紅曲廢渣發(fā)酵制備枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑

張 晨，王 揚，楊 新，潘丹丹，胡文林，時祥柱，陳炳鈿，羅春連，倪 莉,

（1.福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建福州 350108；2.福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，福建福州 350108；3.福州大學(xué)食品營養(yǎng)與健康研究中心，福建晉江 362251；4.廣東省天益生物科技有限公司，廣東湛江 524300；5.福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司，福建福州 350008；6.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350012；7.福建省工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)許可證審查技術(shù)中心，福建福州 350013）

紅曲廢渣是紅曲霉液態(tài)發(fā)酵并經(jīng)色素提取后剩余的殘渣，其中含有約40%碳水化合物、25%蛋白質(zhì)、2.5%脂類以及少量的紅曲色素、麥角固醇和殼聚糖等活性物質(zhì)[1?3]。充分挖掘紅曲廢渣的應(yīng)用價值，符合我國發(fā)展可持續(xù)性食品產(chǎn)業(yè)的戰(zhàn)略。

我國每年紅曲廢渣的產(chǎn)量近萬噸[4?6]，但當(dāng)前紅曲廢渣的開發(fā)應(yīng)用較少，主要用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料[7]或作為原材料提取莫納克林K和γ-氨基丁酸[8]等活性物質(zhì)。然而，紅曲廢渣不易消化吸收，直接用于動物飼料時料肉比較低[7,9]；紅曲廢渣處理后仍保留大量營養(yǎng)物質(zhì)，將其用于功能性物質(zhì)提取，存在富營養(yǎng)污染的風(fēng)險。相比之下，若以枯草芽孢桿菌發(fā)酵紅曲廢渣并將其制成微生態(tài)制劑，可充分利用紅曲廢渣中的營養(yǎng)成分，以實現(xiàn)廢棄物的綠色高效利用。一方面，枯草芽孢桿菌是國際公認(rèn)的可直接添加在動物飼料中的益生菌[10?11]，具有調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道生態(tài)平衡[12?14]、促進(jìn)生長[15?16]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[17?19]等多種功效，可用于制備具有保健功能的微生態(tài)制劑。另一方面，紅曲中的營養(yǎng)成分，包括碳水化合物與蛋白質(zhì)，可被枯草芽孢桿菌降解、利用，并生成具有較強(qiáng)抗氧化性的代謝物質(zhì)[20?22]。

為了充分利用紅曲廢渣，本研究將其作為原料，發(fā)酵制備枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑。通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化確定最佳發(fā)酵條件；測定發(fā)酵過程中可溶性糖含量的變化，分析枯草芽孢桿菌對紅曲廢渣中可溶性糖和蛋白質(zhì)的利用情況；利用加速貯藏實驗評價微生態(tài)制劑中枯草芽孢桿菌活菌的儲藏穩(wěn)定性；對微生態(tài)制劑中可溶性成分的抗氧化性進(jìn)行評估（包括鐵還原力、DPPH自由基和羥自由基的清除能力）。為充分挖掘紅曲廢渣的價值，發(fā)展可持續(xù)性食品產(chǎn)業(yè)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌（FZU.SWJS03） 福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所篩選獲得；紅曲廢渣 廣東省天益生物科技有限公司提供，干燥的紅曲廢渣經(jīng)100目篩網(wǎng)后，4 ℃密封保存；D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖 色譜純，源葉生物有限公司；甲醇 分析純，德國MERCK公司；其他分析純試劑 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

THZ-82型恒溫震蕩器 常州國華電器有限公司；XPN-100/90/80型高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特儀器有限公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海名元實業(yè)有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州蒙特儀器制造有限公司；UV-2000型紫外可見分光光度計 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SH220F石墨消解儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；Agilent 6890 A高效氣相色譜儀 安捷倫有限公司；Kjeltec 8400 型全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯集團(tuán)公司。

1.2 枯草芽孢桿菌的發(fā)酵

1.2.1 枯草芽孢桿菌種子液的制備 配制普通液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L），用0.1 mol/L NaOH溶液將培養(yǎng)基的初始pH調(diào)節(jié)至7.2。在37 ℃下恒溫培養(yǎng)枯草芽孢桿菌12 h，使其達(dá)到指數(shù)生長期，然后將在枯草芽孢桿菌指數(shù)生長期的菌液離心并用無菌生理鹽水（9 g/L NaCl溶液）洗滌兩次。將重懸菌液的濃度調(diào)節(jié)至5 lg CFU/mL，制備枯草芽孢桿菌種子液。

