產(chǎn)ACE抑制肽乳酸菌的篩選、益生特性評定及應(yīng)用

宋小玲，高冀婷，曹菲薇，胡子毅，任大喜

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058）

高血壓是引起心腦血管疾病和中風(fēng)的重要危險因素之一[1]。近年來，高血壓人群在全球范圍內(nèi)持續(xù)增加[2]。中國高血壓調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2018年我國成人的高血壓患病人數(shù)達2.45億，且患者越來越年輕化[3?4]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）在血壓調(diào)節(jié)方面起著重要作用，可以將血管緊張素I（Ang I）轉(zhuǎn)化為具有收縮血管功能的血管緊張素II，還可以將具有血管舒張作用的緩激肽水解成失活片段[5]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是治療高血壓最常用的藥物之一[6?7]，盡管藥物療法是最廣泛用于治療高血壓的方法，但長期使用具有繼發(fā)性副作用。發(fā)酵乳被推薦作為高血壓的非藥物療法，主要因為它基本無副作用。發(fā)酵乳的降壓效果[8?9]主要歸因于乳蛋白中的ACE抑制肽（ACEI肽），這些肽可以在特定乳酸菌發(fā)酵或胃腸消化過程中被釋放出來，通過抑制ACE活性來引起血管擴張反應(yīng)，從而降低血壓。

關(guān)于ACEI肽研究最多的是乳酸桿菌菌株[10?11]，例如Lb. helveticus、Lb. casei、Lb. paracasei、Lb. fermentum、Lb. plantarum、Lb. rhamnosus等，其中以瑞士乳桿菌（Lb. helveticus）最多。研究最多的ACEI肽[12]是在瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)的VPP和IPP，在幾種大鼠模型和人體研究中都顯示出降血壓效果。目前市面上的降血壓發(fā)酵乳[13?14]基本都是國外的，芬蘭和日本研發(fā)的降血壓發(fā)酵乳對高血壓的治療有顯著效果，知名度較高。雖然市面上存在具有降血壓作用的商業(yè)發(fā)酵乳，但品種稀缺，且大多數(shù)基于瑞士乳桿菌。

研究表明乳酸菌的細胞壁蛋白酶負責(zé)生產(chǎn)ACEI肽，細胞壁蛋白酶可以將乳蛋白分解成寡肽并將其用作營養(yǎng)來源，乳酸菌的細胞壁蛋白酶活性、蛋白水解系統(tǒng)和菌株活性是生產(chǎn)降壓肽的基礎(chǔ)。酶的特異性決定了釋放肽的序列，每個菌株的酶有特異性[15]，具有富產(chǎn)ACEI肽潛力的乳酸菌是開發(fā)降血壓發(fā)酵乳的前提。因此，篩選具有富產(chǎn)ACEI肽的新型乳酸菌并開發(fā)含有新型乳酸菌的功能性乳制品，對促進人體健康和滿足人們對功能性食品的消費需求意義重大。本研究擬在實驗室乳酸菌庫中，篩選出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的富產(chǎn)ACE抑制肽的乳酸菌，為后續(xù)動物試驗、臨床研究、降壓發(fā)酵乳及乳制品的開發(fā)提供菌株和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株：本實驗室篩選的菌株來自內(nèi)蒙及川藏地區(qū)酸奶湯、鮮奶、奶疙瘩、手工酸奶及浙江新生嬰兒糞便等分離到的遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良的30多株菌；指示菌株：大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）ATCC 25922、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 13311 美國典型培養(yǎng)物保藏中心；單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）CMCC 54007、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003 中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心；膽鹽、MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然有限公司；水牛乳 廣西水牛研究所牧場；FAPGG底物、ACE（來自兔肺，酶活0.1 UN）、胃蛋白酶（1:3000）和胰蛋白酶（1:250） Sigma公司；BCA蛋白試劑盒 上海源葉生物科技有限公司；HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸） 阿拉?。ㄉ虾＃┯邢薰荆豢股厮幟粼嚰?杭州微生物試劑有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀 上海道尚生物科技有限公司；3-30K低溫高速離心機 德國Christ公司；FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；ES-315高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；BD-305E變溫冷凍凍藏箱 浙江星星冷鏈集成股份有限公司；SW-CJ-IF超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵乳制備 取出實驗室乳酸菌庫中保藏的菌株，在MRS固體培養(yǎng)基上活化三代，取單菌落接于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)20 h后取出，用PBS將菌株濃度調(diào)至108CFU/mL，按照3%（v/v）的接種量接種到滅菌脫脂乳（11%，w/v）中，37 ℃培養(yǎng)48 h后取出，?20 ℃冰箱放置，待進一步分析。

