金黃色葡萄球菌表面蛋白與生物被膜關(guān)系的研究進(jìn)展

關(guān)曉雯 田 雨 魏蓮花

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，甘肅蘭州 730000

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一種革蘭氏陽性球菌，它是引起人類感染性疾病的重要病原菌之一，大約有30%的健康成年人攜帶SA，主要定植在皮膚和黏膜表面[1]。它不僅可以引起毛囊炎、結(jié)膜炎、肺炎等局部化膿性感染，還可以引起膿毒癥、敗血癥等全身感染。從20世紀(jì)80年代開始，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）在全球范圍內(nèi)蔓延，以至于許多國家現(xiàn)在報(bào)告醫(yī)院中感染SA 分離株的MRSA 占比超過50%[2]。SA 的毒力因子包括黏附性分子、蛋白酶類、免疫逃逸因子和毒素類[3]，其中識別黏附基質(zhì)分子的微生物表面成分是最大的一類，這些表面蛋白具有許多功能，包括黏附和侵入宿主細(xì)胞和組織，逃避免疫反應(yīng)和生物膜的形成[4]。因此，細(xì)胞壁錨定蛋白是SA 在共生狀態(tài)和侵入性感染期間生存的必要毒力因子。有研究表明，由SA 引起的慢性生物膜相關(guān)感染通常會導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率顯著增加，尤其是在與留置醫(yī)療器械相關(guān)的情況下。將生物材料植入患者體內(nèi)后，機(jī)體會迅速通過由宿主來源的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組成的調(diào)節(jié)膜將其覆蓋[5]。SA 與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)合是由識別黏附基質(zhì)分子的微生物表面成分（microbial surfaces components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMMS）介導(dǎo)的，這些宿主蛋白質(zhì)中的一些可以作為細(xì)菌附著的受體，因此顯然可以在生物膜發(fā)育的早期發(fā)揮重要作用。

1 生物膜

生物膜的形成是許多細(xì)菌病原體的重要毒力機(jī)制，它可以定義為微生物來源的固著群落[6]，其典型特征是細(xì)胞附著在基質(zhì)、表面或彼此之間，包埋在細(xì)胞外聚合物質(zhì)的基質(zhì)中，并在生長、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生方面表現(xiàn)出表型的變化[7]。雖然參與細(xì)菌生物膜形成的分子成分因細(xì)菌種類而異，但一個(gè)被廣泛認(rèn)可的基本模型由三個(gè)連續(xù)的階段組成：①細(xì)菌附著于表面；②生物膜的形成和成熟；③生物膜分離和擴(kuò)散[8]。為了在生物材料上形成生物膜，浮游SA 細(xì)胞首先附著在生物或非生物表面，然后增殖成稱為小菌落的粘性聚集體（也稱為塔或蘑菇狀結(jié)構(gòu)）[9]；附著到表面后，在有足夠營養(yǎng)源的情況下，黏附的SA 開始分裂和積累，為營養(yǎng)物交換和廢物去除提供表面積的增加，并促進(jìn)生物膜細(xì)胞向遠(yuǎn)端部位的擴(kuò)散[10]，這個(gè)時(shí)期，將其稱之為增殖階段；SA 生物膜的擴(kuò)散在很大程度上被證明是在基因調(diào)節(jié)器（accessory gene regulator，Agr）群體感應(yīng)系統(tǒng)的控制下進(jìn)行的，活化的Agr 介導(dǎo)的群體感應(yīng)通過蛋白酶活化和/或酚可溶性調(diào)節(jié)蛋白（phenol-soluble modulin，PSM）產(chǎn)生啟動生物膜基質(zhì)調(diào)節(jié)和細(xì)胞擴(kuò)散[11]。生物膜在慢性感染的持續(xù)性中起著重要作用，它的形成會將細(xì)胞包裹在聚合物基質(zhì)中，降低了對抗生素和免疫防御的敏感性，使這些感染難以根除[12]，并且在感染期間，細(xì)胞從生物膜上擴(kuò)散可導(dǎo)致傳播到次要部位，并使感染惡化。

