基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的雙氫楊梅樹皮素抗金黃色葡萄球菌活性和作用機制研究

鄧浩健，曾春暉，陳益清，王 溢，吳 光，韋海宏，張文濤，楊 柯

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530200）

由于抗生素的廣泛使用，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）的耐藥性逐漸增強，研究發(fā)現(xiàn)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-sensitiveS.aurues，MRSA）對β-內(nèi)酰胺類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、第三代喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率均大于50%[1]。生物被膜是細菌為逃避藥物對其殺滅和適應(yīng)環(huán)境變化的一種特殊膜樣物[2?3]，國內(nèi)外臨床實踐和研究結(jié)果表明，SA產(chǎn)生生物被膜，既可以保護細菌不受抗生素作用，導(dǎo)致SA耐藥[4?5]，又可以降低機體的免疫功能和細胞吞噬功能，從而逃避宿主免疫，致使感染難以治愈[6?7]。因此，尋找能夠控制和治療SA生物被膜感染的藥物成為當前研究的熱點[8]。

藤茶（Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang），是廣西一種資源豐富的野生壯藥，2013年被國家衛(wèi)計委批準為新資源食品[9]，其主要成分為黃酮類化合物，其中雙氫楊梅樹皮素（Ampelopsin, APS）又稱二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY）含量最高，具有抗菌消炎、增強免疫的藥理作用[10]，但目前對APS的抗菌活性作用機制研究甚少。本課題組前期已完成藤茶提取物及APS初步抗菌機制研究，結(jié)果表明APS對MRSA、標準SA等臨床常見致病菌均有極高的抗菌活性，且優(yōu)于陽性對照藥鹽酸黃連素[11]。此外，課題組研究結(jié)果還表明，藤茶提取物總黃酮可通過降低細菌表面疏水性，減弱其黏附性，增加細菌通透性使細菌形態(tài)發(fā)生改變，并通過抑制細菌脫氫酶活性發(fā)揮抗菌作用[12]；細菌耐藥性誘導(dǎo)實驗表明，APS不易誘導(dǎo)標準SA產(chǎn)生耐藥[13]。

本研究將在前期基礎(chǔ)上，通過體外抗菌活性的考察，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“化合物-靶點-靶點互作”網(wǎng)絡(luò)，尋找APS潛在的抗菌靶點，探究其抗菌作用特點及機制，為后續(xù)實驗提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

MSSA ATCC 25923（標準不產(chǎn)膜菌）、MRSA ATCC 6538（標準產(chǎn)膜菌株） 廣東省微生物菌種保藏中心，受試菌株分別由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、廣西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科臨床分離提供，其中，MSSA-4（不產(chǎn)膜敏感金黃色葡萄球菌）、MRSA-6（不產(chǎn)膜耐藥金黃色葡萄球菌）、MSSA-11（產(chǎn)膜敏感金黃色葡萄球菌）、MRSA-12（產(chǎn)膜耐藥金黃色葡萄球菌）作為本次實驗的受試菌進行后續(xù)研究；雙氫楊梅樹皮素（APS） 由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室提供，系從廣西藤茶莖葉中分離提取，純度≥98%，為灰白色粉末；青霉素鈉、苯唑西林鈉、頭孢西丁鈉、亞胺培南西司他丁鈉 中國食品藥品鑒定研究院；水解酪蛋白（MH）瓊脂、MH肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白胨大豆肉湯 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Spectramax M5型酶標儀 美國MD公司；HVZ-50型滅菌器 日本Hira Yama公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外抑菌實驗

1.2.1.1 實驗用藥物配制 稱取一定量的APS及四種抗生素，用無菌生理鹽水配制，0.22 μm針式過濾器過濾除菌即分別為藥物初始濃度，用倍比稀釋法將各藥配制成所需濃度，詳見表1～表4。

表1 各藥物對MSSA-4作用的濃度（μg/mL）Table 1 Concentration of the effect of each drug on MSSA-4 (μg/mL)

