基于微針途徑的艱難梭菌類毒素A經(jīng)皮免疫效應(yīng)研究

何菁榮 張 祎 代文秀 王月穎 傅思武

西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，甘肅蘭州 730030

艱難梭菌為革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，通常定植于人體腸道，是抗生素相關(guān)性腹瀉的主要病原菌之一。當(dāng)腸道微生態(tài)被破壞，艱難梭菌乘機(jī)大量繁殖產(chǎn)毒，導(dǎo)致艱難梭菌感染，其致病毒素以A 毒素（TcdA）和B 毒素（TcdB）為主，故目前艱難梭菌感染的預(yù)防及疫苗研究以TcdA、TcdB 為主要候選抗原[1-2]。面對(duì)國(guó)內(nèi)外艱難梭菌感染的新特點(diǎn)和國(guó)內(nèi)潛在爆發(fā)流行的趨勢(shì)，積極研究基于艱難梭菌毒素A 疫苗并探索其最佳疫苗免疫途徑，可以從根本上預(yù)防艱難梭菌感染的發(fā)生，有效阻止耐藥菌株的擴(kuò)散[3-4]。目前常用的免疫方式有腹腔注射、口服免疫、黏膜免疫[5-6]等，微針作為一種新型經(jīng)皮免疫方式，通過在皮膚造出大量微細(xì)管道，使抗原活性成分快速滲入，有效地克服皮膚角質(zhì)層屏障作用；不僅避免了口服給藥帶來的胃腸道副作用及肝臟的“首過效應(yīng)”，且減弱了注射免疫的痛感及針刺恐懼癥的限制，具有精準(zhǔn)、快速，安全等特點(diǎn)[7-9]。本研究通過比較微針免疫與腹腔注射給藥兩種途徑的免疫效果，探討基于微針途徑的艱難梭菌類毒素A 疫苗的黏膜免疫效應(yīng)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)BALB/c 小鼠，雌性18～22 g，6 周齡，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本研究已經(jīng)西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。于室溫22～26℃，濕度適宜，無菌環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

BHI 培養(yǎng)基（美國(guó)BBL 公司）；DEAE-Toyopearl 650M（日本東洋曹達(dá)株式會(huì)社）；三溴乙醇（SIGMA，T48402-25 g）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD680）；96 孔ELISA板、1 ml 無菌注射器、HRP-兔抗鼠（蘭州生物制品研究所）；微針（YMR30，0.3 mm，540 Needle）；ABTS 底物、PBST 封閉液、甲醛、37℃培養(yǎng)箱（西北民族大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.3.1 艱難梭菌類毒素A 疫苗制備 參考傅思武等[10]介紹的方法制備純化艱難梭菌A 毒素后，加入終濃度0.4%的甲醛，放入37℃培養(yǎng)箱，脫毒10～14 d。細(xì)胞毒檢測(cè)合格后，經(jīng)透析，測(cè)定蛋白濃度，即得到艱難梭菌類毒素A 疫苗。

1.3.2 疫苗免疫 適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，將24 只BALB/c 小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組與觀察組，每組各12 只（每組免疫劑量均為10 μg/ml）。觀察組將小鼠背部3～5 cm2面積進(jìn)行脫毛，次日用三溴乙醇麻醉（400 mg/kg）消毒后，利用微針按照垂直和水平方向分別滾動(dòng)5 次，滴加抗原待吸收后將小鼠放回飼養(yǎng)盒，觀察。對(duì)照組注射抗原后將小鼠放回飼養(yǎng)盒，隨時(shí)觀察。

兩組小鼠皆使用艱難梭菌類毒素A 分別于處理第0、7、14、28、42 天共分5 次進(jìn)行免疫。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 糞便IgA 及血清中特異性IgG 的效價(jià)檢測(cè) 于處理第7、14、28、42 天前，小鼠尾部取血分離得血清；小鼠糞便樣品用5 倍體積的NS 稀釋。使用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法測(cè)定效價(jià)，方法如下：以純化的艱難梭菌A毒素包被ELISA 板，用含10%BSA 的PBST 封閉，小鼠血清為一抗，HRP-兔抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）為二抗，ABTS 底物顯色后測(cè)定OD450值。