2 表面蛋白與生物膜的關(guān)系

2.1 Ebh 蛋白和SasF 蛋白

為了在生物材料上形成生物膜，浮游SA 細(xì)胞首先利用對不同宿主基質(zhì)底物特異的多種細(xì)胞壁錨定蛋白附著在表面[13]。大多數(shù)先前已經(jīng)被表征的配體結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞壁相關(guān)，并且被稱為MSCRA MMs[14]，如細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白（extracellular matrixbinding protein homologue，Ebh）。Lei 等[15]使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，利用骨科植入物相關(guān)的大鼠模型，直接從感染的骨植入物中鑒定生物膜基質(zhì)蛋白。結(jié)果證實(shí)，急性感染時(shí)，受感染骨組織中存在兩種表面相關(guān)蛋白Ebh 和SA 表面蛋白F（surface protein ofStaphylococcus aureus，SasF）。Ebh 出現(xiàn)在分泌蛋白質(zhì)組和表面蛋白質(zhì)組的急性感染期，也出現(xiàn)在慢性感染期的分泌蛋白質(zhì)組中；SasF 是在慢性分泌組中發(fā)現(xiàn)的另外一種表面蛋白。為了驗(yàn)證上述蛋白確實(shí)存在于感染期間的生物膜基質(zhì)中，他們使用針對兩種表面蛋白Ebh 和SasF 的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析[16]。結(jié)果顯示，Ebh在急性和慢性感染的分泌體中均被鑒定，相比之下，SasF 僅在慢性分泌體中發(fā)現(xiàn)，并且Ebh 和SasF 均在感染組織中表達(dá)，而在感染其等基因突變的組織中不表達(dá)。這就意味著Ebh 和SasF 是生物膜基質(zhì)的組成部分[15]。

2.2 SasG 蛋白

SA 表面蛋白G（surface protein ofStaphylococcus aureus，SasG）與表皮葡萄球菌生物膜形成所需的積累相關(guān)蛋白（biofilm-associated accumulation-associated protein，Aap）密切相關(guān)[17]。SasG 和Aap 依賴的生物膜形成是最容易理解的生物膜形成過程。Aap 可促進(jìn)生物膜形成的初級附著或積累階段[18]，具體取決于所研究的菌株。在這兩種蛋白的調(diào)控下，生物膜的積累依賴于鋅，鋅與Aap 的G5-E 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而促進(jìn)兩個(gè)Aap 多肽的橋聯(lián)[19]。此外，Aap 的G5-E 結(jié)構(gòu)域會形成扭曲的繩狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)連接到其他細(xì)胞的Aap 蛋白質(zhì)時(shí)，可以將細(xì)菌連接在一起，如圖1所示。在SasG 調(diào)控的生物膜積累過程中可能會出現(xiàn)類似的機(jī)制[20]。

圖1 CWA 蛋白在生物膜形成中的作用

2.3 FnBPs 蛋白

對于纖維連接蛋白結(jié)合蛋白（fibronectin-binding proteins，F(xiàn)nBPs）介導(dǎo)的生物膜形成，需要N2-N3 子域[21]。N2-N3 亞結(jié)構(gòu)域通過對接、鎖定和閂鎖（dock，lock and latch，DLL）機(jī)制與配體結(jié)合。然而，DLL 不參與FnBPA 介導(dǎo)的生物膜，因?yàn)楸磉_(dá)缺乏閉鎖肽的FnBPA 突變株仍然形成生物膜[22]。此外，F(xiàn)nBPA 配體結(jié)合區(qū)域中的天冬酰胺殘基對于DLL 的配體結(jié)合至關(guān)重要，可以在不減少生物膜形成的情況下進(jìn)行替換[23]。FnBPs 也可以通過主要自溶蛋白（the major amidase，Atl）和替代sigma 因子（alternative sigma factors，sigB）調(diào)節(jié)的重要作用來決定生物膜的形成[24]，并且和其他表面蛋白通過嗜同性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或通過與鄰近細(xì)胞上的其他配體結(jié)合促進(jìn)聚集。這將有助于設(shè)計(jì)MRSA 生物膜形成過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑，從而降低某些疾病的發(fā)生率[25]。

