扶正解毒顆粒對雞安全性和影響大腸桿菌抗藥性的研究

駱延波　張印　胡明　李璐璐　張慶　趙效南　齊靜　陳義寶　許曉暉　劉玉慶

摘 要：將1日齡健康雛雞80只，隨機分為四組，每組20只。其中1～3組為試驗組，分別在飲水中全程添加推薦劑量1倍（4 g/L）、3倍（12 g/L）和5倍（20 g/L）的扶正解毒顆粒;4組為不用藥對照組。試驗期8周，每天觀察并記錄各組雞的臨床體征，每周末稱重1次，8周末試驗結(jié)束時心臟采血測定各組雞的血液生理生化指標，剖檢雞只，通過組織切片觀察各臟器有無變化。從試驗組2（即3倍推薦用藥劑量組）和不用藥對照組雞只腸道中采集內(nèi)容物分離大腸桿菌，進行抗藥性分析。結(jié)果顯示，各組試驗雞的行為、采食、糞便性狀與空白對照組相比，均未見異常變化。1倍劑量組和3倍劑量組試驗雞的體重均顯著高于不用藥對照組（P<0.05或P<0.01）和5倍劑量組（P<0.05或P<0.01）;而1倍劑量組和3倍劑量組間在各日齡段均無顯著差異（P>0.05）。試驗各組和不用藥對照組雞只血液生理生化指標紅細胞數(shù)、血紅蛋白、白細胞數(shù)、淋巴細胞比例均無顯著性差異（P>0.05）。試驗各組臟器顏色、形狀、大小、位置等均未見異常變化。顯微鏡觀察組織切片，細胞符合正常組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點。大腸桿菌對8種藥物的MIC值均未有顯著差異（P>0.05）。以上結(jié)果表明，扶正解毒顆粒對靶動物雞無明顯不良影響，對大腸桿菌抗藥性水平影響不顯著。

關(guān)鍵詞：扶正解毒顆粒;雞;血液;生理指標;大腸桿菌;抗藥性

中圖分類號：S853.7 文獻標識碼：B文章編號：1673-1085（2022）04-0012-07

扶正解毒顆粒是由《中國獸藥典·二部》（2015版）中的扶正解毒散經(jīng)過劑型改造而制成。按照農(nóng)業(yè)部442號公告發(fā)布的《中獸藥、天然藥物分類及注冊資料要求》屬于申報四類傳統(tǒng)中獸藥復(fù)方制劑。扶正解毒散具有扶正祛邪、清熱解毒之功效，臨床上用于雞傳染性法氏囊病的治療[1-2]。經(jīng)過劑型改造后，本制劑在臨床上主要用于提高雞的免疫力，與疫苗協(xié)同使用提高疫苗抗體水平，并延長抗體在禽類體內(nèi)的持續(xù)作用時間。為了全面評價本制劑在臨床上的確切功效，本試驗首先通過靶動物安全試驗考察受試獸藥扶正解毒顆粒用于靶動物雞的的安全性及安全劑量范圍，為臨床試驗給藥方案的制定提供依據(jù)。隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素使用量劇增，在一定程度上造成細菌抗藥性程度較高，急需細菌抗藥性防控技術(shù)[3-7]。研究發(fā)現(xiàn)，添加中藥在一定程度上減緩細菌抗藥性的增加速度，或部分消除抗藥性[8-10]。因此，本研究通過添加扶正解毒顆粒觀察是否對大腸桿菌抗藥性產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物及飼料 1日齡體重相差±5 g的海蘭灰蛋雞雛：購自保定市潯源禽業(yè)有限公司，嚴格按照管理標準進行飼養(yǎng)。飼料：市場購進雛雞全價飼料。

1.1.2 供試藥品及試劑 扶正解毒顆粒：山東明發(fā)獸藥股份有限公司提供，規(guī)格：100 g/袋，含量：1 g，相當于原生藥0.5 g。批號：20170901。

1.1.3 試驗儀器 OLYMPUS生物顯微鏡：日本制造。全自動生化分析儀：日本東芝TBA-120FR。電子天平：Precisa 92SM-202A。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組與處理 根據(jù)《獸用中藥、天然藥物臨床試驗技術(shù)指導原則》中對靶動物安全試驗的分組要求，從新購進的1日齡雛雞中選取體重相近、健康活潑的雛雞80只，隨機分為4組，每組20只。其中1～3組為試驗組，分別在飲水中全程添加推薦劑量1倍（4 g/L）、3倍（12 g/L）和5倍（2 0g/L）的扶正解毒顆粒;4組為不用藥對照組，全程飲用新鮮自來水。試驗期8周，每天觀察并記錄各組雞的臨床體征，每周末稱重1次，8周末試驗結(jié)束時心臟采血測定各組雞的血液生理生化指標;同時進行剖檢，通過組織切片觀察各臟器有無變化。在試驗開始前以及試驗結(jié)束時，從試驗組2（即3倍推薦用藥劑量組）和空白對照且雞只腸道中采集內(nèi)容物分離大腸桿菌，并進行抗藥性分析。