表4 各藥物對MRSA-12作用的濃度（μg/mL）Table 4 Concentration of the effect of each drug on MRSA-12 (μg/mL)

表2 各藥物對MSSA-11作用的濃度（μg/mL）Table 2 Concentration of the effect of each drug on MSSA-11 (μg/mL)

表3 各藥物對MRSA-6作用的濃度（μg/mL）Table 3 Concentration of the effect of each drug on MRSA-6 (μg/mL)

1.2.1.2 受試菌菌液制備 挑取受試菌菌落1～2個，接種于培養(yǎng)液中，35℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日收集菌液，1500 r/min離心5 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水校正濃度至0.5麥氏比濁標準，即得1×106CFU/mL。

1.2.1.3 APS及四種β-內(nèi)酰胺類抗生素對受試菌MIC的測定 采用連續(xù)稀釋法[14]，向96孔板各測定孔先加入100 μL無菌新鮮的MH肉湯，后取藥的最高濃度100 μL與第一孔培養(yǎng)基混合，反復(fù)吸放8次，吹打均勻，然后從混合液中取出100 μL至第二孔，如此反復(fù)直至第八孔，即第八個藥物濃度，每個藥物均設(shè)8個濃度，同時設(shè)置對照組。藥物加好后，分別向各孔內(nèi)加入100 μL相應(yīng)受試菌菌液，35℃恒溫培養(yǎng)18 h后每孔加入1%四氮唑（TTC）5 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后觀察各孔顏色變化，有細菌生長孔呈紅色，以不顯紅色孔的最低藥物濃度為MIC。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測APS潛在作用靶點及抗菌作用機制

1.3.1 APS結(jié)構(gòu)獲取及潛在作用靶點的垂釣 在PubChem數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索關(guān)鍵詞“Dihydroquercetin”獲得APS的化學(xué)結(jié)構(gòu)式及其結(jié)構(gòu)文件（sdf格式）；使用ChemDraw 3D繪制出APS相應(yīng)的三維結(jié)構(gòu)，使用MM2力場優(yōu)化后保存為mol2格式文件并上傳至PharmMapper服務(wù)器（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）進行APS的靶點預(yù)測分析，其中物種設(shè)置為人類，其他參數(shù)默認[15]。

1.3.2 抗菌靶點預(yù)測、關(guān)鍵蛋白靶點互作（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 以“Antibacterial”作為檢索詞輸入GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），檢索抗菌相關(guān)的基因靶點。將APS作用靶點與抗菌靶點取交集，將其導(dǎo)入STRING平臺（https://string-db.org/），設(shè)置物種為人，Interaction score≥0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出節(jié)點信息文件，為下步構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖做準備。

1.3.3 “化合物-靶點-靶點互作”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 在得到化合物結(jié)果及靶點信息的基礎(chǔ)上，采用Cytoscape 3.7.1軟件進行拓撲屬性分析，利用插件“Network Analysis”的功能進行分析，度值是反映一個節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性的指標，選取拓撲參數(shù)度值高于平均數(shù)的靶標作為關(guān)鍵靶標，以明確APS抗菌靶點之間的相互作用。

1.3.4 KEGG代謝通路和GO生物過程 利用Metascape平臺（https://metascape.org/）對篩選出的交集靶點進行GO生物功能富集分析和KEGG代謝通路富集分析，基因組中的所有基因作為富集背景。收集P<0.01（P值根據(jù)累積超幾何分布計算）、最小計數(shù)為3、富集因子>1.5（富集因子指觀察到的計數(shù)與偶然預(yù)期計數(shù)之間的比率），并根據(jù)其相似性進行分組。在對豐富項進行層次聚類時，采用Kappa評分作為相似度度量，相似度大于0.3的子樹被視為一個聚類，選擇聚類中統(tǒng)計意義最大的項來表示聚類。利用微生信網(wǎng)絡(luò)平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/），將篩選出的-lgP值降序前10作“GO富集分析柱狀圖”，-lgP值降序前15作“KEGG通路富集分析氣泡圖”。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進行一元多因素方差分析，采用F檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌實驗結(jié)果