2.4 ClfB 蛋白

在某些SA 菌株中，在缺乏Ca2+的條件下生長，生物膜的形成取決于聚集因子B（clumping factor B，ClfB）[26]。這是一個(gè)特別的蛋白質(zhì)，因?yàn)槠渌锬そ橘|(zhì)受到Ca2+消耗的抑制，ClfB 有助于黏附和定植到鼻道中的鱗狀上皮細(xì)胞[27]。在生物膜相關(guān)感染的臨床分離株和SA 的實(shí)驗(yàn)室菌株中，生物膜相關(guān)基因的表達(dá)可能受到不同的調(diào)節(jié)因子的影響[28]。例如，MRSA 菌株通常在Agr 基因型或表型上呈陰性。此外，蛋白酶可以調(diào)節(jié)表面蛋白質(zhì)依賴性生物膜的形成。ClfB 介導(dǎo)的生物膜形成已被證明適用于金黃色素編碼基因失活的菌株，因此這種表型可能僅限于在aur 基因中存在功能缺失突變的菌株[29]。

2.5 Bap 蛋白

Bap 基因編碼了一種2276 個(gè)氨基酸的新型生物膜相關(guān)蛋白（biofilm associated protein，Bap），它是第一個(gè)能夠誘導(dǎo)生物膜形成的表面蛋白[30]。該蛋白與革蘭氏陰性（銅綠假單胞菌和傷寒沙門氏菌）和革蘭氏陽性（糞腸球菌）微生物的表面蛋白具有全局組織相似性[31]。Bap 的核心區(qū)域占蛋白質(zhì)的52%，由13 個(gè)連續(xù)的幾乎相同的重復(fù)序列組成，每個(gè)重復(fù)序列包含86 個(gè)氨基酸。所有攜帶Bap 的葡萄球菌菌株都具有高度的黏附性和強(qiáng)大的生物膜生產(chǎn)者[32]。而且在小鼠感染模型中，Bap 參與了發(fā)病機(jī)制，導(dǎo)致了小鼠機(jī)體的持續(xù)感染。Bap 是SA 副基因組的一部分，但其他葡萄球菌中Bap 的同源基因?qū)儆诤诵幕蚪M。它的主要作用是促進(jìn)非生物表面的黏附，并通過自組裝成淀粉樣聚集體誘導(dǎo)細(xì)胞間強(qiáng)烈黏附，以響應(yīng)環(huán)境中的鈣水平和pH 值。在感染過程中，Bap 可增強(qiáng)與上皮細(xì)胞的黏附力，直接與宿主受體Gp96 結(jié)合，并抑制細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞[33]。

3 討論

SA 和表皮葡萄球菌是難以用抗生素治療的醫(yī)療器械相關(guān)感染的重要原因。在進(jìn)化過程中，它們獲得了一系列毒力特征，使其能夠在生物和非生物表面定植，形成生物膜結(jié)構(gòu)[34]。事實(shí)上，這是一種高度有序的結(jié)構(gòu)，具有大量的蛋白質(zhì)定位和組分之間的相互作用，從而形成一層堅(jiān)固的保護(hù)性生物膜“涂層”[35]。其中，基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分主要是多糖和蛋白質(zhì)的混合物，其中許多蛋白質(zhì)已被證明能聚合成更高級的結(jié)構(gòu)。SA 的纖維連接蛋白結(jié)合蛋白種類繁多，它們在定植和感染過程中扮演重要的角色，從而在宿主內(nèi)表達(dá)多種功能[36]。深入了解表面蛋白介導(dǎo)的生物膜形成的機(jī)制基礎(chǔ)將有助于設(shè)計(jì)與生物膜積累有關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的特定抑制劑。近年來，嚴(yán)重生物膜感染的出現(xiàn)及其對抗菌治療的耐藥性給醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了巨大挑戰(zhàn)[37]。因此，本文強(qiáng)調(diào)了分泌蛋白和CWA 在SA 生物膜形成和致病性中的獨(dú)特作用，這可能為控制葡萄球菌生物膜感染提供理論依據(jù)和防治策略。