1.2.2 指標測定方法[11-14] 紅細胞總數(shù)的測定：采用試管法，即將供檢血稀釋200倍后，用血細胞計數(shù)板計數(shù)一定容積內(nèi)的紅細胞數(shù)，最后計算出每升血液中的紅細胞數(shù)。紅細胞總數(shù)的計算公式：紅細胞總數(shù)（×10¹²個/L） = X×10 000。式中的X為5個中方格的紅細胞總數(shù)。

白細胞總數(shù)的測定：采用試管法，即將供檢血稀釋20倍后，用血細胞計數(shù)板計數(shù)一定容積內(nèi)的白細胞數(shù)，最后計算出每升血液中的白細胞數(shù)。白細胞總數(shù)的計算公式：白細胞總數(shù)（×10⁹個/L） = X×50×10⁶。式中的X為4個大方格中的白細胞總數(shù)。

淋巴細胞比例的測定：用未抗凝血，制作血涂片，姬姆薩染色法染色，采用白細胞分類法對白細胞計數(shù)，計算淋巴細胞比例。

血紅蛋白含量的測定：采用比色法。紅細胞遇酸溶解后會游離出血紅蛋白，并被酸化為褐色的酸性血紅素，稀釋后與標準比色柱比色，即可求得血紅蛋白的含量。

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）值測定：根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會 （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 建立的標準藥敏方法，采用微量肉湯稀釋法[15]，測定多黏菌素、多西環(huán)素、頭孢噻呋、慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林和新霉素等8種抗生素對這些分離菌株的抗藥性水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 扶正解毒顆粒對雞臨床體征的影響

在試驗過程中每天觀察并記錄各組雞的臨床體征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組試驗雞的行為、采食、糞便性狀與空白對照組相比， 均未見異常變化。說明扶正解毒顆粒對靶動物雞的狀況無明顯不良影響。

2.2 扶正解毒顆粒對雞體重的影響

在試驗期間每周對各組試驗雞稱體重1次， 通過計算每個周末試驗雞的平均體重可知，受試雞在試驗期前2周內(nèi)各組間的平均體重均無顯著性差異（P>0.05）。從21日齡開始到試驗結(jié)束，1倍劑量組和3倍劑量組試驗雞的體重均顯著高于不用藥對照組（P<0.05或P<0.01）;從28日齡開始到試驗結(jié)束，1倍劑量組和3倍劑量組試驗雞的體重均顯著高于5倍劑量組（P<0.05或P<0.01）;而1倍劑量組和3倍劑量組間在各日齡段均無顯著差異（P>0.05）。5倍劑量組和對照組間均無顯著性差異（P>0.05）。詳見表1。

2.3 扶正解毒顆粒液對雞血液生理指標的影響結(jié)果見表2。

由表2可以看出，從1～56日齡在試驗雞飲水中全程添加推薦劑量1倍、3倍、5倍的扶正解毒顆粒，其血液生理指標紅細胞數(shù)、血紅蛋白、白細胞數(shù)以及淋巴細胞比例均與不用藥對照組無顯著性差異（P>0.05），且3個用藥劑量組間也均無顯著性差異（P>0.05）。

2.4 病理學檢查結(jié)果

試驗結(jié)束時對各組雛雞剖檢，進行肉眼病理學觀察。通過觀察發(fā)現(xiàn)，各組臟器顏色、形狀、大小、位置等均未見異常變化。

顯微鏡觀察組織切片，可見細胞輪廓完整，排列有序;胞質(zhì)豐滿，細胞核結(jié)構(gòu)清晰，符合正常組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點?？梢哉J定藥物對所采集組織無毒性作用（圖1～4）。

2.5 大腸桿菌抗藥性結(jié)果

2.5.1 分離鑒定細菌 在試驗前和試驗結(jié)束時，從3倍推薦劑量組和空白對照組分別分離到大腸桿菌各20株。編號分別為試驗1～20號，對照1～20號。

2.5.2 細菌抗藥性檢測結(jié)果 8種抗生素對分離菌株大腸桿菌的MIC值對比見圖5。

從圖5可以看出，3倍推薦劑量試驗組中雞源大腸桿菌對多黏菌素、多西環(huán)素、氟苯尼考、頭孢噻呋、氧氟沙星抗藥性水平基本上沒變化，而對氨芐西林、慶大霉素、新霉素的抗藥性水平略有下降，但不顯著（P>0.05）。

