β-煙酰胺單核苷酸跨境產(chǎn)品中NMN含量的測定

張文宇，蘭 韜 ，趙 溪，吳 琦，初 僑，于聰聰，王大宏，張維冰，云振宇

（1.齊齊哈爾大學(xué)，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191；3.湯臣倍健股份有限公司，廣東珠海 519040；4.庶正康訊（北京）商務(wù)咨詢有限公司，北京 100054；5.華東理工大學(xué)，上海 200237）

β-煙酰胺單核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，NMN）是一種具有生物活性的核苷酸，由磷酸基和含核苷的核糖與煙酰胺反應(yīng)自然形成[1]，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。在動物細(xì)胞中，NMN是一種細(xì)胞能量來源，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）生物合成的代謝物，在細(xì)胞增殖和功能中起著至關(guān)重要的作用[2]。研究表明補(bǔ)充NMN可以提高體內(nèi)NAD+含量[3]，從而延緩、改善、防止衰老誘導(dǎo)的代謝紊亂、老年疾病等[4?9]，所以NMN近年來成為生理醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，并成為醫(yī)藥、功能性食品、化妝品等行業(yè)的珍貴原料[10?11]。由于NMN在我國還未獲得藥品、保健食品、食品添加劑和新食品原料許可，所以主要作為跨境產(chǎn)品通過跨境電商平臺進(jìn)入國內(nèi)。

圖 1 β-煙酰胺核苷酸的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure formula of β-nicotinamide nucleotide

人體可自身合成少量NMN[12]，也會通過攝食西蘭花、卷心菜等果蔬補(bǔ)充NMN[13]。但由于這些果蔬中NMN含量都較少，如果想通過食物來補(bǔ)充NMN非常困難。所以近年來以NMN為主要活性物質(zhì)的膳食補(bǔ)充劑成為消費(fèi)市場的寵兒，但是諸多亂象也如影隨形，其中最嚴(yán)重的就是部分NMN產(chǎn)品根本不含有NMN或者NMN含量遠(yuǎn)少于其標(biāo)稱，達(dá)到以次充好的目的。目前國內(nèi)可以在跨境電商平臺上購買到NMN跨境產(chǎn)品，但這類產(chǎn)品售價普遍十分高昂，最便宜的也要1500元/瓶，貴的甚至有20000元/瓶[14]，如果沒有做好產(chǎn)品質(zhì)量控制，將嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者權(quán)益。所以2021年2月國家市場監(jiān)管總局食品經(jīng)營司下發(fā)《關(guān)于排查違法經(jīng)營“不老藥”的函》（以下簡稱“排查函”），明確指出目前NMN在我國未獲得藥品、保健食品、食品添加劑和新食品原料許可，不能作為食品進(jìn)行生產(chǎn)和經(jīng)營，要求各個省級市場監(jiān)管部門對相關(guān)經(jīng)營者進(jìn)行全面排查。

目前國際上還沒有NMN跨境產(chǎn)品中NMN含量測定方法標(biāo)準(zhǔn)，無法對此類產(chǎn)品中NMN含量進(jìn)行準(zhǔn)確測定，就無法對相關(guān)食品進(jìn)行監(jiān)管。所以非常有必要研制NMN跨境產(chǎn)品中NMN含量的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，可以有效解決NMN行業(yè)中以次充好問題，實現(xiàn)凈化市場的目的，并滿足監(jiān)管需求。我國是NMN原料的主要生產(chǎn)國之一，開發(fā)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法對于促進(jìn)我國NMN的綜合利用具有重要意義。

NMN具有極性大、不易揮發(fā)、分子內(nèi)成鹽、易溶于水、難溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)[15?18]，前人研究[19]認(rèn)為，該性質(zhì)制約了很多常規(guī)定量分析方法的應(yīng)用。常見的定量檢測方法包括液相色譜-紫外法（HPLCUV）[20]、液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）[21]、毛細(xì)管電泳法（CE）[22]、核磁共振波譜法（NMR）[23]。由于在NMN產(chǎn)品中NMN含量較高，通常都在10%以上，HPLC-MS、NMR方法靈敏度高、儀器昂貴，造成檢測成本較高，而CE法裝機(jī)量較少，應(yīng)用還不夠普遍。而HPLC-UV法以其操作簡單、普適性好、應(yīng)用廣泛而成為NMN檢測的利器。目前對NMN的定量檢測主要集中于細(xì)胞提取物[24]、果蔬等基質(zhì)[25]，缺乏膠囊、片劑等劑型基質(zhì)中NMN含量檢測方法研究。有鑒于此，本文將通過優(yōu)化樣品的前處理方法和液相色譜方法，開發(fā)膠囊、片劑等劑型NMN跨境產(chǎn)品中NMN含量開發(fā)相應(yīng)的檢測方法，并通過方法學(xué)驗證，為建立相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