1.4.2 艱難梭菌產(chǎn)毒株攻毒實(shí)驗(yàn) 末次免疫后第7 天，對(duì)已經(jīng)免疫的BALB/c 小鼠使用艱難梭菌產(chǎn)毒株VPI10463（1×108CFU/ml）灌胃，進(jìn)行人工感染，單只隔離觀察并統(tǒng)計(jì)動(dòng)物發(fā)病及死亡情況，再將艱難梭菌感染2 d 后的小鼠處死，取盲腸中段用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE 常規(guī)染色，光鏡下觀察盲腸組織結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性且兩組方差齊的資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析主效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)和交互效應(yīng)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠血清特異性IgG 測(cè)定結(jié)果的比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：兩組小鼠血清抗體IgG 效價(jià)的組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但兩組小鼠血清抗體IgG 效價(jià)的時(shí)間、交互作用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示隨著免疫次數(shù)的增加，兩組小鼠血清抗體IgG 效價(jià)皆逐步增高。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，組間比較：兩組處理第7、14、42 天的血清抗體IgG 效價(jià)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；觀察組處理第28 天的血清抗體IgG 效價(jià)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較：兩組處理第14、28、42 天的血清抗體IgG 效價(jià)分別高于本組處理第7天，處理第42 天的血清抗體IgG 效價(jià)均高于本組處理第14、28 天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組處理第28 天的血清抗體IgG 效價(jià)與本組處理第14 天比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照組處理第28 天的血清抗體IgG 效價(jià)高于本組處理第14 天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組小鼠血清IgG 效價(jià)的比較（±s）

表1 兩組小鼠血清IgG 效價(jià)的比較（±s）

注 IgG：免疫球蛋白G

時(shí)間觀察組（n=12）對(duì)照組（n=12）t 值P 值處理第7 天處理第14 天處理第28 天處理第42 天F 時(shí)間，P 時(shí)間F 組間，P 組間F 交互，P 交互0.189±0.063 0.705±0.221 0.781±0.074 0.873±0.150 0.243±0.154 0.634±0.152 0.858±0.081 0.964±0.093 0.930 0.992 3.664 1.915 0.372 0.343 0.004 0.082 166.027，＜0.001 0.825，0.383 3.910，0.017 t 處理第14 天與處理第7 天比較值P 處理第14 天與處理第7 天比較值t 處理第28 天與處理第7 天比較值P 處理第28 天與處理第7 天比較值t 處理第42 天與處理第7 天比較值P 處理第42 天與處理第7 天比較值t 處理第28 天與處理第14 天比較值P 處理第28 天與處理第14 天比較值t 處理第42 天與處理第14 天比較值P 處理第42 天與處理第14 天比較值t 處理第42 天與處理第28 天比較值P 處理第42 天與處理第28 天比較值10.025＜0.001 24.001＜0.001 20.682＜0.001 1.344 0.206 5.321＜0.001 2.782 0.018 6.387＜0.001 13.58＜0.001 15.929＜0.001 4.490 0.001 7.745＜0.001 4.526 0.001

2.2 兩組小鼠糞便IgA 測(cè)定結(jié)果的比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：兩組小鼠糞便免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）效價(jià)的時(shí)間、組間、交互作用比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示兩組小鼠糞便中IgA 效價(jià)隨著免疫次數(shù)的增加而逐步增高，觀察組的免疫效果優(yōu)于對(duì)照組。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，組間比較：兩組處理第7 天的糞便IgA 效價(jià)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；觀察組處理第14、28、42 天的糞便IgA 效價(jià)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較：兩組處理第42 天的糞便IgA 效價(jià)高于本組處理第7、14、28 天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組處理第14、28 天的糞便IgA 效價(jià)高于本組處理第7 天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組處理第14、28 天的糞便IgA 效價(jià)與本組處理第7天比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組處理第28 天的糞便IgA 效價(jià)與本組處理第14 天比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 兩組小鼠糞便IgA 效價(jià)的比較（±s）

表2 兩組小鼠糞便IgA 效價(jià)的比較（±s）

注 IgG：免疫球蛋白A

時(shí)間觀察組（n=12）對(duì)照組（n=12）t 值P 值處理第7 天處理第14 天處理第28 天處理第42 天F 時(shí)間，P 時(shí)間F 組間，P 組間F 交互，P 交互0.486±0.087 0.699±0.080 0.714±0.163 0.848±0.129 0.540±0.149 0.570±0.075 0.589±0.060 0.669±0.086 1.007 3.951 2.570 4.678 0.335 0.002 0.026 0.001 16.874，＜0.001 11.658，0.006 6.710，0.001 t 處理第14 天與處理第7 天比較值P 處理第14 天與處理第7 天比較值t 處理第28 天與處理第7 天比較值P 處理第28 天與處理第7 天比較值t 處理第42 天與處理第7 天比較值P 處理第42 天與處理第7 天比較值t 處理第28 天與處理第14 天比較值P 處理第28 天與處理第14 天比較值t 處理第42 天與處理第14 天比較值P 處理第42 天與處理第14 天比較值t 處理第42 天與處理第28 天比較值P 處理第42 天與處理第28 天比較值7.862＜0.001 3.827 0.003 8.019＜0.001 0.265 0.796 3.261 0.008 2.650 0.023 0.668 0.518 1.100 0.295 2.583 0.025 0.692 0.503 2.825 0.017 2.626 0.024