1.2.2 蛋白水解度測定 蛋白水解度的測定參考羅艷華等[16]的方法。以絲氨酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用OPA法測定樣品在340 nm處的吸光值，通過公式計算蛋白水解度（DH）。稱取0.01 g絲氨酸于100 mL容量瓶中定容，使其濃度為1 mmol/L，再加超純水稀釋至0、0.2、0.4、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol/L，配制成絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，向96孔板中加入20 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和150 μL OPA溶液混合，靜置2 min后讀取340 nm的吸光值（標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.5746x+0.0178，R2=0.9935）。將發(fā)酵乳清稀釋20倍后，取20 μL樣品與150 μL OPA溶液混合，靜置2 min后讀取340 nm的吸光值，計算公式如下：

式中：Wserine NH2表示每克蛋白質(zhì)含絲氨酸的量，mmol/g；C表示樣品OD值相對應(yīng)于標(biāo)曲中絲氨酸的濃度，mol/L；V表示樣品體積，L；N表示稀釋倍數(shù)；X表示樣品質(zhì)量，g；h表示每克蛋白因水解被斷裂的肽鍵數(shù)，mmol/g；htot表示每克蛋白所含的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g；乳蛋白的α值為1.0，β值為0.4。

1.2.3 ACE抑制率測定 發(fā)酵乳清的制備：將發(fā)酵乳pH調(diào)至4.6，8000 ×g離心10 min取上清液，再將上清液pH調(diào)至8.3，8000 ×g離心10 min取上清液得發(fā)酵乳清。

HEPES緩沖液：pH8.3，80 mmol/L HEPES緩沖液（含30 mmol/L的NaCl）；FAPGG溶液：取FAPGG粉末加入到HEPES緩沖液中，配制成1.0 mmol/L的FAPGG溶液；ACE溶液：取ACE固體加入到HEPES緩沖液中，配制成0.1 U/mL的ACE溶液。

ACE抑制率的測定方法參考羅鵬[17]和Memarpoor等[18]并略作修改。以FAPGG底物法測定發(fā)酵乳清的ACE抑制率。取40 μL樣品和50 μL的FAPGG混合均勻，最后加入10 μL的ACE溶液，利用酶標(biāo)儀測定OD340數(shù)值的前后變化來代表ACE酶活性?？瞻讓φ詹捎肏EPES緩沖液（40 μL），其余測定同上。抑制率可用公式表示：

式中：ΔA為空白對照組在0～40 min內(nèi)吸光值的變化；ΔB為實驗組（ACE抑制劑）在0～40 min時吸光值的變化。

IC50測定：將發(fā)酵乳清凍干，取凍干粉加水復(fù)配成30 mg/mL溶液，參照羅鵬[17]測定溶液中多肽含量，將樣品溶液8000 g 離心10 min保留上清液，使用10 kDa超濾管對上清液進行超濾，取超濾液借助BCA試劑盒測定其多肽含量（酶標(biāo)儀法），將樣本溶液稀釋至6個多肽濃度梯度0.001、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，測定各濃度梯度下的ACE抑制率，利用Graph Pad Prism 8軟件計算樣品的IC50值（IC50定義為ACE抑制率達50%時所需的多肽濃度）。