NMN標(biāo)準(zhǔn)品：β-煙酰胺單核苷酸（C11H15N2O8P）（CAS 1094-61-7，純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（CH4O） 色譜純，德國Merck公司；甲酸（CH2O2） 色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；6種市售NMN膠囊、NMN片劑產(chǎn)品（其中4種為片劑、2種為膠囊劑） 采購于天貓。

iChrom5100分析型國產(chǎn)液相色譜儀，配DAD檢測器 大連依利特分析儀器有限公司；Venusil HILIC色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 ?） 天津博納艾杰爾科技有限公司；Thmorgan-VM200型渦旋振蕩器 托摩根生物科技有限公司；HITACHICF15RXII離心機(jī) 日立公司；Sartorius分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ELGA純水儀 北京誠驛恒儀科技有限公司；LMDTC-15F超聲波清洗儀 北京綠棉科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液 準(zhǔn)確稱取10 mg NMN（精確到0.01 mg）標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至10 mL，配成濃度為1000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，避光保存于4 ℃冰箱備用，有效期3個月。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 以50%甲醇水溶液為溶劑，將NMN標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至500、250、100、50、25、10、5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，此溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理 取去除膠囊的粉末狀樣品100 g于石英研缽中，研磨至碎，過0.18 mm篩備用。

準(zhǔn)確稱取已研細(xì)的去除膠囊的粉末狀樣品0.5 g（精確到0.001 g）于50 mL容量瓶中，加入25 mL 50%甲醇水溶解，超聲20 min使其充分溶解，提取兩次，合并提取液，以10000 r/min的速度離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，取250 μL樣品溶液用50%甲醇水定容至10 mL后進(jìn)樣檢測。

片劑樣品前處理方法同上。

1.2.3 液相色譜條件 液相色譜柱為Venusil HILIC（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 ?），進(jìn)樣體積為10 μL，流速1 mL/min，柱溫：35 ℃，檢測波長為235 nm，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸甲醇溶液，采用等度洗脫，流動相A:流動相B=15:85（V/V）。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將配制好的5、10、25 、50 、100、250、500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按“1.2.3”的液相色譜條件進(jìn)樣分析，以NMN的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到NMN的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。

1.2.5 精密度試驗 在相同儀器條件下，取90 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2.3”色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測得各被檢測組分的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程得出測定濃度值，再計算測定濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 在相同儀器條件下，精密稱取0.5 g（精確到0.001g）已粉碎的片劑樣品以及膠囊樣品以“1.2.2”的前處理方法，制成兩種基質(zhì)的提取液，在同一天內(nèi)，以“1.2.3”色譜條件進(jìn)樣分析，每2 h測定一次，總共測定6次，測得被檢測組分的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程得出測定濃度值，再計算測定濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.7 重復(fù)性試驗 在相同的儀器條件下，精密稱取0.5 g（精確到0.001 g）已粉碎的片劑和膠囊樣品6份，按“1.2.2”前處理方法方法操作，將處理好的待測液按“1.2.3”色譜條件進(jìn)樣分析，測得樣品中NMN的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算測定濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.8 定量限、檢出限的測定 將“1.2.1.2”的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按“1.2.3”的液相色譜條件測定，測得NMN的峰面積，代入相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中。以最低水平標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)組分的3倍平均信噪比為檢出限（LOD），10倍平均信噪比為定量限（LOQ），計算得本方法的LOD和LOQ。

1.2.9 加標(biāo)回收率試驗 準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確到0.001 g）已粉碎的片劑樣品、膠囊樣品各12份，編號1～12，其中1～3號作為本底（基質(zhì)樣品），加入一定量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4～6號為加標(biāo)量為5 μg/mL的待測液，7～9號為加標(biāo)量為10 μg/mL的待測液，10～12號為加標(biāo)量為50 μg/mL的待測液，按照“1.2.2”操作，將處理好的待測液以及低、中、高3種濃度的加標(biāo)樣品經(jīng)HPLC分析，測得峰面積，計算回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)由依利特iChrom5100 workstation處理所得，其他數(shù)據(jù)采用Origin 6.0和Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，實驗數(shù)據(jù)取3次平行實驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[26?27]，研究者們通常采用反相C18色譜柱來實現(xiàn)NMN的分離，但由于NMN的極性較大，幾乎沒有保留，出峰時間過早，容易與樣品基質(zhì)峰發(fā)生混淆。所以本文考慮使用對于極性樣品分離效果較好的HILIC色譜柱[28?29]進(jìn)行樣品的分離。