2.3 組織病理學(xué)特點(diǎn)

艱難梭菌產(chǎn)毒株攻毒后，兩組小鼠均受到不同程度的保護(hù)，小鼠全部存活。處死小鼠后，小鼠盲腸病理切片結(jié)果顯示：未經(jīng)免疫的小鼠攻毒后，表現(xiàn)為小鼠黏膜上皮潰瘍、伴有充血、水腫、大量粒細(xì)胞浸潤(rùn)的黏膜炎癥（圖1，封四）；對(duì)照組與觀察組小鼠的腸黏膜損傷程度輕微，上皮結(jié)構(gòu)較完整，僅表現(xiàn)為輕度炎癥（圖2、3，封四）。

3 討論

3.1 艱難梭菌感染治療現(xiàn)狀

目前，臨床上主要采用萬古霉素、甲硝唑、非達(dá)霉素等抗生素進(jìn)行艱難梭菌感染治療，但仍有15%～35%的復(fù)發(fā)率[11]。其他的防治措施有：益生菌治療[12]、糞菌移植[13]、手術(shù)治療等。進(jìn)行臨床試驗(yàn)的治療藥物及生物制劑有：毒素吸附劑Tolevamer、免疫球蛋白、單克隆抗體、艱難梭菌疫苗[14]等。然而，由于高致病菌株的出現(xiàn)和菌株耐藥的增加，加上目前尚無安全合格的疫苗，艱難梭菌感染性疾病的防治仍是一個(gè)非常棘手的難題。本研究針對(duì)TcdA 制備出艱難梭菌類毒素A 疫苗免疫小鼠后，以艱難梭菌感染各疫苗組，小鼠無死亡現(xiàn)象，說明CDI 疫苗可有效預(yù)防艱難梭菌感染[15-16]；同時(shí)研究微針免疫途徑保護(hù)效果及可能存在的問題，結(jié)合小鼠免疫后血清學(xué)特異抗體IgG 效價(jià)、糞便中黏膜抗體糞便中IgA 效價(jià)、攻毒后小鼠組織學(xué)切片病理觀察結(jié)果整體分析發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組與觀察組的血清特異抗體IgG 效價(jià)的時(shí)間、交互作用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組小鼠的血清特異抗體IgG效價(jià)組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組小鼠糞便中IgA 效價(jià)的時(shí)間、組間、交互作用比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；攻毒后小鼠無死亡現(xiàn)象，盲腸病理切片中兩組小鼠僅表現(xiàn)為輕度的黏膜炎癥。綜合提示微針介導(dǎo)艱難梭菌類毒素疫苗進(jìn)入機(jī)體后，可產(chǎn)生效果良好的黏膜免疫效果。

3.2 微針艱難梭菌類毒素A 疫苗的前景

針對(duì)耐藥菌的控制，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）認(rèn)為只有疫苗的群體免疫才能減少這些廣譜耐藥菌的擴(kuò)散[17]。且迄今為止，腸道細(xì)菌性疫苗的防治效果不甚理想，考慮到抗生素制劑本身的缺點(diǎn)，積極研制高效、安全的疫苗是控制腸道細(xì)菌感染的關(guān)鍵手段。目前研究中的疫苗有被動(dòng)免疫疫苗、減毒疫苗、活菌疫苗、DNA 重組疫苗等，但尚無疫苗面市[18]。微針作為一種新型物理促滲技術(shù)，與傳統(tǒng)注射免疫相比，能更為有效地將疫苗抗原投遞給皮下的抗原遞呈細(xì)胞網(wǎng)，使其產(chǎn)生黏膜免疫，同時(shí)黏膜免疫的產(chǎn)生可以有效地阻擋來自黏膜的細(xì)菌和病毒感染[19]。除此之外，微針在用藥安全性及患者依從性上也具明顯優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)藥領(lǐng)域主要針對(duì)惡性腫瘤、糖尿病、免疫治療、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等方面進(jìn)行熱點(diǎn)研究[20-21]，然而現(xiàn)研發(fā)階段中微針僅適用于短期內(nèi)釋放且高效的制劑，對(duì)于需長(zhǎng)期緩慢釋放的藥物仍需重點(diǎn)探索。本實(shí)驗(yàn)初步測(cè)試了艱難梭菌類毒素A 疫苗微針經(jīng)皮接種的黏膜免疫效果，為艱難梭菌類毒素人用疫苗的研制提供新的理論與技術(shù)參考。

綜上所述，基于微針途徑的艱難梭菌疫苗經(jīng)皮免疫效應(yīng)良好，提示微針可以用于蛋白類毒素疫苗黏膜免疫且具有較好免疫效果，今后將針對(duì)抗原通過微針介導(dǎo)進(jìn)入黏膜后的分子免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究。