1.2.4 模擬胃腸消化 人工胃液和腸液參考Lisson等[19]進行配制。取發(fā)酵乳5 mL，將發(fā)酵乳與人工胃液按2:1（v/v）混合，于37 ℃恒溫水浴振蕩器中消化2 h，沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)，取樣測定其ACE抑制率；胃蛋白酶消化后的樣品按1:1（v/v）的量與人工腸液混合，在恒溫水浴振蕩器中消化2 h，沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)，取樣測定其ACE抑制率。

1.2.5 菌株16S rRNA鑒定 將篩選到的菌株送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序，將所得到的序列于NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST進行同源性比較確定菌屬。使用MEGA 7.0軟件進行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.6 益生特性評價

1.2.6.1 乳酸菌酸耐受性能測定 參考鄭志瑤等[20]的方法，將乳酸菌（濃度約108CFU/mL）以10%（v/v）接種量接于pH為3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)，分別在0、3 h取菌液，進行活菌計數(shù)，計算酸耐受性：

式中：A0、A3分別為待測菌株0和3 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.6.2 乳酸菌膽鹽耐受性能測定 參考鄭志瑤等[20]的方法，將乳酸菌（濃度約108CFU/mL）以10%（v/v）的接種量接于含0.3%牛膽鹽（v/v）的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)，分別在0、3 h取菌液，進行活菌計數(shù)，計算膽鹽耐受性：

式中：T3、T0分別為待測菌株0和3 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.6.3 乳酸菌的抑菌活性 參考梁竟一等[21]的方法，采用牛津杯法和瓊脂擴散法測量菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11代謝產(chǎn)物的抑菌活性。將已活化好的4種指示菌株（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌）的菌懸液濃度調(diào)至108CFU/mL，按1%（v/v）的量接種到LB瓊脂培養(yǎng)基（50 ℃）中，混合均勻后倒培養(yǎng)皿中（15 mL/皿），冷凝后拔掉事先放置的無菌牛津杯，將菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的代謝上清樣品加入杯孔中（200 μL/孔），以未接乳酸菌的MRS肉湯作為空白對照，在37 ℃下培養(yǎng)，24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.6.4 乳酸菌的抗生素敏感性 參考梁竟一等[21]的方法，采用紙片擴散法[22]測量菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的抗生素敏感性。分別取100 μL菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的菌懸液（約108CFU/mL）于MRS固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，然后放置抗生素試紙，在37 ℃下培養(yǎng)，24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.7 乳酸菌對不同發(fā)酵底物效果比較 將荷斯坦脫脂乳粉按11%濃度加水復(fù)配，調(diào)整pH至4.6，8000×g離心10 min保留上清液，調(diào)上清液pH至7.0得荷斯坦牛乳清；水牛乳由廣西水牛所提供，將水牛乳5000×g離心10 min脫脂，然后調(diào)整pH4.6，8000 ×g離心10 min保留上清液，調(diào)上清液pH至7.0得水牛乳清。使用BCA試劑盒分別測定荷斯坦脫脂乳、荷斯坦乳清、水牛脫脂乳、水牛乳清的蛋白濃度。用超純水將4種底物的蛋白濃度調(diào)整為同一濃度，將菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11按3%（v/v）的量接種到這4種底物中，37 ℃發(fā)酵48 h，取樣測定ACE抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次。采用Graph Pad Prism 8.0軟件進行非線性擬合得到回歸曲線圖；采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析及顯著性分析（one-way ANOVA和two-way ANOVA），使用Tukey進行多重比較，試驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，P<0.05的差異被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ACE抑制肽乳酸菌的初篩