為盡可能地將待測的NMN與膠囊和片劑樣品基質(zhì)中其他成分分離開，首先對流動相溶液配比進(jìn)行了優(yōu)化。用50%甲醇水溶液作為提取液溶解膠囊和片劑樣品配制成待測液，分別以95% B、85% B、50% B（V/V）的等度分離方式對NMN膠囊和片劑樣品進(jìn)行色譜分離，通過單標(biāo)法對峰的歸屬進(jìn)行了確證，由此判斷檢測時最佳的流動相比例。分離譜圖如圖2所示，其中圖2a為NMN片劑樣品的分離譜圖，圖2b為NMN膠囊的樣品分離譜圖。從圖中可以看出，隨著流動相中甲醇含量的增大，NMN的出峰時間逐漸后移。對于片劑樣品以50%比例等度洗脫時，NMN與基質(zhì)無法得到有效分離，而使用95% B比例等度洗脫時NMN的出峰時間較晚，影響分析方法的效率，而且也伴隨著峰展寬。當(dāng)使用85% B比例等度洗脫時分離效果最好，NMN的出峰時間較短，峰形也基本滿足高斯分布，可以達(dá)到基質(zhì)中雜質(zhì)峰與被分析物色譜峰分離的效果，降低了雜質(zhì)峰干擾的可能，從而省去對提取液進(jìn)行凈化處理的步驟，可以將分析方法的總體時間控制在8 min內(nèi)完成，使得操作簡便、耗時較短，提高了分析檢測效率。對于基質(zhì)較為簡單的膠囊樣品，可以看出同樣使用85% B比例等度洗脫，具有最好的分離效果、峰形和分析效率。所以采用85% B比例等度洗脫進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 NMN片劑樣品基質(zhì)（a）和NMN膠囊樣品基質(zhì)（b）的流動相優(yōu)化分離色譜圖Fig.2 Chromatograms of NMN tablet sample matrix (a) and NMN capsule sample matrix (b) based on mobile phase optimization

對于可離子化的樣品，甲酸具有改善峰形的作用[30]。因此，本文對流動相中甲酸的加入進(jìn)行優(yōu)化對比，在85%比例等度洗脫條件下，考察了0.1%甲酸加入前后NMN片劑和NMN膠囊劑樣品基質(zhì)中各被測組分分離效果，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，不加甲酸，NMN的峰拖尾現(xiàn)象明顯，而且出峰時間明顯推遲了8 min。而加入甲酸使各被測組分的峰形得到了良好的改善，并將整個分析時間控制在8 min內(nèi)，極大地提高了分析效率。這可能是由于甲酸的加入抑制了NMN的解離，降低了其在HILIC色譜填料上的保留，縮短了出峰時間。所以在流動相中加入甲酸進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖 3 甲酸加入前后NMN片劑（a）NMN膠囊劑（b）樣品基質(zhì)分離譜圖Fig.3 Chromatograms of NMN tablets matrix (a) and NMN capsule sample matrix (b) before and after formic acid addition

綜上，對于NMN片劑和NMN膠囊基質(zhì)，采用添加甲酸的方式能夠改善NMN峰形，因此以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液（15:85，V/V）為流動相進(jìn)行分離。

2.2 提取溶劑優(yōu)化

根據(jù)NMN的理化性質(zhì)[10?12]，NMN在水中溶解度較大，在甲醇中溶解度較小，在儀器及實驗條件相同情況下，本實驗選擇了水溶液、50%甲醇水溶液、85%甲醇水溶液3種溶劑開展樣品提取溶劑優(yōu)化實驗。由于NMN在甲醇中幾乎不溶，故不選擇用純甲醇作為提取溶劑。取0.5 g粉碎后的片劑和膠囊樣品，向其中各添加一定量的NMN標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使加標(biāo)濃度為10 μg/mL，采用“1.2.2”的樣品提取方式，分別以上述3種溶劑進(jìn)行提取，并測定加標(biāo)回收率，結(jié)果如下表1所示。從表1中可以看出，以50%甲醇水溶液作為提取溶劑，樣品的回收率可控制在90%～110%之間，同時偏差最小，具有最佳的提取效果。因此，在后續(xù)實驗中采用50%甲醇水提取溶劑進(jìn)行提取。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限

