miR-494-3p/RRS1軸對結(jié)直腸癌影響作用及機制

楊志文，阿古達木，韓怡茹，烏新林

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 胃腸外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

結(jié)直腸癌是全球第3大常見惡性腫瘤，也是第4大癌癥死亡原因[1]。一旦早期確診，手術(shù)是結(jié)直腸癌患者的首選治療方法[2]；復(fù)發(fā)并發(fā)展至晚期時，輔助化療可以緩解腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[3]。然而，上述治療手段并未取得預(yù)期的成功[4]。目前，針對原癌基因或抑癌基因的靶向治療也得到了發(fā)展，但治療效果十分有限[5]。因此，不斷探索與結(jié)直腸癌進展有關(guān)的新的藥物靶點非常重要。MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性非編碼小RNA分子，通過與mRNAs結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達，參與各種生物過程的調(diào)控[6-7]。有研究報道，miR-494-3p在多種癌癥的進展中具有顯著特征，例如，在卵巢癌中表達下調(diào)可抑制細胞增殖并促進細胞凋亡[8]，在骨肉瘤中通過抑制胰島素受體底物-1來阻止骨肉瘤細胞的惡性生物學(xué)行為[9]。本研究旨在探討miR-494-3p/RRS1軸對結(jié)直腸癌的影響作用及機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院自2018年1月至2020年1月收治的192例結(jié)直腸癌患者為研究對象。納入標準：經(jīng)組織學(xué)或病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌；血、肝、腎功能基本正常；同意進行本研究。排除標準：患有精神疾??；合并其他器官功能損傷；采集標本前經(jīng)過化療；患有嚴重感染性疾??；患有其他腫瘤。192例患者中，男性118例，女性74例；平均年齡(52.51±20.09)歲。收集患者的治療前癌組織及癌旁組織并保存于-80℃冰箱中。所有患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。siRNA、miR-494-3p mimics、miR-494-3p inhibitor、RRS1過表達質(zhì)粒均由南京金斯瑞設(shè)計和合成；人結(jié)直腸正常細胞株NCM460購自深圳震科生物科技有限公司(貨號NCM460)；人結(jié)直腸癌細胞株RKO、HCT116、SW480、HT-29購自Procell公司(貨號CL-0196、CL-0096、CL-0223、CL-0118)；Lipofectamine 2000購自北京德航五洲科技有限公司(貨號VTY30520-1.5 ml)；Trizol試劑購自艾德科技(北京)有限公司(貨號5301100)；超純RNA試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司(貨號CW0581M)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自北京沃格東方科技有限公司(貨號28025013)；SYBR試劑盒購自深圳康體生命科技有限公司(貨號KTSM602)；雙熒光素酶報告試劑盒購自百賽生物公司(貨號F6075S)；3-(4，5-二甲基-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自深圳市益百順科技有限公司(貨號IM0280-200 mg)；CDKN1A、CDC25C、p53[10]、MKI67、CDK1、RRS1抗體購自abcam公司(貨號ab102013、ab32444、ab26、ab15580、ab133327、ab188161)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 人結(jié)直腸正常細胞株NCM460和人結(jié)直腸癌細胞株RKO、HCT116、SW480、HT-29在RPMI-1640培養(yǎng)基、37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。siRNA、miR-494-3p mimics、miR-494-3p inhibitor、RRS1過表達質(zhì)粒均用Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 RNA抽取與實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 根據(jù)制造商說明，用Trizol試劑和超純RNA試劑盒從指定的細胞中分離總RNA。用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄0.8 μg總RNA。采用SYBR法在實時聚合酶鏈反應(yīng)儀TP800上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列為：RRS1正向，5′-ccctaccggaccagtaa-3′；RRS1反向，5′-CCGAAAAGGGGTTGAAACTTCC-3′；GAPDH正向，5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；GAPDH反向，5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。RRS1相對表達歸一化為GAPDH，采用對比CT法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 細胞周期測定 用碘化丙啶染色的流式細胞儀檢測細胞周期進展。將處理過的SW480細胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至80%融合。細胞核碘化丙啶染色分析細胞周期。碘化丙啶吸光度通過流式細胞儀上的熒光激活細胞分選來測定。

1.2.4 細胞增殖低水平測定 SW480細胞以2 000個細胞/孔的密度接種于96孔板，在37℃下分別培養(yǎng)0、1、2 d。PBS洗滌2次后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)。孵育4 h后，取每孔上清，加入100 μl二甲基亞砜溶解甲氧嘧啶鹽。10 min后，用微版閱讀器在490 nm波長下測量光密度。

1.2.5 熒光素酶報告實驗 構(gòu)建野生型(wild type，WT)和突變型(mutant type，MT)熒光素酶報告載體，并用 Lipofectamine 2000將miR-494-3p mimics或相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染到SW480細胞中。2 d后，用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)對熒光素酶活性進行量化。

