HBV前基因組RNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥后復(fù)發(fā)風險的相關(guān)性

陳靖賾 祁瑋 胡明樂 李華東 王靜

研究顯示，抗病毒治療后，慢性乙型肝炎患者HBV DNA與HBV RNA均出現(xiàn)下降，且相較于HBV RNA，HBV DNA下降更快，HBV RNA逐漸升高并最終成為主要的病毒成分[1]。HBV RNA病毒顆粒所包含的核酸HBV前基因組RNA水平(pgRNA)在HBV復(fù)制過程中起著至關(guān)重要的作用，可反轉(zhuǎn)錄形成負鏈DNA，成為cccDNA與HBV DNA之間的橋梁，即rcDNA的模板，而抗病毒藥物不能直接作用于cccDNA轉(zhuǎn)錄過程，故肝細胞核中仍存在無法清除的HBV cccDNA，增加停藥后復(fù)發(fā)的風險[2]。本研究探討HBV pgRNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥后復(fù)發(fā)風險的相關(guān)性，旨在為預(yù)防慢性乙型肝炎患者停藥后復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、病例來源及納入排除標準

選取2017年5月至2019年5月武漢市金銀潭醫(yī)院已接受治療且符合停藥標準的224例慢性乙型肝炎患者為研究對象。納入標準：①符合慢性乙型肝炎診斷標準[3]均接受規(guī)范化治療；②符合停藥標準[4]，HBeAg陽性者HBV DNA低于檢測下限、ALT復(fù)常、HBeAg血清學轉(zhuǎn)換，至少持續(xù)1年以上無異常；HBeAg陰性者HBV DNA水平低于檢測下限，鞏固治療至少一年半，總療程不少于2年半；③無肝硬化證據(jù)。排除標準：①合并其他病毒感染或伴有自身免疫性肝??；②接受過肝移植或計劃肝移植者；③合并免疫缺陷疾病或癌癥。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

二、方法

1. 一般資料收集：患者人口學資料包括年齡、病程、性別、HBV感染家族史、飲酒史、HBV基因型、體重指數(shù)等。

2. HBV血清學標志物檢測：采用微粒子酶免疫分析技術(shù)及HBV診斷試劑盒[ABBOTT(雅培)公司]對停藥時HBsAg、抗-HBe、HBeAg進行檢測，記錄HBeAg消失時間、HBeAg血清學轉(zhuǎn)換時間、停藥時有無抗-HBe。

3. HBV DNA 定量分析：采用實時熒光定量PCR法，經(jīng)熒光定量核酸分析儀(Roche Light Cycler)及HBV核酸擴增熒光檢測試劑盒(深圳匹基生物工程有限公司)對HBV DNA 定量分析。

4. HBVpgRNA水平檢測：從HepG 2.2.15細胞上清液中提取總HBV RNA，采用賽默費希爾科學公司生產(chǎn)的HBV反轉(zhuǎn)錄引物第一鏈DNA合成試劑盒，將樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴增中使用HBV pgRNA的上游和下游特異性引物。常規(guī)PCR擴增后，用北京天根公司生產(chǎn)的通用純化和回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，然后與質(zhì)粒連接(北京轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)公司)。將其轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中，挑選陽性菌落后經(jīng)PCR再次篩選。采用北京天根公司生產(chǎn)的TIANprep微型質(zhì)粒試劑盒對陽性質(zhì)粒分離并測序，同時采用該公司生產(chǎn)的稀釋緩沖液以1 × 10連續(xù)稀釋質(zhì)粒，以10倍稀釋制備標準品(1×1010份數(shù)/mL)；最后采用熒光定量PCR儀檢測血清pgRNA水平。

5. 血清實驗室指標檢測：采用生化分析儀(Beckman CX7)和原裝試劑對血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)進行檢測。

