三氯乙烯致肝纖維化形成的動(dòng)態(tài)變化及其機(jī)制的研究

吳思蒙 王利剛 張雪燕 王太升 張繼紅?

1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132000;2.中國(guó)昆侖工程有限公司吉林分公司,吉林 吉林 132010

2012年美國(guó)環(huán)保局(US EPA)和國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將(trichloroethylene，TCE)列為1類致癌物[1]。盡管研究人員對(duì)TCE毒性做了大量研究，但TCE導(dǎo)致肝臟纖維化程度及發(fā)病機(jī)制尚不明確。本文研究了吸入三氯乙烯后小鼠肝臟產(chǎn)生不同程度纖維化，以及I型膠原(Collagen I)、α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－ SMA)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在小鼠肝組織中的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 TCE為分析純(美國(guó)Sigma公司);Collagen I、α－SMA、CTGF(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);顯微鏡(Olympus公司);SYD－B病理石蠟包埋機(jī)(沈陽(yáng)譽(yù)德電子儀器有限公司);RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司);ZPJ－1展片機(jī)(天津天利航空機(jī)電有限公司);GZX－9070MBE干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);LEICA ASP300S全自動(dòng)組織脫水機(jī);CV5030多功能染色玻璃封片機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康清潔級(jí)雄性小鼠45只(購(gòu)于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，體重16～18g，小鼠被飼養(yǎng)在干凈的動(dòng)物房里，并保持12小時(shí)光照/黑暗的晝夜節(jié)律，飼養(yǎng)條件為溫度22～26℃，相對(duì)濕度45～65%。

1.3 動(dòng)物染毒與分組 自由進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為三組，包括清潔空氣對(duì)照組(5只)、低濃度三氯乙烯組1500mg(20只)、高濃度三氯乙烯組5500mg(20只)。采用靜式吸入染毒法，染毒時(shí)用膠帶將染毒柜密封，試驗(yàn)時(shí)將染毒物質(zhì)迅速注入染毒柜內(nèi)有加熱功能的裝置中，打開風(fēng)扇使柜內(nèi)空氣分布均勻。將小鼠暴露于不同濃度的三氯乙烯氣體中，每天染毒2小時(shí)，染毒結(jié)束后分別在實(shí)驗(yàn)2個(gè)月、3個(gè)月時(shí)，各處死10只小白鼠并在無(wú)菌條件下取出肝臟。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 組織病理觀察:HE染色，網(wǎng)狀纖維染色。

1.4.2 免疫組化檢測(cè) 采用Envision法(多聚體兩步法)免疫組化檢測(cè)肝臟組織中α－SMA、Collagen I、CTGF蛋白的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用image－pro plus軟件測(cè)得平均光密度值，用±s表示，組內(nèi)比較選用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05則表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 HE染色結(jié)果顯示 清潔空氣對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞大小正常，細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)豐富，并以中央靜脈為圓心，肝細(xì)胞呈放射狀排列，肝索排列規(guī)則。相同濃度的染毒組兩個(gè)月時(shí)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞腫脹變性，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，小葉間纖維結(jié)締輕度增生;三個(gè)月時(shí)肝細(xì)胞變性加重，可見肝細(xì)胞壞死，小葉間可見成纖維樣細(xì)胞，匯管區(qū)和小葉間纖維結(jié)締組織增生，肝索排列紊亂，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。染毒時(shí)間相同，高濃度組比低濃度組肝細(xì)胞變性和纖維結(jié)締組織增生明顯。

2.1.2 Masson染色結(jié)果顯示 清潔空氣對(duì)照組肝組織無(wú)明顯膠原纖維增生。相同濃度的染毒組兩個(gè)月時(shí)有少量藍(lán)色膠原纖維增生，三個(gè)月時(shí)藍(lán)色膠原纖維增多。染毒時(shí)間相同時(shí)，高劑量組比低劑量組藍(lán)色膠原纖維增多明顯。

2.1.3 網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果顯示 對(duì)照組網(wǎng)狀纖維呈絮網(wǎng)狀均勻分布于肝組織中，未見網(wǎng)狀纖維增粗、融合。各染毒組肝組織內(nèi)網(wǎng)狀纖維失去正常分布狀態(tài)，匯管區(qū)周圍網(wǎng)狀纖維均有不同程度增粗。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

2.2.1 各組α－ SMA表達(dá)水平

染毒組α－SMA蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);吸入TCE濃度相同時(shí)，染毒三個(gè)月α－SMA蛋白表達(dá)水平高于染毒兩個(gè)月 (P＜0.05);吸入TCE時(shí)間相同時(shí)，高濃度染毒組α－SMA蛋白表達(dá)水平高于低濃度染毒 (P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)(±s n=10)

表1 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)(±s n=10)

注:與(A)比較?P＜0.05;與(B)比較＃P＜0.05;與(C)比較※P＜0.05;與(D)比較◎P＜0.05

組別α－SMA IOD值(積分光密度值)清潔空氣對(duì)照組(A) 0.022±0.010 2個(gè)月低濃度染毒組(B) 0.266±0.033?2個(gè)月高濃度染毒組(C) 0.475±0.056?＃3個(gè)月低濃度染毒組(D) 0.763±0.031?＃3個(gè)月高濃度染毒組(E) 0.918±0.333?※◎