對實驗室保藏的30多株菌進行脫脂乳發(fā)酵實驗，測定菌株的水解度在2.74%～7.54%之間，篩選出了13株水解能力最強的菌株（P<0.05）用于后期研究，如圖1所示。初篩得到的13種菌株，其蛋白水解度均在5%以上，其中菌株ZJUIDS22和ZJUIDS13的蛋白水解能力最強（P<0.05），水解度分別達7.54%和7.51%。

圖1 菌株發(fā)酵乳的蛋白水解度Fig.1 Protein hydrolysis degree of fermented milk by different strains

2.2 產(chǎn)ACE抑制肽乳酸菌的復(fù)篩

對上述篩選到的13株水解能力較強的菌株進行發(fā)酵實驗，測定ACE抑制率，所得結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，抑制效果最好的是菌株ZJUIDS11，其ACE抑制率達90.41%。13株乳酸菌中，有6株乳酸菌發(fā)酵乳的ACE抑制率顯著高于其它株（P<0.05），其ACE抑制率均在80%以上，篩選該6株菌用于后續(xù)的研究。

圖2 不同菌株發(fā)酵乳的ACE抑制率Fig.2 ACE inhibition rate of fermented milk by different strains

2.3 乳酸菌發(fā)酵乳在模擬胃腸液中ACE抑制率的變化

6株菌的發(fā)酵乳經(jīng)人工胃液和腸液消化后的ACE抑制率見圖3。6種菌株發(fā)酵乳經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解作用后，ACE抑制率全部下降，顯著低于消化前（P<0.05）。ZJUIDS09發(fā)酵乳經(jīng)胃液和腸液作用后，ACE抑制率無顯著性變化（P＞0.05）；ZJUIDS11發(fā)酵乳經(jīng)胃液和腸液消化后ACE抑制率先降低后升高（P<0.05）；經(jīng)人工腸液后，ZJUIDS09和ZJUIDS11發(fā)酵乳的ACE抑制率分別達到了70.13%±0.15%和76.39%±2.91%，顯著高于其它4株菌（P<0.05）。因此，經(jīng)篩選得ZJUIDS09和ZJUIDS11為富產(chǎn)ACE抑制肽的最佳潛力菌株。

圖3 人工胃液和腸液對發(fā)酵乳ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of artificial gastric juice and intestinal juice on the ACE inhibition rate of fermented milk

2.4 菌株的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

經(jīng)篩選后發(fā)現(xiàn)，菌株ZJUIDS09發(fā)酵乳的ACE抑制率為87.39%±2.44%，菌株ZJUIDS11發(fā)酵乳的ACE抑制率為90.41%±0.99%，兩者都能耐受模擬消化環(huán)境。送樣測定兩株菌的16S rDNA序列，將獲測序結(jié)果進行BLAST序列比對。綜合16S rDNA和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果可知（圖4），菌株ZJUIDS09為羅伊氏乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri），菌株ZJUIDS11為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticusstrain）。

圖4 兩株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of two lactic acid bacteria

2.5 潛力菌株發(fā)酵乳的ACE抑制IC50值測定

ZJUIDS09和ZJUIDS11發(fā)酵乳的ACE抑制率與其多肽濃度之間存在明顯的量效關(guān)系，多肽濃度與ACE抑制率之間的關(guān)系如圖5A（R2=0.951）和圖5B（R2=0.928）所示。根據(jù)Graph Pad Prism 8.0軟件進行非線性擬合得到ZJUIDS09和ZJUIDS11發(fā)酵乳ACE抑制IC50值分別為0.31、0.25 mg/mL（注：IC50定義為ACE抑制率達50%時所需的多肽濃度）。

圖5 發(fā)酵乳的多肽濃度與ACE抑制率間的關(guān)系Fig.5 Relationship between the peptide concentration of fermented milk and ACE inhibitory rate