2.1.1 APS及β-內(nèi)酰胺類抗生素對受試菌MIC的測定結(jié)果 APS對受試菌的MIC為62.50 μg/mL和125.00 μg/mL，β-內(nèi)酰胺類抗生素對受試菌的MIC在0.0125～400 μg/mL之間，進一步分析發(fā)現(xiàn)，APS對細菌是否存在生物被膜、細菌為敏感或耐藥菌的MIC值差別不大，而這些因素卻對β-內(nèi)酰胺類抗生素有較大影響，尤其是當兩因素疊加時，生物被膜陽性耐藥菌MIC甚至為生物被膜陰性敏感菌的4000倍，說明APS可能通過影響細菌生物被膜的形成而發(fā)揮較好的抗菌作用，而四種β-內(nèi)酰胺類抗生素對產(chǎn)膜菌的敏感性低于不產(chǎn)膜菌，說明耐藥性和生物被膜會降低細菌對四種β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，結(jié)果見表5、表6。

表5 APS及四種β-內(nèi)酰胺類抗生素對受試菌MIC的測定Table 5 Determination of APS and four β-lactam antibiotics on the MIC of tested bacteria

表6 APS及4種 β-內(nèi)酰胺類抗生素對產(chǎn)膜/不產(chǎn)膜受試菌MIC的比值Table 6 MIC ratios of APS and four β-lactam antibiotics on membrane-producing/non-membrane-producing subjects

2.1.2 細菌耐藥性和生物被膜對藥物MIC的交互效應(yīng) 多因素方差分析結(jié)果表明，APS對生物被膜影響的P<0.05，耐藥性的P=0.883>0.05，說明APS對受試菌的生物被膜影響顯著，且不受細菌耐藥性的影響，說明無論細菌敏感或耐藥APS均可通過影響生物被膜而發(fā)揮較好的抗菌作用，見圖1A。四種β-內(nèi)酰胺類抗生素對生物被膜的P=0.467>0.05，耐藥性的P=0.004<0.05（表7、表8），說明β-內(nèi)酰胺類抗生素對生物被膜無影響，且極易受到細菌耐藥性的影響，此外生物被膜的產(chǎn)生導(dǎo)致細菌對四種β-內(nèi)酰胺類抗生素受試菌的敏感性降低，見圖1B。

表7 APS主體間效應(yīng)檢驗結(jié)果Table 7 Results of the APS between-subjects effect test

表8 β-內(nèi)酰胺類抗生素主體間效應(yīng)檢驗結(jié)果Table 8 Results of inter subjects effect test for β-lactam antibiotics

圖1 耐藥性與生物被膜的交互效應(yīng)分析結(jié)果圖Fig.1 Results of the interaction effect analysis between drug resistance and biofilm

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果

2.2.1 APS的靶點預(yù)測及抗菌相關(guān)靶點的預(yù)測結(jié)果 經(jīng)PharmMapper服務(wù)器對APS進行潛在靶點預(yù)測，得到排名前300的靶標，其中已驗證的靶標284個。經(jīng)GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索“Anti-bacterial”，共找到1824個抗菌基因。將284個APS靶基因與1824個抗菌相關(guān)基因取交集，獲得APS-抗菌共同靶點123個，見圖2。

圖2 APS作用靶點與抗菌相關(guān)靶點的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of APS targets and antibacterial related targets

2.2.2 交集靶點PPI結(jié)果 將123個交集靶點導(dǎo)入STRING平臺，映射得到的PPI網(wǎng)絡(luò)中包含121個節(jié)點（2個靶點未參與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建）和1157條相互作用連線，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)，共篩選出43個度值超過平均值的關(guān)鍵靶點，用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其平均度值為23.5，平均介數(shù)為0.748，517條線代表了蛋白之間的相互作用，基因與鄰接基因連線數(shù)目越多，說明在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大，是網(wǎng)絡(luò)核心基因的可能性越大，很可能是APS發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵靶點，見圖3。

