模塊化工程大腸桿菌從頭合成丁香酚

趙廣榮，曹嘉譽，馬雅婷，邱澤天，李?嘉

模塊化工程大腸桿菌從頭合成丁香酚

趙廣榮1, 2，曹嘉譽1, 2，馬雅婷1, 2，邱澤天1, 2，李?嘉1, 2

(1. 天津大學化工學院，天津 300350；2. 教育部合成生物學前沿科學中心和系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300350)

丁香酚是一種綠色生物農(nóng)藥，主要用于防治番茄灰霉病、葡萄霜霉病和馬鈴薯晚疫病等主要的農(nóng)業(yè)病害．目前丁香酚是從丁香和羅勒等植物中提取制備，其規(guī)模和產(chǎn)能受到限制，還存在廢渣排放影響生態(tài)環(huán)境的問題．本研究采用合成生物學和模塊化工程策略，設計構建工程大腸桿菌，以期微生物從頭合成丁香酚．將丁香酚異源合成途徑分成3個模塊，分別是上游的阿魏酸合成模塊、中游的松柏醇合成模塊和下游的丁香酚合成模塊，對每個模塊進行不同來源基因的組合篩選和表達優(yōu)化．利用His標簽、敲除甲基供體合成途徑中的全局調控基因，優(yōu)化了上游模塊(PcTAL-HpaBC-AtCOMT)，減少了中間產(chǎn)物咖啡酸的積累，提高了阿魏酸合成．篩選了4CL和醇脫氫酶基因來源，研究了表達模式，獲得最優(yōu)的中游模塊是雙順反子表達At4CL1-AtCCR1，單順反子表達YahK，松柏醇產(chǎn)量最高．對3個?；D移酶基因和4個丁香酚合成酶基因進行組合篩選，獲得最優(yōu)的下游模塊是單順反子PhCFAT和GdlEGS2，丁香酚合成最多．最后，在酪氨酸高產(chǎn)底盤中表達丁香酚合成途徑，對初始葡萄糖、酵母提取物和誘導劑濃度等進行優(yōu)化．在適宜的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，丁香酚的產(chǎn)量為114.67mg/L．本文采用模塊化代謝工程策略優(yōu)化丁香酚異源合成途徑，改造底盤菌株，首次實現(xiàn)了微生物從頭合成丁香酚，具有重要應用前景．

丁香酚；大腸桿菌；代謝工程；合成生物學

化學農(nóng)藥的應用對土壤、水體和大氣等生態(tài)和環(huán)境造成污染和破壞，同時影響了農(nóng)副產(chǎn)品的質量．生物農(nóng)藥具有殺滅病蟲害的選擇性強、對人畜安全性高、易降解對環(huán)境生態(tài)影響小等特點，其開發(fā)和使用成為當前全球的熱點[1-3]．丁香酚是一種高效的植物源生物農(nóng)用殺菌劑，其具有抗菌活性是阻斷質子泵、主動轉運以及對細胞內(nèi)含物的聚沉作用[4]，已被農(nóng)藥管理部門批準，應用于防治番茄灰霉病、葡萄霜霉病和馬鈴薯晚疫病等主要的農(nóng)業(yè)真菌病害．

丁香酚作為天然生物活性化合物主要是從植物中提取分離制備[5]，合成生物學和代謝工程的快速發(fā)展為天然產(chǎn)物的規(guī)?；a(chǎn)提供了新思路[6-9]．結構上，丁香酚屬于苯丙烷類天然產(chǎn)物，通過莽草酸途徑合成．在微生物中合成丁香酚主要涉及8個功能酶．酪氨酸在氨基裂解酶(TAL)催化下生成對香豆酸，被3-羥化酶(HpaBC)催化生成咖啡酸．通過甲基轉移酶(COMT)催化咖啡酸，生成阿魏酸．輔酶A連接酶(4CL)對阿魏酸進行活化，生成阿魏酰-CoA．在還原酶(CCR)催化下，生成松柏醛，進一步被還原成松柏醇．在?；D移酶(CFAT)催化下生成松柏醇乙酰酯，最后在丁香酚合成酶催化下，脫除乙酸基，生成丁香酚(圖1)．