3 討論

《中華人民共和國獸藥典》（2010版）中收錄的扶正解毒散，方中的黃芪有提升免疫力的作用[17-19]，淫羊藿有滋補腎陽氣功效[16]，二者配合使用具有明顯的提升免疫力的能力;板藍根內(nèi)含有多種抗病毒物質(zhì)，具有良好的清熱解毒、降火功能，可單獨使用，也可與其它藥配伍使用，對多種病毒引起的疾病都有較好效果。三味藥相互組合，在提升免疫力的基礎(chǔ)上清熱解毒，降低了細菌性疾病和病毒性疾病感染的機會。

本試驗以臨床推薦劑量的1倍（4 g/L）、3倍（12 g/L）和5倍（20 g/L）在試驗雞飼養(yǎng)的56 d中，全程在飲水中添加扶正解毒顆粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各用藥組試驗雞的外在表現(xiàn)、采食、糞便性狀與空白對照組相比， 均未見異常變化;各用藥組試驗雞的紅細胞數(shù)、血紅蛋白、白細胞數(shù)以及淋巴細胞比例均與不用藥對照組無顯著差異（P>0.05）;組織學觀察心肝脾腎也均未見異常。表明扶正解毒顆粒對試驗雞無不良影響。

試驗過程中，從21日齡開始，1倍劑量組和3倍劑量組試驗雞的體重均顯著高于不用藥對照組（P<0.05或P<0.01）。這種結(jié)果的出現(xiàn)，不是受試藥品不良反應(yīng)的表現(xiàn)，而是由于組方中補氣健脾的黃芪增加了雞群脾胃的運化和吸收功能[16]，從而導致其體重比不用藥對照組顯著增加。

本試驗結(jié)果中1倍劑量組和3倍劑量組試驗雞的體重較不用藥對照組顯著增加（P<0.05或P<0.01），而5倍劑量組卻與對照組雞的體重無顯著性差異（P> 0.05），從另一個角度進一步證明了實驗室臨床試驗所推薦的4 g/L飲水劑量的合理性。這主要是因為許多中藥的藥效與用藥劑量呈鐘罩狀關(guān)系，即在一定劑量范圍內(nèi)藥效隨著劑量的增加而顯著增大，當用藥劑量達到某一定范圍時，藥效不再隨著用藥劑量的增加而增大;當用藥劑量超過一定范圍后，藥物的藥效隨著劑量增加反而降低。本試驗結(jié)果中，1倍和3倍劑量可顯著提高試驗雞的體重，而5倍劑量卻沒有明顯作用，就屬這種情況。

本試驗添加扶正解毒顆粒，對于雞腸道大腸桿菌的抗藥性水平影響不明顯，可能與中藥的成分和使用時間較短有關(guān)系。盡管扶正解毒顆粒對于大腸桿菌的抗藥性影響很小，但可通過提高雞體免疫力，增強機體抗菌抗病毒的能力，提高生產(chǎn)性能。隨著抗生素的廣泛使用，導致嚴重的多重抗藥性和藥物殘留，以至于歐盟以及我國出臺了相關(guān)法規(guī)政策禁止飼料中添加任何抗生素促生長劑，全球范圍內(nèi)抗生素的從嚴處方化管理和抗藥性監(jiān)測漸成常規(guī)[20-21]，因此具有免疫功能的扶正解毒顆粒能夠抗藥抗病毒，是一種很好的抗生素替代產(chǎn)品。

4 結(jié)論

靶動物安全試驗結(jié)果表明，即使在飲水中添加3倍和5倍推薦劑量的受試藥品扶正解毒顆粒對靶動物雞仍無明顯不良影響。

3倍推薦劑量的受試藥品扶正解毒顆粒在8周作用時間下其對8種藥物的抗藥性水平未發(fā)生顯著變化。

參考文獻：

[1] 田美湛，張秀英，蔣月，等.扶正解毒散超微粉對人工感染傳染性法氏囊病預(yù)防試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2007，41（11）：31-33.

[2] 歐偉蓮，戴光文，江精華.扶正解毒散對 CSF、PRRS、PR與FMD免疫效果試驗[J].中獸醫(yī)學雜志，2019，5：11-12.

[3] LIU YY， WANG Y， WALSH TR，et al.Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China：a microbiological and molecular biological study[J].The Lancet Infectious Diseases，2015，16（2）：161-168.

[4] KAGEYAMA C，SATO M， SAKAE H，et al.Increase in antibiotic resistant Helicobacter pylori in a University Hospital in Japan[J].Infection and Drug Resistance，2019，12：597-602.

[5] BOULANT E，DAVIN RA，PAGES JM，et al.Efflux pumps，a bacterial resistance mechanism[J].Revue Francophone des Laboratoires，2020，519：39-48.

[6] ENJAMIN? H， THANDO N， TANYA C，et al.Exploring the antimicrobial resistance profiles of WHO critical priority list bacterial strains[J].BMC Microbiology，2019，19：303-313.