1.2.2 單因素實驗 將紅曲廢渣和去離子水在250 mL三角燒瓶中充分混合后，在121 ℃下高壓滅菌20 min。固定接種量為3.0 mL種子液，以紅曲廢渣濃度100 g/L、枯草芽孢桿菌接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min、發(fā)酵時間48 h為固定參數(shù)，設(shè)計單因素實驗。依次改變發(fā)酵時間0、6、12、18、24、30、36、42、48 h、紅曲廢渣濃度50、75、100、125、150 g/L、枯草芽孢桿菌接種量5%、10%、15%、20%、25%、以及搖床轉(zhuǎn)速160、180、200、220、240 r/min，固定其他基本實驗條件，測定在37 ℃條件下對枯草芽孢桿菌生長的影響（活菌數(shù)的變化）。

1.2.3 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果和Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以枯草芽孢桿菌活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，以紅曲廢渣濃度（A）、枯草芽孢桿菌接種量（B）和搖床轉(zhuǎn)速（C）為自變量，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗對發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。試驗方案如表1所示。

表1 中心組合設(shè)計的因素水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken Design (BBD)

1.3 測定方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌活菌數(shù) 在無菌條件下準(zhǔn)確量取1.0 mL待測樣，取1.0 mL發(fā)酵液依次進(jìn)行10倍稀釋至合適倍數(shù)，平板涂布后進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，24 h后觀察計數(shù)。

1.3.2 可溶性蛋白測定 每隔6 h取發(fā)酵液，5000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液置于消化管中，加入3.0 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅和10.0 mL濃硫酸，然后在石墨消解儀中消化，待消化完全后，冷卻至室溫并在全自動凱氏定氮儀中進(jìn)行消化，最后用稀鹽酸溶液滴定。實驗依據(jù)GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法和全自動凱氏定氮儀測定可溶性糖含量。

1.3.3 可溶性糖測定 每隔6 h取發(fā)酵液，5000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液按照GB 5009.7-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》中的苯酚硫酸法進(jìn)行測定。

1.3.4 單糖組成分析 每隔6 h取發(fā)酵液，5000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液于密封的玻璃管中，移入2.0 mL三氟乙酸溶液（TFA，2 mol/L），密封振蕩均勻，在120 ℃條件下水解5 h。反應(yīng)結(jié)束后，利用氮吹儀吹干（水浴溫度設(shè)置為70 ℃），加入 3.0 mL色譜級甲醇重復(fù)若干次，直至除盡三氟乙酸為止，備用。

1.2.6 Western blot 將細(xì)胞用胰酶消化后用細(xì)胞裂解液裂解，離心后收集上清，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸8 min，用10% SDS-PAGE電泳后，在100 V恒壓條件下將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；將PVDF膜用含有0.2%Tween20的TBS緩沖液(TBST)洗滌后用含有5%脫脂奶粉的TBST 37 ℃封閉30 min；將第一抗體用TBST緩沖液稀釋后，與PVDF膜一同裝入雜交袋中，4 ℃過夜；TBST洗滌后將HRP標(biāo)記的二抗與PVDF膜一同裝入新的雜交袋中，室溫?fù)u床上放置30 min或者1 h；TBST緩沖液洗滌后進(jìn)行ECL發(fā)光檢測。

分別稱量10.0 mg的阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸單糖于密封的玻璃管中，依次加入鹽酸羥胺10.0 mg， 內(nèi)標(biāo)物肌醇10.0 mg和吡啶1.0 mL，于90 ℃水浴鍋中振蕩反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束冷卻，在相同條件下加入1.0 mL醋酸酐進(jìn)行乙?；玫教请嬉宜狨サ难苌?。冷卻，加入適量的甲醇，70 ℃下氮吹，反復(fù)3～4次除去乙酸酐和吡啶。混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品（含各單糖1.0 mg）與經(jīng)三氟乙酸水解后的樣品均按上述步驟處理后加入1.5 mL色譜級甲醇溶解。將樣品經(jīng)0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜過濾后，注入色譜進(jìn)樣瓶，通過氣相色譜以RTX-1701石英毛細(xì)管（0.25 μm×30.0 m）和氫火焰離子化檢測器（FID）分析單糖組分。程序升溫：180～220 ℃（5 ℃/min）， 220 ℃（5 min），220～280 ℃（10 ℃/min）；載氣：氮氣（1.0 mL/min）；進(jìn)樣量：1.0 μL。以肌醇作為內(nèi)標(biāo)，通過各組分峰面積計算其含量。