三、隨訪

停藥后前3個月內(nèi)每個月隨訪1次，后每3個月隨訪1次，隨訪2年，每次隨訪觀察肝功能、血清HBV病毒學標志物等。截止時間2021年5月1日，以停藥后復(fù)發(fā)為隨訪終點。復(fù)發(fā)標準：獲得病毒學應(yīng)答的患者停藥后，間隔1個月2次檢測HBV DNA均>2×103IU/mL。

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、隨訪結(jié)果

截至2021年5月1日，共6例因各種原因失訪，最終納入218例，其中70例(32.11%)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。

二、兩組患者一般資料對比

兩組患者年齡、病程、性別、HBV感染家族史、合并癥、Child-Pugh分級、飲酒史、HBV基因型、體重指數(shù)對比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

三、實驗室指標對比

兩組患者AST、HBeAg消失時間、HBeAg血清學轉(zhuǎn)換時間、炎癥活動度、HBeAg對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，ALT、HBV DNA、停藥時HBsAg、停藥時有無抗-HBe、HBVpgRNA水平對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

四、慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)風險的Cox回歸分析

將停藥復(fù)發(fā)情況作為因變量(1=復(fù)發(fā)，0=未復(fù)發(fā))，Cox回歸分析顯示，HBVpgRNA水平、ALT、停藥時HBsAg水平、HBV DNA為慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)危險因素(均P<0.05)，見表3。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 兩組患者實驗室指標比較

表3 慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)風險Cox 回歸分析

五、HBVpgRNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)風險的相關(guān)性

限制性立方條圖顯示，HBVpgRNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)風險呈顯著非線性關(guān)系(χ2=24.710 ，P<0.01)。見圖1。

圖1 HBVpgRNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)風險間的限制性立方條圖

討 論

即使按照現(xiàn)行的慢性乙型肝炎管理共識或指南建議的標準停藥，慢性乙型肝炎患者停藥后的復(fù)發(fā)率仍高達20%～50%[5,6]。Chang等[7]對77例慢性乙型肝炎患者使用核苷酸IDE類似物后隨訪發(fā)現(xiàn)，32.5%停藥后復(fù)發(fā)。Kuo等[8]的研究中招募了122例接受恩替卡韋或TDF治療的HBeAg陰性患者，結(jié)果顯示，53例患者3年累積病毒學復(fù)發(fā)率為46.6%；累積復(fù)發(fā)率為32.11%，低于該研究，可能與隨訪時間長短有關(guān)，但仍提示應(yīng)重視慢性乙型肝炎患者停藥后復(fù)發(fā)情況，并密切隨訪。慢性乙型肝炎的根治需要清除被HBV感染肝細胞中的cccDNA，但即使在成功清除血清 HBV DNA 和HBsAg 數(shù)年后，肝內(nèi)仍可能有低水平的cccDNA存在，提示仍無法徹底清除細胞內(nèi)cccDNA[9]。HBV pgRNA以病毒顆粒形式表達于相關(guān)性肝病患者的血清中。研究顯示，pgRNA在HBV DNA陰轉(zhuǎn)后較長時間內(nèi)仍可測，且理論上pgRNA是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生rcDNA所必須的模板[10]。而慢性乙型肝炎藥物治療的關(guān)鍵是阻斷反轉(zhuǎn)錄過程而發(fā)揮作用，因此，只要pgRNA仍然存在，停藥后rcDNA便可再次被反轉(zhuǎn)錄，血清中可再次測得HBV DNA，即復(fù)發(fā)。相反，若pgRNA被完全清除，此時rcDNA也隨之失去反轉(zhuǎn)錄模板，血清中HBV DNA水平也不會再次出現(xiàn)升高，故pgRNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥后復(fù)發(fā)風險間的關(guān)系得到關(guān)注。