[7] OSHUA B，ALINA B，ISAAC I. B.Endometritis and Bacteremia With a New Delhi Metallo-Beta-Lactamase 1 （NDM-1）–containing Organism in a Remote Traveler[J].Journal of Obstetrics and Gynaecology Canada， 2019，41（6）：753-754.

[8] 楊帆，楊玉榮，趙振升，等. 中草藥消除細菌耐藥性質(zhì)粒研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展，2013，34（12）：160-164.

[9] 劉昊，王秀東，曹凱捷，等.中藥及其有效成分抗細菌耐藥性的研究進展[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2019，9：54-57.

[10] 劉金平，呂世明，譚艾娟，等.中藥提取物恢復(fù)耐藥大腸桿菌對氨基糖苷類藥物敏感性的研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2018，50（3）：107-111.

[11] 王紅梅，鐘秀會，尹衛(wèi)衛(wèi)，等. 加味扶正解毒散對肉仔雞生理和生產(chǎn)性能的影響[J].中國家禽，2010，32（9）：22-24+28.

[12] 王勇.藍馬雞和藏馬雞血液生理生化指標測定[J].畜牧與獸醫(yī)，2001，33（2）：31-32.

[13] 袁進，吳清洪，徐名襯，等. 廣州地區(qū)藏雞血液生理和生化指標測定分析[J]. 中國比較醫(yī)學雜志，2018，28（4）：69-72.

[14] 冼瓊珍，計慧琴，陳勝峰，等.陽山雞血液主要生理生化指標的測定[J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44（S1）：46-48.

[15] CLSI.Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests.27th edition.CLSI document M100[S].Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2017.

[16] 胡明，付曉杰，張慶，等.大腸桿菌持留菌株與抗藥菌株生長優(yōu)勢的比較[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2019，51（ 7）：108-112.

[17] 馬飛，李玉保.黃芪對肉雞免疫力的影響[J].安徽農(nóng)學通報，2007，5：81-82+74.

[18] 駱延波，胡明，齊靜，等. 扶正解毒顆粒對小鼠血液指標影響的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2017，49（4）：116-119.

[19] 李群道，單安山.中藥復(fù)方對雞增重和免疫功能的影響[J].中國獸醫(yī)雜志，2005，8：29-30.

[20] 佟建明，沈建忠. 飼用抗生素研究與應(yīng)用[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2000.

[21] 陳燕軍.對歐盟禁用動物抗生素添加劑的再思考[J].中國禽業(yè)導刊，2006（21）：9-10+53.

Study on Toxicity of Fuzheng Jiedu Granules to Chickens and

to drug Resistance of Escherichia coli

LUO Yanbo， ZHANG Yin，HU Ming，LI Lulu ， ZHANG Qing，ZHAO Xiaonan，

QI Jing ，CHEN Yibao，XU Xiaohui，LIU Yuqing

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Animal breeding and diseases Control， Shandong Jinan? 250100 China）

Abstract： 80 healthy 1-day-old chicks were randomly divided into four groups， with 20 chickens in each group. Among them， 1-3 groups are the experimental group， and Fuzheng Jiedu granules with the recommended dose of 1 times （4 g/L）， 3 times （12 g/L） and 5 times （20 g/L） are added to the drinking water respectively，but the drug is not added in group 4. Control group. During the 8-week test period， the clinical signs of each group of chickens are observed and recorded and chickens are weighed? once every weekend.At the end of the 8-week，blood are collected to determine the blood physiological and biochemical indicators of each group of chickens. Microscopic observation of tissue sections also will be done.At the same time，Escherichia coli was isolated from the intestinal tract of chickens in experimental group 2 （that is， three times the recommended dosage） for drug resistance analysis. The results showed that the behavior， feeding， and fecal traits of the test chickens in each group showed no abnormal changes compared with the blank control group. The body weight of the test chickens in the? group 1and the group 3? was significantly higher than that in the control group （P <0.05 or P <0.01） and the 5-dose group （P <0.05 or P <0.01）; while there was no significant difference between the group 1 and group 3（P> 0.05）. The blood physiological and biochemical indexes of red blood cells， hemoglobin， white blood cells and lymphocyte ratio were not significantly different in the chickens of each experimental group and the drug-free control group （P> 0.05）. There were no abnormal changes in the color， shape， size and position of organs in each group. Microscopic observation of tissue sections， cells conform to normal tissue morphology and structural characteristics. There was no significant difference in the MIC values of E. coli against the eight drugs （P> 0.05）. The above results indicate that Fuzheng Jiedu Granules have no obvious adverse effects on the chickens， and have no significant effect on the level of E. coli resistance.

Keywords： Fuzheng Jiedu Granules; Chicken; Blood; Physiological indexes; E. coli; Drug resistance