黑曲霉發(fā)酵牛蒡根的化學(xué)成分及對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用

田 盛，王 祎，吳德超，曲 揚(yáng)

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

牛蒡（Arctium lappa）在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用，牛蒡子作為解表藥被中國(guó)藥典收錄，牛蒡根主要作為蔬菜和茶飲食用，具有抗炎、抗腫瘤、降糖等多種活性[1?3]。牛蒡根中的綠原酸等咖啡酰基奎寧酸具有抑制胃腸道內(nèi)α-葡萄糖苷酶的作用，這可能是其具有降糖作用的機(jī)制之一[4?6]。綠原酸、咖啡酸等酚酸類化合物在植物體內(nèi)與細(xì)胞壁結(jié)合，因減少了其酯化程度和位點(diǎn)限制了其發(fā)揮生物活性[7?8]。

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，微生物產(chǎn)生的酶能夠?qū)⒅参镏械慕Y(jié)合型酚類化合物轉(zhuǎn)化為游離型，從而可以增強(qiáng)其活性[9?10]。黑曲霉（Aspergillusniger）作為常用發(fā)酵菌株可產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶、脂酶等多種酶，能夠分解細(xì)胞壁、降解食品原料中的成分，用于生產(chǎn)發(fā)酵食品[9,11]。發(fā)酵食品的生物活性的提升與其中化學(xué)成分的變化密切相關(guān)，例如以黑曲霉發(fā)酵牛蒡茶后，其中可溶性糖和總黃酮含量均提高，并產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，但對(duì)牛蒡根經(jīng)黑曲霉發(fā)酵前后的其他化學(xué)成分以及其對(duì)胃腸道消化酶的作用尚未見(jiàn)報(bào)道[12?16]。因此，本文對(duì)黑曲霉發(fā)酵牛蒡根中的化學(xué)成分以及其對(duì)α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的抑制作用進(jìn)行研究，為采用發(fā)酵手段提升食品的生物活性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡 采自山東臨沂，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為菊科、牛蒡?qū)僦参锱］颍ˋrctium lappa）的根，切片后自然風(fēng)干，粉碎后過(guò)3號(hào)篩備用；黑曲霉（編號(hào)41125） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；α-葡萄糖苷酶 Sigma化學(xué)公司；α-淀粉酶、可溶性淀粉、還原型谷胱甘肽、對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（pNPG） 上海阿拉丁試劑有限公司；葡萄糖、乙醇 天津大茂化學(xué)試劑廠；生理鹽水 山東齊都藥業(yè)有限公司；磷酸緩沖液（pH6.8） 北京索萊寶科技有限公司；甲醇 色譜級(jí)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)乙腈 Oceanpak Alexative Chemical；綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A標(biāo)準(zhǔn)品 四川維克奇生物生物技術(shù)有限公司；超純水 采用Mili-Q system自制。

UU2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HD-650型桌上臺(tái)式潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及孢子混懸液的制備 黑曲霉經(jīng)沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，以生理鹽水清洗瓊脂表面收集孢子混懸液。在波長(zhǎng)為600 nm下，用紫外分光光度儀測(cè)孢子混懸液的光密度（OD值），以超純水稀釋使OD值為2.0，備用。

1.2.2 黑曲霉發(fā)酵牛蒡根 牛蒡根粉70 g置于500 mL錐形瓶中，于120 ℃滅菌30 min后加入黑曲霉孢子混懸液30 mL以及70 mL無(wú)菌水。充分混勻后于28 ℃發(fā)酵20 d。每天取樣1 g，于120 ℃滅菌30 min、于烘箱中40 ℃烘干、保干器中保存，用于測(cè)定化學(xué)成分及酶抑制活性。