圖3 APS潛在抗菌靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of potential antibacterial targets of APS

2.2.3 “化合物-靶點-靶點互作”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果 篩選出43個度值超過平均值的關(guān)鍵靶點，黃色節(jié)點表示藤茶的有效成分APS，綠色節(jié)點代表交集靶點基因；圖中節(jié)點的度值越大，形狀越大，深綠色節(jié)點代表度值均值以上的重要基因，其中degree值前十個靶點為ALB（degree=79）、AKT1（degree=77）、MMP9（degree=62）、MAPK1（degree=60）、CASP3（degree=57）、IGF1（degree=57）、MAPK8（degree=56）、HRAS（degree=48）、BCL2L1（degree=43）、ESR1（degree=43），提示這些靶點在APS的抗菌機制中發(fā)揮重要作用，見圖4。

圖4 “化合物-靶點-靶點互作”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 "Compound-target-target interaction"network diagram

2.2.4 GO生物功能和KEGG代謝通路富集分析結(jié)果 抗菌交集靶點借助Metascape平臺進行分析，GO富集分析各篩選出前十條，其中APS抗菌主要涉及的生物學(xué)過程（Biological process）有：對肽的反應(yīng)（response to peptide）、對細菌的反應(yīng)（response to bacterium）、細胞粘附調(diào)節(jié)（regulation of cell adhesion）等；細胞組分（Cellular component）有：胞質(zhì)泡腔（胞質(zhì)泡腔）、膜筏（membrane raft）、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）等；分子功能（Molecular function）有：激酶活性（kinase activity）、脂質(zhì)結(jié)合（lipid binding）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）等；KEGG通路前15條富集分析結(jié)果顯示，APS抗菌的關(guān)鍵基因靶點涉及到的通路有：黏附連接（adherens junction）、藥物代謝（drug metabolism）、氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism），見圖5～圖7、表9。

表9 APS抗菌靶點相關(guān)通路分析Table 9 Analysis of APS antibacterial target related pathways

圖5 GO功能分析圖Fig.5 GO function analysis chart

圖6 KEGG富集分析氣泡圖Fig.6 KEGG enrichment analysis bubble chart

圖7 前10個關(guān)鍵靶點在局灶黏附通路上的標注圖Fig.7 Annotated map of the first 10 key targets on the focal adhesion pathway

3 討論與結(jié)論

根據(jù)2018年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測，在22147株金黃色葡萄球菌中，甲氧西林耐藥株的檢出率為34.0%，其中88.6%甲氧西林耐藥株對多種抗生素的耐藥率明顯高于甲氧西林敏感株，且臨床分離菌對常見抗菌藥物的耐藥率仍呈增長趨勢[16]，而生物被膜的屏障作用使得抗菌藥物難以滲透其中殺滅深內(nèi)層細菌，這也是臨床細菌耐藥性產(chǎn)生的重要原因[17]。

本研究探索在生物被膜與耐藥性兩因素作用下，APS對比四種β-內(nèi)酰胺類抗生素對細菌MIC的抗菌特點和潛在機制。通過體外抗菌實驗發(fā)現(xiàn)APS可能通過影響細菌的生物被膜而發(fā)揮抗菌作用，為探究APS如何對生物被膜進行調(diào)控及潛在抗菌作用靶點和作用機制，課題組采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進行預(yù)測，為后續(xù)的實驗研究方向提供參考。