2.6 兩株乳酸菌的益生特性

2.6.1 兩株乳酸菌的酸耐受率和膽鹽耐受率 本試驗中，菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的酸耐受率和膽鹽耐受率如表1所示。胃液的pH一般在2～3左右，具有酸耐受性的乳酸菌才能進入胃腸道中發(fā)揮作用，試驗結(jié)果顯示兩株菌的酸耐受率分別為62.50%和152.00%，ZJUIDS11的酸耐受率是ZJUIDS09的2倍以上。人體小腸內(nèi)的膽鹽含量約為0.30%，具有膽鹽抗性的乳酸菌才能在小腸中維持活力并發(fā)揮益生菌作用，試驗結(jié)果顯示兩株菌的膽鹽耐受率分別為0.26%和0.004%，表明ZJUIDS09可以耐受小腸的膽鹽環(huán)境，ZJUIDS11幾乎沒有膽鹽抗性。

表1 乳酸菌的酸、膽鹽耐受率Table 1 Acid and bile salt tolerance rate of lactic acid bacteria

2.6.2 兩株乳酸菌對4種常見致病菌的抗菌活性 在本試驗中，采用4種腸道致病菌作為指示菌，分別檢測菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11上清液的抑菌活性，數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11對4種致病菌均有一定的抑制作用，菌株ZJUIDS09對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有顯著的抑制效果（P<0.05），抑菌圈達15.25 mm，菌株ZJUIDS11對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌和大腸桿菌有顯著的抑制效果（P<0.05），其中對單核細胞增生李斯特菌的抑制效果最好，抑菌圈達15.01 mm。因此，菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11生長過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)具有一定的抗菌活性，對人體腸道健康具有促進作用。

表2 乳酸菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of lactic acid bacteria

2.6.3 兩株乳酸菌的抗生素敏感性 根據(jù)CLSI的藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)，分別對菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的常見抗生素敏感性進行判斷，結(jié)果見表3。菌株ZJUIDS09對4種抗生素（氯霉素、紅霉素、克拉霉素、林可霉素）呈現(xiàn)敏感狀態(tài)，其中對氯霉素最敏感，抑菌圈達35.15 mm，對青霉素中度敏感。菌株ZJUIDS11對2種抗生素（紅霉素、四環(huán)素）呈現(xiàn)敏感狀態(tài)，其中對紅霉素最敏感，抑菌圈達20.51 mm，對氯霉素、克拉霉素和氨芐青霉素中度敏感。試驗結(jié)果表明兩株菌均對紅霉素表現(xiàn)出較高的敏感性，對4種常見抗生素（氯霉素、紅霉素、克拉霉素、四環(huán)素）均無耐藥性（注：對抗生素敏感與中度敏感被認為不具備耐藥性），菌株安全性較好。

表3 兩株乳酸菌的抗生素敏感性Table 3 Antibiotic sensitivity of two lactic acid bacteria

2.7 兩株乳酸菌對不同底物的發(fā)酵后ACE抑制效果比較

將水牛脫脂乳、水牛乳清、荷斯坦脫脂乳、荷斯坦乳清這4種底物調(diào)整為同一蛋白濃度，加入乳酸菌ZJUIDS09和ZJUIDS11進行發(fā)酵，測定發(fā)酵上清液的ACE抑制率。如圖6，不同菌株發(fā)酵水牛脫脂乳和水牛乳清，ACE抑制率分別在77.25%～89.92%和34.22%～37.38%之間；不同菌株發(fā)酵荷斯坦脫脂乳和荷斯坦乳清，ACE抑制率分別在86.46%～88.48%和37.29%～41.32%之間；無論是荷斯坦脫脂乳還是水牛脫脂乳，發(fā)酵后的ACE抑制率都顯著高于乳清（P<0.05）；對比荷斯坦脫脂乳和水牛脫脂乳發(fā)酵后的ACE抑制率，發(fā)現(xiàn)二者并無顯著性差異（P＞0.05）；使用不同菌株發(fā)酵同一底物，發(fā)現(xiàn)其ACE抑制率無顯著性差異（P＞0.05）。