1.2.3 樣品提取 取發(fā)酵牛蒡樣品0.2 g以2 mL 95%乙醇超聲（400 W）提取30 min，上清液作為用于測(cè)定酶抑制活性的樣品溶液。另取1.5 mL上清液氮?dú)獯蹈珊笠?0 μL色譜甲醇渦旋復(fù)溶，14000 r/min離心10 min后取上清液用于HPLC測(cè)定。取發(fā)酵牛蒡樣品0.6 g以6 mL水超聲提取30 min，12000 r/min離心15 min后取上清液用于測(cè)定總糖。

1.2.4 酶抑制實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn) 采用pNPG法測(cè)定發(fā)酵牛蒡?qū)Ζ?葡萄糖苷酶的抑制作用[17]：空白管-加酶不加藥（A1）、空白對(duì)照管-不加酶不加藥（A2）、抑制管-加酶加藥（A3）、背景對(duì)照管-不加酶加藥（A4）。首先在各管中加入0.003 mol/L GSH 20 μL、0.0096 mol/L pNPG 50 μL，在3和4號(hào)管中加入50 μL樣品溶液；隨后在1～4號(hào)管中分別加入PBS （pH6.8）480、520、430、470 μL，于37 ℃孵育5 min；再在1和3號(hào)管中加入5 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液40 μL，繼續(xù)孵育20 min；最后在各管中加入590 μL乙醇終止反應(yīng)，于400 nm測(cè)定吸光度。抑制率（IP）以下式計(jì)算：

式中：A1～A4代表4個(gè)測(cè)定管的吸光度。

1.2.4.2α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn) 采用碘比色法測(cè)定發(fā)酵牛蒡?qū)Ζ?淀粉酶的抑制作用[7]：空白管-加酶不加藥（A1）、空白對(duì)照管-不加酶不加藥（A2）、抑制管-加酶加藥（A3）、背景對(duì)照管-不加酶加藥（A4）。首先在3和4號(hào)管中加入100 μL樣品溶液，1和2號(hào)管中加入等體積95%乙醇；1和3號(hào)管中加入50 U/μLα-淀粉酶100 μL，2和4號(hào)管中加入等體積PBS；隨后于37 ℃孵育10 min后于各管中加入5 g/L可溶性淀粉1000 μL，繼續(xù)孵育5 min后加入200 μL 終止液（含1%氯化銅（w/v）、0.37%鹽酸（v/v））；吸取反應(yīng)液200 μL，加入碘液（含0.012%碘（w/v）、0.3% KI（w/v）），充分搖勻后立即在580 nm 處測(cè)定吸光度。抑制率（IP）以下式計(jì)算：

式中：A1～A4代表4個(gè)測(cè)定管的吸光度。

1.2.5 化學(xué)成分分析及含量測(cè)定 于Agilent 1100高效液相色譜儀上測(cè)定發(fā)酵牛蒡的化學(xué)組成。色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）（v/v）梯度洗脫，洗脫梯度如下：0～10 min，3% B～10% B；11～15 min，10% B～16% B；16～25 min，16% B～22% B；26～30 min，22% B～26% B；31～50 min，25% B；51～61 min，25% B～55%B；61～75 min，55% B～90% B。流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm[18]。采用外標(biāo)法測(cè)定發(fā)酵牛蒡中的綠原酸、咖啡酸和異綠原酸A。綠原酸和異綠原酸A在3.3～1000 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，咖啡酸在3.3～330 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。綠原酸、咖啡酸和異綠原酸A的線性回歸方程分別為：Y=18525X?86.738（r=0.9999），Y=17290X+60.617 （r=0.9997），Y=22588X-23.476（r=0.9996）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡根發(fā)酵品對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性