以“1.2.3”中的色譜分析條件對NMN標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，通過iChrom5100 workstation繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，其線性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOD及LOQ如表2所示。

由表2數(shù)據(jù)可知，本方法在5～500 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999。經(jīng)計算，NMN的檢出限（LOD，S/N=3）為1.0 mg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）為3.0 mg/kg。

2.4 儀器精密度實驗

按照“1.2.5”中實驗步驟，對濃度為90 μg/mL的NMN標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次平行測定，將測得的NMN的響應(yīng)值帶入線性方程計算得到溶液中NMN的含量，并計算6次測定結(jié)果的RSD如表3所示。

由表3數(shù)據(jù)可知，儀器精密度實驗結(jié)果的RSD為0.3%，表明本文發(fā)展的液相色譜方法具有較好的重現(xiàn)性，方法精密度較好，可以用于后續(xù)實際樣品中N MN含量的測定。

2.5 穩(wěn)定性實驗

以“1.2.6”中實驗步驟進(jìn)行操作，考察方法的穩(wěn)定性，經(jīng)過6次平行實驗，測得片劑和膠囊樣品中NMN的濃度與RSD如表4所示。

由表4數(shù)據(jù)可知，對于NMN片劑和NMN膠囊，6次測定結(jié)果RSD均較小，說明結(jié)果都保持高度一致，可以保證方法的穩(wěn)定性。

2.6 重復(fù)性實驗

按照“1.2.7”中的實驗步驟，將測得的NMN片劑、膠囊原液的6組平行樣品中NMN的濃度及RSD計算匯總，結(jié)果如下表所示。

由表5數(shù)據(jù)可知，兩種樣品重復(fù)性實驗的RSD在0.6%～1.8%之間，表明本方法重復(fù)性較好，表明本文開發(fā)的前處理方法結(jié)合HPLC方法可以用于NMN片劑和NMN膠囊中的NMN含量測定，并能使結(jié)果具有良好的重復(fù)性。

2.7 加標(biāo)回收率實驗

按“1.2.9”中步驟進(jìn)行操作，對制備的5、10、50 mg/kg的低、中、高三種加標(biāo)水平的NMN片劑和NMN膠囊劑樣品中NMN含量進(jìn)行了測定，并計算回收率和RSD%，結(jié)果如表6所示。

由表6數(shù)據(jù)可知，NMN片劑和NMN膠囊樣品中NMN的檢測回收率在90.9%～108.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過1.9%，表明本方法回收率好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本方法可用于實際樣品中NMN含量的準(zhǔn)確測定。

2.8 實際樣品測定

按照本文發(fā)展的NMN片劑和NMN膠囊劑樣品基質(zhì)中NMN含量的檢測方法對市售6個品牌的NMN產(chǎn)品中的NMN含量進(jìn)行分析測試，檢測結(jié)果見表7。

實際樣品分析結(jié)果表明，所有樣品中都檢出了NMN，但是部分產(chǎn)品的實際含量較其標(biāo)稱含量偏少，如2號樣品中NMN含量只有其標(biāo)稱值的一半，3號樣品中NMN含量只有其標(biāo)稱值的三分之一，涉及虛假宣稱。

表 1 不同溶劑對NMN提取效率的影響（n=3）Table 1 Effects of different solvents on the extraction efficiency of NMN (n=3)

表 2 NMN的線性范圍、LOD和LOQTable 2 Standard curve, linear range, LOD and LOQ of NMN

表 3 精密度實驗結(jié)果（μg/mL）Table 3 Precision test results (μg/mL)

表 4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果（mg/kg）Table 4 Results of stability experiments (mg/kg)

表 5 重復(fù)性實驗結(jié)果（mg/kg）Table 5 Results of repeatability experiment (mg/kg)

表 6 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果Table 6 Experimental results of standard recovery

表 7 6種不同NMN產(chǎn)品中NMN含量（g/kg，n=3）Table 7 NMN content in 6 different NMN products(g/kg, n=3)

3 結(jié)論

本文建立了一種NMN膠囊和NMN片劑基質(zhì)中NMN含量的檢測方法，方法通過調(diào)節(jié)色譜分離條件，使目標(biāo)組分與基質(zhì)成分完全分離，無需進(jìn)行樣品凈化操作，同時控制流動相組成，整個分析時間控制在8 min內(nèi)，具有操作簡便、檢測效率高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點。該方法為制定NMN跨境產(chǎn)品中NMN含量的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，對于提高NMN相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量，促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的便捷監(jiān)管具有深遠(yuǎn)意義。