圖6 四種發(fā)酵底物的ACE抑制率Fig.6 ACE inhibitory rate of four different fermentation substrates

3 討論

具有產(chǎn)ACE抑制肽功能的乳酸菌研究[23]受到越來越多的關(guān)注，不同菌株的蛋白水解能力存在較大差異[24]，菌株發(fā)酵乳的蛋白水解度越高，則代表該菌株的蛋白酶解系統(tǒng)越豐富，可以將乳蛋白降解生成大量的多肽，產(chǎn)肽效果較好的菌株更具備生產(chǎn)ACEI肽的潛力。本試驗對實驗室保藏的30多株菌進行脫脂乳發(fā)酵實驗，以水解度作為初篩指標(biāo)選出13株水解蛋白能力最強的菌株（P<0.05），水解度均在5%以上。

乳酸菌[25]酶解乳蛋白釋放出ACEI肽，這些短肽可以與ACE活性中心結(jié)合，從而阻礙血管緊張素Ⅱ的生成以及促進緩激肽的降解，達到降血壓的功效。Li等[26]從41株干酪乳桿菌中，篩選出2株產(chǎn)ACE抑制肽效果最佳的菌株，抑制率最高達73.50%；Chen等[27]從59株瑞士乳桿菌中，篩選出3株產(chǎn)ACE抑制肽的菌株，抑制率最高達81.71%；Pihlanto等[28]篩選出25種具有ACE抑制率的乳酸菌發(fā)酵乳，ACE抑制率在5%～74%之間，IC50在0.42～0.52 mg/mL之間；Tsai等[29]使用乳酸菌（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）和蛋白酶發(fā)酵脫脂乳，測定發(fā)酵上清的IC50值為0.27 mg/mL；Leclerc等和Fuglsang等[30?31]使用瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳，測定發(fā)酵乳清的IC50為0.16～1.1 mg/mL。本研究從13株水解蛋白能力較強的菌株中篩選出6株產(chǎn)ACEI肽效果較好的菌株，其中羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09和瑞士乳桿菌ZJUIDS11發(fā)酵乳的ACE抑制率分別達87.39%和90.41%，IC50值分別為0.31和0.25 mg/mL，與上述菌株相比ACE抑制率更強。這可能是因為本試驗篩選出的菌株，具有較豐富的蛋白酶系統(tǒng)，其細胞壁蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶及氨基肽酶，可以高效地酶解牛乳蛋白，產(chǎn)生的活性肽可以有效且穩(wěn)定地與ACE活性中心結(jié)合，從而抑制ACE的活性。

乳酸菌發(fā)酵乳釋放的生物活性肽應(yīng)能抵抗胃腸蛋白酶的消化才能發(fā)揮作用[32?33]。一些肽序列在發(fā)酵后是無活性的，但是經(jīng)過胃腸蛋白酶消化后會被激活，一些發(fā)酵產(chǎn)生的活性肽在經(jīng)過胃腸蛋白酶消化后會被水解成小的滅活片段，因此模擬胃腸消化后的ACE抑制率是發(fā)酵乳在人體內(nèi)發(fā)揮作用的重要指標(biāo)。本試驗從6株產(chǎn)ACEI肽效果較好的乳酸菌中，通過模擬胃腸消化篩選出2種抗消化的菌株發(fā)酵乳，分別是ZJUIDS09和ZJUIDS11。這兩種菌株發(fā)酵乳在經(jīng)過胃腸液消化后，ACE抑制率均有所下降，ZJUIDS09菌株發(fā)酵乳下降至70.13%，ZJUIDS11菌株發(fā)酵乳下降至76.39%。Chen等[34]使用植物乳桿菌L69（Lactobacillus plantarumL69）發(fā)酵山羊奶，通過體外胃腸液消化后發(fā)現(xiàn)，消化前的ACE抑制率可達79.11%，經(jīng)胃消化后降至70.22%，最后在腸道環(huán)境中維持59.89%，發(fā)酵乳經(jīng)過胃腸消化后ACE抑制率會降低。這與本試驗結(jié)果較一致，原因可能是乳酸菌生產(chǎn)的ACE抑制肽經(jīng)胃腸蛋白酶消化后釋放出了一些小的失活片段。相比其他學(xué)者的試驗結(jié)果，本試驗篩選的這兩種菌株發(fā)酵乳在經(jīng)過胃腸液消化后的ACE抑制率仍較為穩(wěn)定。因此，ZJUIDS09和ZJUIDS11為富產(chǎn)ACE抑制肽的潛力菌株。