模塊化工程是合成生物學的一個重要原則，將代謝途徑劃分為多個模塊，分別進行設計構建和調控優(yōu)化[10-11]，實現(xiàn)各代謝模塊之間的最優(yōu)適配性，從而使整個代謝途徑的碳代謝流最大化[12-14]．模塊化工程策略的優(yōu)點是降低了冗長途徑的復雜度，簡化了構建和優(yōu)化過程，節(jié)省時間，因此廣泛應用于代謝途徑的重構中．本文采用模塊化代謝工程策略，將丁香酚生物合成途徑分阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)模塊、松柏醇(coniferyl alcohol，CA)模塊和丁香酚(eugenol，EG)模塊(圖1)．對不同生物來源的同工酶進行組合和優(yōu)化，構建了丁香酚的人工合成途徑，以期實現(xiàn)工程大腸桿菌以葡萄糖為碳源發(fā)酵合成丁香酚．

圖1?工程大腸桿菌合成丁香酚代謝途徑

1?材料與方法

1.1?菌株及質粒

對矮牽牛來源的松柏醇?；D移酶PhCFAT (GenBank ABG75942.1)基因、三齒拉雷亞灌木的?；D移酶LtCAAT1(GenBank KF543260.1)基因、擬南芥來源的HXXXD型?；D移酶AtAT(NCBI Ref-erence Sequence NP_178020.1)基因，來源于啤酒花的丁香酚合成酶CbEGS1(GenBank KF543260.1)基因、手掌參蘭花的丁香酚合成酶GdlEGS2(GenBankAKB11750.1)基因、三齒拉雷亞灌木的(異)丁香酚合成酶LtAPS1(GenBank KF543262.1)基因和小茴香的(異)丁香酚合成酶PaAIS1(GenBank ACL13526.1)基因，來源于擬南芥的At4CL1(GenBank CP002684.1)基因、AtCCR1(GenBank AF332459.1)基因、AtCOMT (GenBank CP002688.1)基因，以及來源于克氏桿菌的酪氨酸裂解酶PcTAL(NCBI Reference Sequence XM_007398051.1)基因進行密碼子優(yōu)化，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；來源于大腸桿菌的(GenBank CAQ33376.1)基因、(GenBank CAQ30801.1)基因、(GenBank CAQ34705.1)基因由大腸桿菌BL21(DE3)基因組為模板PCR擴增獲得；來源于伯克霍爾德氏菌的基因、天藍色鏈霉菌的基因以及幽門螺桿菌的基因皆由實驗室保存．大腸桿菌DH5α用于基因克隆和質粒構建，大腸桿菌BL21(DE3)用于丁香酚的合成．本文構建的載體與菌株如表1和表2所示．

表1?菌株

Tab.1?Strains used in this study

表2?質粒

Tab.2?Plasmids used in this study

1.2?主要試劑

丁香酚(純度≥98%)、松柏醇(純度≥97%)、阿魏酸(純度≥98%)、咖啡酸(純度≥98%)、對香豆酸(純度≥98%)、酪氨酸(純度≥98%)購自大連美侖生物科技公司．分析純甲醇、分析純乙腈購自康科德科技有限公司．質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、無縫克隆試劑盒和DNA聚合酶購自諾唯贊生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自賽默飛世爾．表3所示的PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成．

表3?PCR引物序列

Tab.3?PCR primer sequences

1.3?表達載體構建

本文主要采用PCR擴增、酶切和連接方法或無縫克隆方法，構建的基因表達載體信息如表2所示．

設計同源臂，將His標簽設計在引物中，利用無縫克隆試劑盒構建表達載體pMYT4-7．類似地，構建阿魏酸表達載體pMYT12及松柏醇表達載體pMYT23-28．

PCR擴增目的基因，將酶切位點設計在引物中，采用酶切連接方法，將目的基因按需分別連接至pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1和pRSF-Duet-1上，構建表達載體pCJY1-14、pCA1-4．

1.4?培養(yǎng)基與發(fā)酵方法

LB培養(yǎng)基：NaCl 10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，pH＝7.0．固體LB培養(yǎng)基還需要加入15～20g/L的瓊脂粉．使用時按需加入相應工作濃度的抗生素．