Manolakopoulos等[11]研究顯示，基線 ALT 每升高1倍正常值上限，復(fù)發(fā)風險則增加1.03倍(95%CI：0.96～ 1.10)。本研究中ALT為慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)的危險因素，但危險因素HR值接近1，提示ALT作為慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)的危險因素仍需進一步討論，出現(xiàn)這種情況的原因可能與研究對象在治療前均予以護肝降酶治療，對血清ALT水平造成不同程度的影響有關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，兩組停藥時有無抗-HBe具有差異，Cox回歸分析中抗-HBe無顯著差異，說明停藥時有無抗-HBe與復(fù)發(fā)無關(guān)。一項長期隨訪研究也顯示，停藥24周時的血清抗-HBe是否存在與復(fù)發(fā)無關(guān)，這可能是因為抗-HBe并非保護性抗體[12]。

治療結(jié)束時(停藥時)HBsAg水平可以預(yù)測長期隨訪中的HBsAg清除，獲得HBsAg清除者的復(fù)發(fā)率明顯降低。一項對HBeAg陽性患者干擾素治療的研究顯示，在78周時血清 HBsAg<1000 IU/mL者更有可能在長期隨訪中獲得持續(xù)應(yīng)答及HBsAg清除[13]。一項研究顯示，治療結(jié)束24周血清HBsAg 350 IU/mL是在近期應(yīng)答者中有效識別低復(fù)發(fā)風險的臨界值[14]。Luo等[15]研究中揭示了HBV DNA可預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)率。一項10年的隊列研究顯示，HBV DNA陰性(HR1.246，P=0.010)可用于病毒學復(fù)發(fā)潛在預(yù)測[16]。本研究顯示，停藥時HBsAg水平、HBV DNA為慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)危險因素，與上述研究相符。

雖然HBV一直以來被定義為有包膜的不完整雙鏈DNA病毒，但早期研究已在慢性HBV感染者血清中檢測到HBV RNA的存在，且研究證實這些血清HBV RNA實質(zhì)就是核衣殼內(nèi)未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的pgRNA[17]，與rcDNA一樣，這些pgRNA以類病毒顆粒的形式存在于成熟病毒顆粒的核衣殼內(nèi)，這一發(fā)現(xiàn)是對HBV經(jīng)典復(fù)制過程的重要補充。Furutani等[18]研究顯示，IFNα可通過提高pgRNA的m6A RNA修飾水平，降低pgRNA的穩(wěn)定性，從而抑制HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生。有研究證實，血清pgRNA可作為長期NAs治療且血清HBV DNA檢測不到的肝癌患者預(yù)后和復(fù)發(fā)的潛在預(yù)測因子[19]。Lin等[20]研究顯示，在17.57%病例中，即使HBV DNA水平低于20 IU/mL，也能檢測到HBV pgRNA，這也間接說明了血清HBV pgRNA水平可為停藥后復(fù)發(fā)風險提供參考。Luo等[21]的研究揭示了NA治療后的HBV pgRNA狀態(tài)可以預(yù)測慢性HBV患者的長期預(yù)后，在治療48周后保持HBVpgRNA陽性的患者具有增加的風險(95%CI：34.80～61.20)。本研究中，HBV pgRNA水平(HR=1.235，95%CI：1.064～1.432)為慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)危險因素，且限制性立方條圖顯示，HBV pgRNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)風險呈顯著非線性關(guān)系，其可能HBV pgRNA 的唯一來源僅為 HBV cccDNA，可作為 HBV cccDNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，替代反映肝細胞內(nèi) HBV cccDNA 水平及 HBV 活躍程度，故對慢性乙型肝炎患者停藥復(fù)發(fā)風險具有較高的預(yù)測價值。

綜上所述，HBV pgRNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥后復(fù)發(fā)風險相關(guān)，可作為慢性乙型肝炎患者停藥后復(fù)發(fā)風險的參考依據(jù)。由于各種客觀原因的條件限制，未追蹤患者停藥后復(fù)發(fā)風險各實驗室指標和HBV pgRNA水平的進展過程，未能進一步分析停藥后HBV pgRNA水平的變化情況；其次，樣本量相對較少，仍需更詳細的研究來闡明HBV pgRNA水平與慢性乙型肝炎患者停藥后復(fù)發(fā)風險間的關(guān)系。