膽鹽和酸耐受性試驗旨在測試乳酸菌是否能夠通過模擬人體胃酸和腸道環(huán)境，從而提高存活的定植概率。本次試驗篩選的兩種乳酸菌的酸耐受率均在60%以上，與嗜酸乳桿菌相當(dāng)[35]，具有良好的耐酸性。大部分乳酸菌在膽鹽中的存活率都處于0.2%～0.4%之間[36?38]，本試驗中的羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09的膽鹽存活率為0.26%，比瑞士乳桿菌ZJUIDS11更有可能在腸道中存活甚至定植。此外，抗菌特性表明這兩株菌的代謝產(chǎn)物能在一定程度上抵御腸道有害菌的侵害，羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09對金黃色葡萄球菌有較好的抑制效果，瑞士乳桿菌ZJUIDS11對單增李斯特菌有較好的抑制效果?？股孛舾行越Y(jié)果表明菌株的安全性較好，羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09對氯霉素較敏感，瑞士乳桿菌ZJUIDS11對紅霉素較敏感。

不同來源（牛、水牛）牛乳的理化特性存在顯著差異，不同類型的乳蛋白（乳清蛋白、酪蛋白、脫脂乳）生產(chǎn)的生物活性肽在結(jié)構(gòu)和功能上也有著顯著區(qū)別[39]。本試驗將荷斯坦脫脂乳、荷斯坦乳清、水牛脫脂乳和水牛乳清調(diào)整為同一蛋白濃度，經(jīng)過菌株發(fā)酵后對比ACE抑制率，發(fā)現(xiàn)以脫脂乳作為發(fā)酵底物時的ACE抑制率比乳清高一倍（P<0.05），這表明乳酸菌酶解酪蛋白時生產(chǎn)的ACE肽在效果上比乳清蛋白強。試驗發(fā)現(xiàn)荷斯坦脫脂乳和水牛脫脂乳發(fā)酵后的ACE抑制率無顯著性差異（P＞0.05），原因可能是牛乳蛋白的序列具有很大的同源性。因此，考慮到經(jīng)濟成本，荷斯坦脫脂乳更適合作為菌株的發(fā)酵底物。其中的降壓肽的分離及功效評定仍需進一步研究確定。

4 結(jié)論

本研究通過比較蛋白水解度、ACE抑制率、模擬胃腸消化后的ACE抑制率，篩選到2株富產(chǎn)抗消化ACE抑制肽的乳酸菌，分別是羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09和瑞士乳桿菌ZJUIDS11，ACE抑制率分別為87.39%±2.44%和90.41%±0.99%，IC50值分別為0.31和0.25 mg/mL。在益生特性方面，兩株菌對酸和膽鹽都有良好的耐受性，且不具備耐藥性，對人體健康不存在潛在威脅。經(jīng)過底物篩選比較得，這兩株菌的最佳發(fā)酵底物為荷斯坦脫脂乳。研究結(jié)果表明羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09和瑞士乳桿菌ZJUIDS11發(fā)酵乳產(chǎn)ACE抑制肽的能力較好，具有開發(fā)降壓發(fā)酵乳制品的潛力。