1.3.5 儲藏穩(wěn)定性 收集優(yōu)化發(fā)酵后的枯草芽孢桿菌活菌制劑，將其初始濃度調(diào)整為4.1×109CFU/mL。參考朱征宇等的方法[23]，分別在30、37、50、60 ℃下對微生態(tài)制劑進(jìn)行加速貯藏實驗，測定枯草芽孢桿菌活菌數(shù)以考察穩(wěn)定性。微生物的失活速率與菌種特性所處的營養(yǎng)條件及溫度有關(guān)，其失活過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)?？杀硎緸椋?/p>

式中：N0表示初始活菌數(shù)，CFU/mL；Nt表示t時刻殘存活菌數(shù)，CFU/mL；k表示失活常數(shù)，h?1；t表示失活時間，h。

同時，不同溫度下的失活常數(shù)k與溫度T的動力學(xué)關(guān)系符合Arrhenius方程，其對數(shù)形式為：

可利用該公式計算不同溫度下的失活常數(shù)k。式中：A為Arrhenius常數(shù)（通過不同溫度條件下測定失活常數(shù)k并繪制擬合趨勢線，由其X軸截距=lgA計算而得）；E表示微生物失活所需的活化能，4.186 J/mol；R為摩爾氣體常數(shù)，8.314 J/mol·K；T表示溫度，K。

菌株的存活率可表示為：

1.3.6 抗氧化性 參考黃夢姣[24]測定鐵還原力、DPPH·和羥自由基（·OH）清除能力的方法，略作修改后測定枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑溶液的抗氧化性。將1.0 mL發(fā)酵液與10.0 mL 50%甲醇充分混勻，在25 ℃暗室中浸泡6 h后用濾紙過濾，將濾過液定容至10.0 mL備用。

1.3.6.1 鐵還原力 在1.0 mL不同體積濃度（20%、40%、60%、80%、100% ，v/v）的樣品（枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的可溶性物質(zhì)濃度分別為0.04、0.09、0.17、0.34、0.51、0.68、0.85 mg/mL）中加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）和2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀溶液并混合均勻，50 ℃恒溫水浴20 min。取出快速冷卻后，再加入2.5 mL 100 g/L 三氯乙酸溶液，并以3000 r/min離心10 min。取上清液加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1 g/L FeCl3溶液靜置10 min后于700 nm處測定其吸光值。以鐵氰化鉀溶液當(dāng)量（mmol/L）表示樣品的抗氧化能力，并將其抗氧化效果與0.1 mg/mL維生素C溶液進(jìn)行對比。

1.3.6.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力 取1.0 mL不同體積濃度（20%、40%、60%、80%、100% ，v/v）的樣品（枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的可溶性物質(zhì)濃度分別為0.04、0.09、0.17、0.34、0.51、0.68、0.85 mg/mL）與2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·醇溶液混合，避光孵育30 min后，于517 nm處測定其吸光值（AS1）。在同樣條件下，以樣品與等體積的無水乙醇混合作為樣品空白，測定其吸光值（AS0）；以2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·醇溶液與等體積的無水乙醇混合作為對照，測定其吸光值（AC）。根據(jù)下列公式計算枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑溶液對DPPH·的清除率，并將其效果與0.1 mg/mL維生素C溶液進(jìn)行對比。