1.2.6 免疫印跡 用細胞裂解緩沖液從SW480細胞中分離總蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度?？偟鞍捉?jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，4℃下用一抗免疫印跡過夜。PBST洗3次后二抗室溫下孵育1 h。PBST洗3次后進行ECL化學(xué)發(fā)光檢測蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者miR-494-3p表達水平及其對結(jié)直腸癌患者生存率、細胞增殖影響 miR-494-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達水平低于癌旁組織(P<0.05)。見圖1a。根據(jù)miR-494-3p在結(jié)直腸癌組織中的平均表達水平，將192例患者分入miR-494-3p低表達組(n=96)和miR-494-3p高表達組(n=96)。miR-494-3p高表達組生存率高于miR-494-3p低表達組(P<0.05)。見圖1b。與結(jié)直腸正常細胞株NCM460比較，miR-494-3p表達水平在結(jié)直腸癌細胞株RKO、HCT116、SW480、HT-29中均處于低表達水平，且SW480細胞株中miR-494-3p表達水平最低(P<0.05)。見圖1c。因此，本研究選取SW480細胞株為研究對象進行下游實驗。過表達miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480增殖水平下降(P<0.05)。見圖1d。敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480增殖水平上升(P<0.05)。見圖1e。過表達miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中S期細胞減少、G2/M期細胞增多(P<0.05)。見圖1f。敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中S期細胞增多、G2/M期細胞減少(P<0.05)。見圖1g。即miR-494-3p使結(jié)直腸癌細胞在G2/M期細胞周期阻滯。

圖1 結(jié)直腸癌患者miR-494-3p表達水平及其對結(jié)直腸癌患者生存率、細胞增殖影響

2.2 RRS1對結(jié)直腸癌患者細胞增殖影響及miR-494-3p靶向RRS1對結(jié)直腸癌患者細胞增殖調(diào)控作用 通過miRDB預(yù)測miR-494-3p的潛在底物，選取評分最高的80個候選基因進行siRNA敲低篩選。敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480增殖水平下降(P<0.05)。見圖2a、2b。過表達RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480增殖水平上升(P<0.05)。見圖2c。敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480中S期細胞減少、G2/M期細胞增多(P<0.05)。見圖2d。過表達RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480中S期細胞增多、G2/M期細胞減少(P<0.05)。見圖2e。過表達miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中RRS1 mRNA表達水平下降(P<0.05)；敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中RRS1 mRNA表達水平上升(P<0.05)。見圖2f。熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，miR-494-3p靶向RRS1 mRNA的3’端非翻譯區(qū)(P<0.05)。見圖2g。即miR-494-3p靶向RRS1使結(jié)直腸癌細胞在G2/M期細胞周期阻滯。

圖2 RRS1對結(jié)直腸癌患者細胞增殖影響及miR-494-3p靶向RRS1對結(jié)直腸癌患者細胞增殖調(diào)控作用

2.3 miR-494-3p及RRS1對結(jié)直腸癌患者細胞周期相關(guān)因子表達水平影響 過表達miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中細胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達水平上升，MKI67、CDK1表達水平下降(P<0.05)。見圖3a。

敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中細胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達水平下降，MKI67、CDK1表達水平上升(P<0.05)。見圖3b。敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480中細胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達水平上升，MKI67、CDK1表達水平下降(P<0.05)。見圖3c。過表達RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480中細胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達水平下降，MKI67、CDK1表達水平上升(P<0.05)。見圖3d。

圖3 miR-494-3p及RRS1對結(jié)直腸癌患者細胞周期相關(guān)因子表達水平影響

3 討論

miRNA是非編碼RNA家族的成員，長度為21～23個核苷酸[11]。有證據(jù)表明，miRNA作為癌基因或腫瘤抑制因子在多種癌癥中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[12]。miR-494-3p可誘導(dǎo)肺癌發(fā)生并調(diào)節(jié)人膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡[13]；但其在某些癌癥中充當腫瘤抑制因子，如前列腺癌[14]。本研究結(jié)果顯示：過表達miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480增殖水平下降(P<0.05)，S期細胞減少、G2/M期細胞增多(P<0.05)。即miR-494-3p在結(jié)直腸癌中充當腫瘤進展的抑制分子。有研究報道，miRNA可通過直接與目標mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達[15]，通過調(diào)節(jié)靶基因的蛋白質(zhì)表達水平，miRNA廣泛參與各種生物過程和人類疾病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中RRS1 mRNA表達水平下降(P<0.05)；敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中RRS1 mRNA表達水平上升(P<0.05)；miR-494-3p靶向RRS1 mRNA的3’端非翻譯區(qū)(P<0.05)。這提示，miR-494-3p通過調(diào)節(jié)RRS1發(fā)揮抑制結(jié)直腸癌進展的功能。

RRS1的主要功能是參與核糖體的生物發(fā)生，這是蛋白質(zhì)合成所必需的。癌細胞增殖增強常伴隨蛋白質(zhì)合成增加[16]。有研究證實，一些核糖體蛋白在癌癥發(fā)展中具有明確作用[17]。有學(xué)者稱，RRS1突變可延遲G1到S相的轉(zhuǎn)變[18]，這提示了RRS1在細胞周期轉(zhuǎn)變中的重要作用。本研究結(jié)果顯示：敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480中S期細胞減少、G2/M期細胞增多(P<0.05)；過表達RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480中S期細胞增多、G2/M期細胞減少(P<0.05)。本研究結(jié)果還顯示：過表達miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中細胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達水平上升，MKI67、CDK1表達水平下降(P<0.05)；敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細胞SW480中細胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達水平下降，MKI67、CDK1表達水平上升(P<0.05)；敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480中細胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達水平上升，MKI67、CDK1表達水平下降(P<0.05)；過表達RRS1后，結(jié)直腸癌細胞SW480中細胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達水平下降，MKI67、CDK1表達水平上升(P<0.05)。上述結(jié)果提示，miR-494-3p/RRS1軸在一定程度上通過上調(diào)或下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白來影響細胞周期。

綜上所述，miR-494-3p/RRS1軸可影響結(jié)直腸癌發(fā)展，靶向miR-494-3p/RRS1軸可能是一種有前途的結(jié)直腸癌治療策略。