體外抗菌實驗顯示，通過APS及四種β-內(nèi)酰胺類抗生素對細菌MIC的測定發(fā)現(xiàn)，細菌耐藥性及生物被膜不會影響APS的抗菌作用，而β-內(nèi)酰胺類抗生素易受到細菌耐藥性及生物被膜的影響，使得細菌對其敏感性降低，可見APS的抑菌機制不同于常規(guī)的化學(xué)抗生素藥物，并不易受細菌耐藥性及生物被膜的影響，有較好的發(fā)展前景。目前，細菌對抗生素耐藥現(xiàn)狀嚴峻，尤其對青霉素鈉耐藥率高達94%[1]，β-內(nèi)酰胺類抗生素不能影響生物被膜形成，根據(jù)APS可影響生物被膜而抗菌的作用特點，課題組接下來將進一步探究其對生物被膜的影響及機制，利用APS破壞生物被膜從而提高或恢復(fù)細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果顯示，ALB、AKT1、CASP3、MAPK1、IGF1、MAPK8、BCL2L1、ESR1、MMP9、HRAS為APS抗菌的重要靶點。其中，ALB作為載體蛋白，抗菌藥物與其結(jié)合后，藥物的質(zhì)變轉(zhuǎn)化被顯著修飾[18]，此外ALB還可削弱細菌與金屬蛋白的結(jié)合能力，尤其是限制細菌對鐵的利用，從而抑制細菌生長[19]；AKT1是與AKT激酶緊密相關(guān)的絲氨酸蛋白激酶可催化蛋白磷酸化，在調(diào)節(jié)細菌的細胞過程中起核心作用[20]；CASP3參與半胱氨酸蛋白酶的激活級聯(lián)，負責(zé)細胞凋亡的執(zhí)行，還參與細胞黏附過程[21]；MAPK1、MAPK8在MAPK / ERK級聯(lián)中起重要通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞骨架重排來介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，例如細胞生長、黏附、存活和分化[22]；MMP9在細胞外基質(zhì)的局部蛋白水解和白細胞遷移中起重要作用，可作為細菌感染的保護性分子，防止巨噬細胞通過非蛋白水解作用遷移到感染部位[23]。

通過GO和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵靶點具有一定相關(guān)性，是一個交互復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)而非獨立起作用，且主要集中在細胞質(zhì)膜、黏附、代謝等方面，說明APS可能通過作用于菌體表面的蛋白，影響蛋白質(zhì)的合成、黏附過程、干擾其代謝等，從而發(fā)揮抗菌作用，而這些過程與細菌生物被膜的形成息息相關(guān)。研究表明，APS與SA細胞膜的膜脂和蛋白質(zhì)相互作用，使得膜流動性明顯降低、膜蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，破壞細胞膜完整性，還可與其DNA相結(jié)合達到殺菌作用[24]。Xiong等[25]進一步研究APS對SA的作用機制，發(fā)現(xiàn)APS可引起SA細胞膜滲透性的變化。此外，通過干擾局灶黏附通路中FAK與銜接蛋白β1的結(jié)合，可阻止細菌在宿主表面的定植和遷移，從而抑制細菌感染[26]，而具有較好網(wǎng)絡(luò)度的蛋白靶點AKT1、MAPK1、IGF1、MAPK8、HRAS均富集在該通路上（見圖7），說明APS可通過干擾細菌的定植和遷移而影響生物被膜的形成，從而起到抗菌作用。

APS屬黃酮類成分，研究表明，由于黃酮類成分具有特殊的苯環(huán)結(jié)構(gòu)而有較好的抗菌活性[27]，該機制之一即為抑制胞質(zhì)膜功能[28]，與關(guān)鍵蛋白靶點功能、GO富集分析結(jié)果一致，證明了本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性；此外，前10個關(guān)鍵靶點有半數(shù)均富集在局灶黏附通路上，而細菌生物被膜形成的第一步就是黏附于接觸表面[29?30]，體外抗菌實驗亦說明APS通過影響生物被膜而發(fā)揮作用的抗菌特點，因此本文推測，APS可能通過影響細菌的黏附能力以及生物被膜的結(jié)構(gòu)、形成過程，從而呈現(xiàn)良好的抗菌效果。后期本課題組將深入研究APS對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響及機制，對本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果進行進一步驗證。