式中：AS1、AS0、AC分別表示樣品、樣品空白、空白對照的吸光值。

1.3.6.3 羥自由基（·OH）清除能力 將1.0 mL 9 mmol/L FeSO4和1.0 mL 9 mmol/L水楊酸溶液混合后，分別加入0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mL樣品（枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的可溶性物質(zhì)濃度分別為0.04、0.09、0.17、0.34、0.51、0.68、0.85 mg/mL），再加入1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃下反應(yīng)30 min后，在510 nm處測定其吸光值（AS1）。在同樣條件下，用1.0 mL蒸餾水代替H2O2溶液作為樣品空白，測定吸光值（AS0）；以1.0 mL蒸餾水代替樣品作為空白對照，測定其吸光值（AC）。根據(jù)下列公式計算待測枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑溶液對·OH的清除率，并將其效果與0.4 mg/mL維生素C溶液進(jìn)行對比。

式中：AS1、AS0、AC分別表示樣品、樣品空白、空白對照的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行回歸模型的建立和單因素方差分析。若無特別說明，以上所有實驗數(shù)均重復(fù)3次，通過Excel計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵紅曲廢渣的單因素實驗

通過單因素實驗對枯草芽孢桿菌的生長條件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。圖1a顯示隨著發(fā)酵時間的增加，枯草芽孢桿菌發(fā)酵紅曲廢渣的活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢，在發(fā)酵30 h后基本進(jìn)入平穩(wěn)期，最大活菌數(shù)為8.8 lg CFU/mL。為保證發(fā)酵完全，在后續(xù)實驗中固定發(fā)酵時間為48 h。圖1b～d分別顯示紅曲廢渣濃度、枯草芽孢桿菌接種量以及搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌生長量的影響，結(jié)果表明在這三個變量數(shù)值增大的過程中，枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。紅曲廢渣在濃度為100 g/L時，活菌數(shù)達(dá)到最大值，為9.3 lg CFU/mL（圖1b）。紅曲廢渣濃度較低時，提高原料濃度可以為菌生長提供充足的碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)；然而當(dāng)其濃度過高時，培養(yǎng)基的流動性變差，傳質(zhì)效率降低，進(jìn)而使得枯草芽孢桿菌生長受限。當(dāng)枯草芽孢桿菌的接種量為10%時，活菌數(shù)達(dá)到最大值，為9.2 lg CFU/mL（圖1c）。初始接種量小于10%時，會延長枯草芽孢桿菌增殖到峰值的時間；而初始接種量過大會使其快速吸收營養(yǎng)物質(zhì)，迅速增殖導(dǎo)致溶氧量不足，反而使其增殖受限。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min時，活菌數(shù)達(dá)到最大值9.3 lg CFU/mL（圖1d）。這是由于搖瓶里的溶氧量隨搖瓶轉(zhuǎn)速的提高而上升，較多的氧氣可以促進(jìn)枯草芽孢桿菌增殖；而轉(zhuǎn)速過大時，枯草芽孢桿菌的流動過于劇烈反而造成菌體的死亡。為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，選擇紅曲廢渣濃度為75～125 g/L，枯草芽孢桿菌接種量為5%～15%、搖床轉(zhuǎn)速為200～240 r/min進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面實驗設(shè)計。

圖1 發(fā)酵時間（a）、紅曲廢渣濃度（b）、枯草芽孢桿菌接種量（c）和搖床轉(zhuǎn)速（d）對枯草芽孢桿菌產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of fermentation time (a), Hongqu residue concentration (b), inoculation amount of Bacillus subtilis (c),shaker speed (d) on the yield of Bacillus subtilis

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵紅曲廢渣條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇紅曲廢渣濃度（A），接種量（B），搖床轉(zhuǎn)速（C）為自變量，以枯草芽孢桿菌的總活菌數(shù)為響應(yīng)值（R），設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，在17個不同試驗組合的條件下，試驗設(shè)計方案見表2。

使用Design-Expert 8.0軟件對表2實驗結(jié)果進(jìn)行二次多項式回歸擬合和回歸方程的方差分析（表3），得到二次多項式回歸方程：

表2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵紅曲廢渣的響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Response surface test design of Hongqu residue fermented by Bacillus subtilis

回歸方程的決定系數(shù)R2為0.99，其方差分析（見表3）的顯著性檢驗表明，該回歸模型P<0.0001，方程模擬表現(xiàn)極顯著，失擬項P=0.0592>0.05，不顯著，模型擬合良好，可用于紅曲廢渣培養(yǎng)枯草芽孢桿菌工藝優(yōu)化預(yù)測。其中紅曲廢渣濃度、搖床轉(zhuǎn)速對活菌數(shù)的影響均高度顯著，三種因素對活菌數(shù)影響的排序為紅曲廢渣濃度（A）>搖床轉(zhuǎn)速（C）>枯草芽孢桿菌接種量（B），并且一次項A、C，交互項AB、AC、BC，二次項A2、B2、C2對枯草芽孢桿菌總活菌數(shù)的影響極顯著（P<0.01）。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA of regression equation