2.2.2 各組Collagen I表達(dá)水平 染毒組Collagen I蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組 (P＜0.05);吸入TCE濃度相同時(shí)，染毒三個(gè)月Collagen I蛋白表達(dá)水平高于染毒兩個(gè)月 (P＜0.05);吸入TCE時(shí)間相同時(shí)，高濃度染毒組Collagen I蛋白表達(dá)水平高于低濃度染毒 (P＜0.05)，見表2。

表2 各組肝組織Collagen I蛋白的表達(dá)(±s n=10)

表2 各組肝組織Collagen I蛋白的表達(dá)(±s n=10)

注:與(A)比較?P＜0.05;與(B)比較＃P＜0.05;與(C)比較※P＜0.05;與(D)比較◎P＜0.05

0.014±0.004 2個(gè)月低濃度染毒組(B) 0.030±0.005?2個(gè)月高濃度染毒組(C) 0.053±0.006?＃3個(gè)月低濃度染毒組(D) 0.090±0.008?＃3個(gè)月高濃度染毒組(E) 0.110±0.006?※◎組別Collagen IIOD值(積分光密度值)清潔空氣對(duì)照組(A)

2.2.3 各組CTGF表達(dá)水平 染毒組CTGF蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組 (P＜0.05);吸入TCE濃度相同時(shí)，染毒三個(gè)月CTGF蛋白表達(dá)水平高于染毒兩個(gè)月(P＜0.05);吸入TCE時(shí)間相同時(shí)，高濃度染毒組CTGF蛋白表達(dá)水平高于低濃度染毒 (P＜0.05)，及表3。

表3 各組肝組織CTGF蛋白的表達(dá)(±s n=10)

表3 各組肝組織CTGF蛋白的表達(dá)(±s n=10)

注:與(A)比較?P＜0.05;與(B)比較＃P＜0.05;與(C)比較※P＜0.05;與(D)比較◎P＜0.05

0.017±0.004 2個(gè)月低濃度染毒組(B) 0.036±0.006?2個(gè)月高濃度染毒組(C) 0.058±0.005?＃3個(gè)月低濃度染毒組(D) 0.080±0.007?＃3個(gè)月高濃度染毒組(E) 0.108±0.007?※◎組別CTGFIOD值(積分光密度值)清潔空氣對(duì)照組(A)

3 討 論

TCE被列為I類致癌物，其職業(yè)暴露途徑主要為經(jīng)呼吸道和皮膚直接接觸，嚴(yán)重威脅職業(yè)性接觸TCE工人的健康。第一次由TCE引起病損的病例在1915年被報(bào)道，主要損傷部位在肝臟[3]，纖維化是其中之一。

HE染色常用來(lái)顯示組織或細(xì)胞一般形態(tài)的改變，也是觀察肝纖維化情況常用的染色方法之一;Masson和網(wǎng)狀纖維染色則是顯示纖維結(jié)締組織的重要染色方法，其能較為準(zhǔn)確地判斷出組織纖維化的嚴(yán)重程度[4]。

α－SMA是活化的成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，參與合成Ⅰ型膠原、Ⅲ 型膠原、纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，被認(rèn)為是肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志性蛋白并與肝纖維化有高度的相關(guān)性。

Collagen I是誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其含量的高低在一定程度上反應(yīng)了肝纖維化嚴(yán)重程度。抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，減少Collagen I的產(chǎn)生可以減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化[5]。

CTGF在機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)及器官纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中起到中心調(diào)節(jié)作用，是器官纖維化疾病緩慢進(jìn)展的重要細(xì)胞因子，被認(rèn)為是纖維化疾病的“總開關(guān)”。肝星狀細(xì)胞的激活及表型改變被認(rèn)為是肝纖維化進(jìn)展中細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，CTGF信使RNA水平顯著增加，CTGF可能是刺激肝星狀細(xì)胞活化增殖的關(guān)鍵因子之一。

本研究通過Masson和網(wǎng)狀纖維染色印證了肝纖維化的存在，吸入TCE可致小鼠肝纖維化，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)、劑量增加纖維化程度越重。TCE所導(dǎo)致肝纖維化時(shí)肝組織α－SMA、Collagen I表達(dá)明顯增強(qiáng)，CTGF信號(hào)傳導(dǎo)通路功能明顯增強(qiáng)，對(duì)肝纖維化發(fā)生發(fā)展起到了正反饋效果。作為慢性疾病的早期階段，早期纖維化階段被普遍認(rèn)為具有可逆性，并非不可逆的“疤痕組織”。因此，阻斷早期肝纖維化進(jìn)程可以成為治療慢性肝疾病新的切入點(diǎn)，使慢性肝病在早期階段就有治愈的可能性。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制CTGF表達(dá)能阻斷TGF－β1/Smads通路，進(jìn)而阻斷肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。目前肝纖維化治療中已經(jīng)有CTGF靶向疫苗能夠抑制小鼠肝纖維化發(fā)展，未來(lái)CTGF可能成為抗肝纖維化治療的重要靶點(diǎn)。由于本次實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間較短，小鼠數(shù)量較少，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果有些許偏差，接下來(lái)會(huì)對(duì)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)而深入研究為臨床診治工作提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。