未發(fā)酵的牛蒡根即對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制作用，抑制率為80%。牛蒡根對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率在發(fā)酵后提升。在發(fā)酵第1～3 d增加明顯，在第4～5 d抑制率緩慢增強(qiáng)，第6 d即增長(zhǎng)至90%，在隨后的發(fā)酵過(guò)程中，該抑制率基本保持在90%以上，并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率升高。在發(fā)酵第20 d，抑制率達(dá)到97.8%。未發(fā)酵的牛蒡根對(duì)α-淀粉酶的抑制率較低，僅為4.17%，在發(fā)酵后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率升高（見(jiàn)圖1A和1B），在發(fā)酵第20 d，抑制率達(dá)到32.1%。該結(jié)果表明可以通過(guò)調(diào)整發(fā)酵時(shí)間調(diào)節(jié)牛蒡根對(duì)兩種酶的抑制活性。牛蒡子中的咖啡?；鼘幩犷惓煞謱?duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用，其中5-O-咖啡?；鼘幩幔ňG原酸）和3, 5-O-二咖啡酰基奎寧酸（異綠原酸A）的抑制作用優(yōu)于3-O-咖啡?；鼘幩幔ㄐ戮G原酸）和3, 4-O-二咖啡?；鼘幩幔ó惥G原酸B）[19]，小鼠在體實(shí)驗(yàn)表明咖啡酸能夠抑制小鼠體內(nèi)α-葡萄糖苷酶活性[20]；此外，咖啡?？鼘幩犷愇镔|(zhì)能夠抑制α-淀粉酶的活性，雙咖啡酰基奎寧酸的效果優(yōu)于單取代咖啡?；鼘幩醄21]，綠原酸的半數(shù)抑制濃度（IC50）是咖啡酸的5倍[22]，牛蒡根經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用升高可能與該類成分的含量變化有關(guān)。

圖1 黑曲霉發(fā)酵牛蒡根對(duì)α-葡萄糖苷酶（A）和α-淀粉酶（B）的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of of Arctium lappa roots fermented by Aspergillus niger on α-glucosidase（A） and α-amylase （B）

2.2 牛蒡根發(fā)酵品的化學(xué)成分

2.2.1 HPLC分析牛蒡根發(fā)酵品的化學(xué)成分 采用HPLC分析牛蒡根發(fā)酵品中的化學(xué)成分，HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖2，共匹配出23個(gè)共有峰，各譜圖與對(duì)照譜圖的相似度在0.21～0.74，表明經(jīng)過(guò)黑曲霉發(fā)酵后牛蒡根中的化學(xué)成分發(fā)生變化。將譜圖信號(hào)轉(zhuǎn)換為包含峰面積和保留時(shí)間數(shù)據(jù)表進(jìn)行PCA和PLS-DA等多元統(tǒng)計(jì)分析。

圖2 牛蒡根發(fā)酵品的指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of fermented Arctium lappa root

2.2.2 牛蒡根發(fā)酵品化學(xué)成分的PCA分析 對(duì)牛蒡根發(fā)酵品中的化學(xué)成分進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)各樣品在圖中的分布情況可知，牛蒡根發(fā)酵品依其化學(xué)組成及發(fā)酵時(shí)間可大致分為三組，即第一組（1～5 d）、第二組（6～14 d）、第三組（15～20 d）。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行PLS-DA分析，表明峰8、9、14的VIP值較大（見(jiàn)圖4），是區(qū)分不同發(fā)酵階段牛蒡根發(fā)酵品的主要成分。通過(guò)與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，將峰8、9、14確認(rèn)為綠原酸、咖啡酸和異綠原酸A。牛蒡根在發(fā)酵后對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用發(fā)生變化可能與這些化學(xué)成分有關(guān)。

圖3 牛蒡根發(fā)酵品化學(xué)成分的PCA分析（R2X：0.66, Q2：?0.0345）Fig.3 Principal component analysis (PCA) scores plots A for fermented Arctium lappa(R2X: 0.66, Q2: ?0.0345)

圖4 牛蒡根發(fā)酵品化學(xué)成分PLS-DA分析中的VIP值Fig.4 Variables with VIP values generated from PLS-DA of fermented Arctium lappa