2.2.2 交互作用分析 為了更為直觀的說明三種因素間的交互作用對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響，通過回歸方程繪制響應(yīng)面的3D曲面圖和等高線圖，考察相應(yīng)的擬合曲面。如圖2所示，三個參數(shù)兩兩間的3D曲面均開口向下且等高線均呈橢圓形，表明三種因素兩兩之間存在交互作用，且存在兩兩間的最適組合使得總活菌數(shù)最高；其中，接種量對活菌數(shù)的影響大于紅曲廢渣濃度，另外兩種因素的交互作用對活菌數(shù)的影響程度相近。

圖2 兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響Fig.2 Influence of interaction of two factors on response value

2.2.3 驗證實驗 通過響應(yīng)面回歸模型及軟件分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件：紅曲廢渣濃度102 g/L，枯草芽孢桿菌接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速為224 r/min，預(yù)測可獲得的最大活菌數(shù)為9.3 lg CFU/mL?？紤]到實際條件，將驗證實驗的發(fā)酵條件修正為紅曲廢渣濃度100 g/L，枯草芽孢桿菌接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min。在此條件下重復(fù)三次實驗，枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為（9.3±0.3） lg CFU/mL，與理論預(yù)測值基本一致，說明回歸模型可靠，模型的預(yù)測值能較好地反映發(fā)酵過程實際的活菌數(shù)。因此，對該菌株發(fā)酵條件的研究，可為其進(jìn)一步放大乃至工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

2.3 枯草芽孢桿菌生長過程中發(fā)酵液營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

跟蹤發(fā)酵液中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)的含量和活菌數(shù)的變化的相關(guān)性分析影響枯草芽孢桿菌生長的關(guān)鍵成分，結(jié)果如圖3所示。在搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，37 ℃條件下，當(dāng)發(fā)酵時間為30 h時，枯草芽孢桿菌的增長進(jìn)入平穩(wěn)期，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量分別從2.40和2.50 g/L降低至0.24和0.70 g/L?？扇苄蕴堑南妮^大，推測其含量是枯草芽孢桿菌的生長的主要限制因素。為進(jìn)一步分析枯草芽孢桿菌對營養(yǎng)物質(zhì)具體單糖的利用情況，對發(fā)酵液中的單糖含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，葡萄糖、甘露糖和半乳糖的含量與菌量的增加密切相關(guān)。從圖3可看出，當(dāng)葡萄糖、甘露糖和半乳糖逐步被使用完時，其生長基本停止。葡萄糖是枯草芽孢桿菌優(yōu)先使用的碳源，也是其增殖的關(guān)鍵。在發(fā)酵時間為6 h時，葡萄糖含量從0.96 g/L降低到0.73 g/L，甘露糖和半乳糖的含量基本沒有變化，此時菌量從5.0 lg CFU/mL增長到5.3 lg CFU/mL。發(fā)酵6～12 h的過程中，菌量增長了141倍，葡萄糖含量降低至0.23 g/L，而甘露糖和半乳糖的含量變化較小。可見說明葡萄糖是限制枯草芽孢桿菌的生長的主要因素，可通過額外添加葡萄的含量，進(jìn)一步提高紅曲廢渣的利用率。

圖3 發(fā)酵液可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和活菌數(shù)隨發(fā)酵時間的變化Fig.3 Variation of the amount of soluble sugar, soluble protein and viable bacteria during fermentation

