(zhì)量大小與預(yù)期結(jié)果一致，如圖7所示。得到S1菌株的ITS區(qū)序列約為600 bp的片段，這與Arafat[18]從番石榴黑斑病病害分離出的病原菌擴(kuò)增序列較為相近，克隆并測(cè)序了S1菌珠的rDNA-ITS序列，測(cè)得該片段全長(zhǎng)實(shí)際為642 bp。

圖7 S1菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of strain S1

2.4.2 rDNA-ITS序列相似度比對(duì)分析 利用GenBank中的BLAST功能，將病原菌S1所測(cè)的rDNA-ITS序列與GenBanK數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與首都葉點(diǎn)霉菌的ITS序列相似度最為相近，高達(dá)99%以上。并從比對(duì)結(jié)果中選取15個(gè)相似度最為相近的菌株的ITS序列，以Phyllosticta citriasiana、Phytophthora nicotianae菌株（GenBank登錄號(hào)：JN791609.1、KX250514.1）作為外源菌，進(jìn)一步利用MEGA7.0軟件中的Neighbor-joining建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖8所示。由圖可知，在與病原菌S1具有較高相似度的菌株中，病原菌S1與Phyllosticta capitalensis（GenBank登錄號(hào):MK396571.1、MK396601.1）處于同一分支上，與Phyllosticta citriasiana處于不同分支，這與2.1.2初步判斷出的結(jié)果相符，與Phytophthora nicotianae的遺傳距離較遠(yuǎn)。因此，綜合S1菌株的形態(tài)學(xué)特征、致病性和ITS序列分析結(jié)果，可確定引起番石榴的病原菌為首都葉點(diǎn)霉Phyllosticta capitalensis，這與BLAST比對(duì)結(jié)果一致。

第三，游客對(duì)長(zhǎng)江三峽地域文化認(rèn)知過(guò)程具有選擇性。出游前，游客通過(guò)信息刺激產(chǎn)生初始認(rèn)知；出游過(guò)程中，游客在個(gè)體已有知識(shí)和體驗(yàn)的影響下，產(chǎn)生對(duì)信息的選擇性“接觸-注意-理解-保持”[33]86過(guò)程；出游后，游客形成的認(rèn)知印象以概念網(wǎng)絡(luò)的形式進(jìn)行儲(chǔ)存，反映了部分的目的地文化。

圖8 S1菌株基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree constructed by S1 strain based on rDNA-ITS sequence

3 討論與結(jié)論

病原菌可以從果實(shí)的傷口或者氣孔等不同部位入侵，病癥初期病斑僅存在于果皮上，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病原菌擴(kuò)散至全果后，開(kāi)始逐漸蔓延至果肉，導(dǎo)致全果腐爛。目前已報(bào)道引起番石榴果實(shí)采后腐爛的病原微生物主要有芒果球座菌[12]、葡萄座腔菌[24]、炭疽病菌[25?26]、可可球二孢菌[25]、瘡痂病菌[14]等。近年來(lái)，在對(duì)病原菌的鑒定中，利用PCR擴(kuò)增其rDNAITS序列的方法進(jìn)行鑒定越來(lái)越廣泛[27]。本研究對(duì)福建漳州地區(qū)珍珠番石榴的病原菌進(jìn)行分離、純化與回接，獲得一株優(yōu)勢(shì)病原菌S1，對(duì)其進(jìn)行了生長(zhǎng)特性研究實(shí)驗(yàn)，確定了其相關(guān)生物學(xué)特性，并結(jié)合PCR技術(shù)，對(duì)PCR擴(kuò)增所得rDNA-ITS基因序列進(jìn)行同源性分析，建立了其在真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的分類地位，明確了不同菌種之間的同源度、親緣關(guān)系及進(jìn)化地位，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，鑒定出引起番石榴黑斑病病害的優(yōu)勢(shì)病原菌為首都葉點(diǎn)霉（Phyllosticta capitalensis）。

首都葉點(diǎn)霉屬于葉點(diǎn)霉屬，是一類源于植物的病原菌[28]。相關(guān)研究表明[29?30]，其菌落生長(zhǎng)速度緩慢，PDA上培養(yǎng)7 d直徑僅為60 mm左右，菌落形態(tài)主要為黑色，表面有絮狀灰白色小顆粒，孢子主要以單孢形式存在，呈橢圓形或卵圓形且透明，大小約為（11～12） μm×（6～7） μm，生存方式主要有寄生或腐生，具有較強(qiáng)致病性，易導(dǎo)致植物產(chǎn)生病害，所產(chǎn)生的病害通常稱為黑斑病或黑星病。如Duan等[31]從黑斑病的臺(tái)灣柿子中分離出優(yōu)勢(shì)病原菌并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察及生物學(xué)鑒定，最后通過(guò)致病性檢測(cè)，首次發(fā)現(xiàn)柿子所產(chǎn)生黑斑病的主導(dǎo)病原菌為首都葉點(diǎn)霉；Arafat[18]從黑斑病的番石榴中分離鑒定出了首都葉點(diǎn)霉，對(duì)其進(jìn)行了致病性檢測(cè)，驗(yàn)證了其為造成黑斑病的主導(dǎo)病原菌之一。但近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于首都葉點(diǎn)霉的鑒定研究中，大多局限于生物學(xué)鑒定，極少對(duì)其相關(guān)生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，在今后番石榴采后貯藏及抑菌上，所能提供的參考價(jià)值有局限性。因此，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)從番石榴病果中分離純化出的病原菌S1進(jìn)一步進(jìn)行果實(shí)體外致病性實(shí)驗(yàn)，接種S1菌株的番石榴果實(shí)均出現(xiàn)病癥，且發(fā)病癥狀與番石榴自然條件下黑斑病的發(fā)病癥狀一致，接種無(wú)菌水的番石榴果實(shí)未出現(xiàn)相似癥狀，從病健交界處組織重新分離病原菌，得到的病原菌與所接病原菌形態(tài)一致。通過(guò)酸堿性試驗(yàn)、光照試驗(yàn)和溫度試驗(yàn)研究可知，其較適宜于偏堿性、黑暗、常溫條件下生長(zhǎng)，與番石榴采后貯藏條件較為符合，并結(jié)合其PCR擴(kuò)增序列片段及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，與前人[18?19]研究所報(bào)道的從番石榴黑斑病中分離出的首都葉點(diǎn)霉形態(tài)特征及致病癥狀較為相似，由此證明首都葉點(diǎn)霉（Phyllosticta capitalensis）是引起福建省珍珠番石榴采后腐爛的一種病原真菌。

本研究與以往研究相比引起珍珠番石榴采后腐爛的病原微生物種類有所差異，其原因可能是番石榴被不同病原菌入侵的方式不同，以及地理環(huán)境、生長(zhǎng)條件和氣候條件等方面的差異[32]或者運(yùn)輸過(guò)程中造成的機(jī)械損傷引起不同種類病原菌的入侵等，從而導(dǎo)致在貯藏過(guò)程中引起番石榴腐敗的病原微生物種類存在一定的差異[33?34]。通過(guò)對(duì)福建省漳州地區(qū)的珍珠番石榴黑斑病病原菌的研究，明確了引起珍珠番石榴采后病原菌的種類及其特性，為進(jìn)一步加強(qiáng)珍珠番石榴在采后貯藏、運(yùn)輸過(guò)程中出現(xiàn)微生物病害防治及抑制奠定了理論基礎(chǔ)。