2.2.3 牛蒡根發(fā)酵品中綠原酸、咖啡酸和異綠原酸A的含量測(cè)定 牛蒡根發(fā)酵品中的綠原酸、咖啡酸和異綠原酸A的含量變化趨勢(shì)如圖5所示。綠原酸的含量在牛蒡根發(fā)酵過(guò)程中逐漸升高，從最初的0.26 mg/g（0 d） 升至0.54 mg/g（18 d），隨后略有降低。在未發(fā)酵的牛蒡根中咖啡酸的含量?jī)H為0.003 mg/g，遠(yuǎn)低于綠原酸的含量；在發(fā)酵的第4 d，咖啡酸含量即升至0.22 mg/g，并且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不斷升高，在第20 d，達(dá)到0.44 mg/g。異綠原酸A的含量在未發(fā)酵牛蒡根中為0.56 mg/g，在發(fā)酵的第11 d升至0.69 mg/g，隨后保持在0.62～0.68 mg/g之間。與綠原酸和咖啡酸不同的是，異綠原酸A的含量升高趨勢(shì)不如綠原酸和咖啡酸明顯。由于異綠原酸A是由兩分子咖啡酸和一分子奎寧酸組成，并且可以分解為綠原酸，因此在發(fā)酵過(guò)程中釋放出的異綠原酸A有可能分解為咖啡酸或綠原酸，導(dǎo)致其含量上下波動(dòng)[23?24]。

圖5 牛蒡根發(fā)酵品中的綠原酸、咖啡酸和異綠原酸A的含量Fig.5 Contents of chlorogenic acid, caffeic acid, and isochlorogenic acid A in fermented Arctium lappa

2.3 牛蒡根發(fā)酵品對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性與化學(xué)成分相關(guān)性分析

前兩部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛蒡根經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的提升與綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A以及糖含量變化有關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，牛蒡根發(fā)酵品對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用與綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A含量極顯著相關(guān)（P<0.01）（見(jiàn)圖6）。對(duì)牛蒡子中的α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選結(jié)果表明，咖啡酰基奎寧酸類成分是牛蒡子的降糖成分，在體外實(shí)驗(yàn)中異綠原酸A的活性最強(qiáng)，而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中綠原酸的活性最佳[19]。綠原酸和異綠原酸A在體內(nèi)約有1/3被吸收入血，

圖6 牛蒡根中化學(xué)成分與α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性相關(guān)性Fig.6 Correlation between AL chemical composition and α-glucosidase and α-amylase inhibitory

此外還可在小腸中糖苷酶和酯酶的作用下生成奎寧酸和咖啡酸[25?27]?？Х人崮芙档?型糖尿病大鼠的空腹血糖[28]。發(fā)酵牛蒡根對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用的增強(qiáng)與牛蒡根經(jīng)發(fā)酵后綠原酸、咖啡酸以及異綠原酸A等酚酸類成分的含量升高有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道的該類成分在體內(nèi)體外模型中具有降糖活性的研究結(jié)果相吻合。相關(guān)性分析結(jié)果表明黑曲霉發(fā)酵牛蒡根的酶抑制活性變化與其化學(xué)成分變化相關(guān)，二者均與發(fā)酵時(shí)間有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的黑曲霉發(fā)酵牛蒡根中的化學(xué)成分及其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用進(jìn)行研究。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，牛蒡根對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高可提升17.8%（20 d），對(duì)α-淀粉酶的抑制率可提升27.9%（20 d），綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A的含量分別可達(dá)到發(fā)酵前的2.1（18 d）、148.7（20 d） 和1.2（11 d）倍，相關(guān)性分析結(jié)果表明牛蒡根對(duì)α-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制作用與該三個(gè)成分的含量相關(guān)?？刂瓢l(fā)酵時(shí)間能夠使牛蒡根對(duì)α-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制活性提升。此外，綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A的含量在牛蒡根發(fā)酵初期明顯升高，因此牛蒡根發(fā)酵品也可作為咖啡酰基奎寧酸的制備原料。