2.4 枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的儲藏穩(wěn)定性分析

通過測定枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在不同存放溫度下的活菌數(shù)變化，評估其儲藏穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。不同溫度下，微生態(tài)制劑活菌數(shù)變化的擬合直線分別為：30 ℃，lgNt=?0.0009t+9.6，R2=0.88；37 ℃，lgNt=?0.0019t+9.6，R2=0.87；50 ℃，lgNt=?0.0035t+9.6，R2=0.98；60 ℃，lgNt=?0.0078t+9.6，R2=0.95。在四種不同的儲藏溫度條件下，枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢，且下降幅度與溫度的增加有正相關(guān)性。初始濃度為9.6 lg CFU/mL的枯草芽孢桿菌在30、37、50和60 ℃下儲藏120 h后，枯草芽孢桿菌的存活率分別為75.6%、56.1%、36.6%和8.9%。利用圖4中的數(shù)據(jù)可進(jìn)一步分析在其他溫度下，微生態(tài)制劑的儲藏穩(wěn)定性。首先，通過公式（1）分別計算出不同溫度下的失活常數(shù)k（k30℃= 0.0020（h?1）、k37℃=0.0044（h?1）、k50℃= 0.0081（h?1）、k60℃= 0.0180（h?1））。然后，再根據(jù)公式（2）將k與溫度T作lgk-1/T圖，作線性回歸，可得回歸方程：lgk=?2960.2/T?7.1。根據(jù)此方程可計算出在常溫20 ℃條件下，微生態(tài)制劑的失活常數(shù)k20℃= 0.0010（h?1）。以此失活常數(shù)計算微生態(tài)制劑在20 ℃下保存三個月，微生態(tài)制劑的活菌數(shù)為8.7 lg CFU/mL，符合微生態(tài)制劑的活菌數(shù)要求[25?26]。

圖4 不同溫度對微生態(tài)制劑活菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of different temperatures on viable cell count of microbioecologics

2.5 枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的抗氧化性評估

將微生態(tài)制劑中的可溶性成分進(jìn)行分離，并測定其抗氧化性，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑可溶性成分的鐵還原力、DPPH·和羥自由基的清除能力均與可溶性成分的濃度呈量效關(guān)系。微生態(tài)制劑具有一定的抗氧化能力，其中DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。微生態(tài)制劑可溶性成分的鐵還原力為0.97 mmol/L，約為0.09維生素C當(dāng)量（g/g），優(yōu)于枯草芽孢桿菌N2?10（0.59 mmol/L）[27]；DPPH自由基清除能力為0.25 mg/mL（IC50），約為0.08維生素C當(dāng)量（g/g）；羥自由基清除能力為0.69 mg/mL（IC50），約為0.23維生素C當(dāng)量（g/g）（圖5a～5c）?？梢?，通過紅曲廢渣制備的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑具有較強(qiáng)的抗氧化能力。尤其是在DPPH自由基的清除能力方面，可有效減輕自由基對機(jī)體的損傷，維持機(jī)體健康。其原因一方面可能是由于紅曲廢渣中含有的色素、多糖、酚類等多種抗氧化成分[28]，另一方面可能是枯草芽孢桿菌代謝過程中產(chǎn)生的抗氧化活性肽[20?21,29?30]等成分共同作用的結(jié)果。

圖5 枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的抗氧化性Fig.5 Antioxidant activity of Bacillus subtilis microbioecologics

3 結(jié)論

以紅曲廢渣為原料制備枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，通過單因素實驗和響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)的發(fā)酵條件為發(fā)酵時間48 h，紅曲廢渣濃度100 g/L，枯草芽孢桿菌接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，枯草芽孢桿菌的最大產(chǎn)量為（9.3±0.3）lg CFU/mL。該體系中可溶性糖是限制枯草芽孢桿菌生長的主要因素?？莶菅挎邨U菌先利用葡萄糖，后利用甘露糖和半乳糖作為其生產(chǎn)所需的碳源。且該法獲得的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑穩(wěn)定性較高，在常溫下存放三個月后的活菌數(shù)為8.7 lg CFU/mL高于微生態(tài)制劑的應(yīng)用要求。所得微生態(tài)制劑具有較強(qiáng)的抗氧化性，其可溶性成分的鐵還原力為0.97 mmol/gL，約為0.09維生素C當(dāng)量（g/g）；DPPH自由基清除能力0.25 mg/mL（IC50），約為0.08維生素C當(dāng)量（g/g）；羥自由基清除能力為0.69 mg/mL（IC50），約為0.23維生素C當(dāng)量（g/g）。本研究證明紅曲廢渣可作為原料制備枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，為微生物發(fā)酵廢渣的可持續(xù)性綠色加工提供了實踐依據(jù)。