M9Y培養(yǎng)基：Na2PO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO43.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，酵母提取物 1.0g/L，pH＝7.2．

發(fā)酵培養(yǎng)基配制：向50mL的M9Y培養(yǎng)基加入滅菌的1mol/L MgSO4100μL、1mol/L CaCl25μL、10g/L葡萄糖，使用時按需加入相應工作濃度的抗生素．

發(fā)酵：取過夜活化的菌液接種到含有50mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37℃、220r/min下培養(yǎng)3～4h至OD600值為0.8～1.0．加入0.1mmol/L IPTG誘導，30℃，250r/min培養(yǎng)24h．發(fā)酵結果取3次重復的平均值(標準偏差)．

1.5?檢測與分析

使用Primaide高效液相色譜(HPLC)測定L-酪氨酸、對香豆酸、咖啡酸等代謝物．使用氣相色譜(GC)Agilent 7820A測定阿魏酸、松柏醇、丁香酚等代謝物．

在500μL樣品中加入等體積的1mol/L鹽酸進行溶解，離心后上清用孔徑0.22μm濾膜過濾，用于HPLC分析檢測L-酪氨酸．使用4.6×250mm C18色譜柱，流動相組成為95%甲醇∶5%水，再添加15g/L磷酸，流速1mL/min；紫外檢測波長230nm，進樣量10μL．標準曲線至少利用5個點標定，相關系數(shù)2大于0.99(下同)．

取發(fā)酵液樣品3mL，加入等體積乙酸乙酯充分振蕩，收集上層有機相．采用旋蒸或者氮吹法去除乙酸乙酯，然后用甲醇重新溶解產(chǎn)物，經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾后，用于HPLC檢測對香豆酸及咖啡酸．使用4.6×250mm C18色譜柱，流動相組成為30%乙腈∶30%水，再添加1g/L磷酸，流速1mL/min；紫外檢測波長280nm，進樣量10μL．

取發(fā)酵液樣品3mL，加入等體積乙酸乙酯充分振蕩后，取少量有機相，利用無水硫酸鈉除水后用0.22μm有機濾膜過濾，用于氣相檢測阿魏酸、松柏醇及丁香酚．升溫程序為初始溫度60℃，保持1min，20℃/min升到240℃，保持5min，之后??10℃/min升到280℃，然后320℃后運行8min．進樣口溫度為280℃，檢測器溫度為320℃．氮氣的流速為3mL/min，分流比為10．

2?結果與討論

2.1?阿魏酸模塊構建與優(yōu)化

由克氏桿菌的酪氨酸氨基裂解酶基因、大腸桿菌的羥化酶基因和擬南芥的甲基轉移酶基因構成從酪氨酸到阿魏酸的合成途徑，首先對基因表達進行優(yōu)化．對PcTAL的N端添加His 標簽，發(fā)現(xiàn)菌株MYT6合成對香豆酸的產(chǎn)量提高了5.47倍(圖2(a))．類似地，對AtCOMT 的N端添加His 標簽，發(fā)現(xiàn)菌株MYT8合成阿魏酸的產(chǎn)量提高了2.47倍(圖2(b))．這可能是前綴His標簽有利于異源蛋白在大腸桿菌中的表達，提高酶的活性，與文獻[15]報道是一致的．

圖2?阿魏酸合成模塊的構建與優(yōu)化

用優(yōu)化的His-PcTAL、His-AtCOMT、HpaBC基因構建pMYT12質粒，導入BL(DE3)中，構建了FA1菌株．雖然合成了阿魏酸，但發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中存在中間產(chǎn)物咖啡酸的積累(圖2(c))．從咖啡酸到阿魏酸的轉化為甲基化反應，涉及甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的參與，我們推測可能為SAM不足導致咖啡酸．基于SAM的合成途徑[16]，這里敲除全局負調控基因，共表達優(yōu)化后pMYT12，構建了FA2菌株．發(fā)酵結果顯示，沒有檢測到咖啡酸的積累，從頭合成27.74mg/L阿魏酸(圖2(c))．表明解除阻遏調控，是增強SAM供應的一種策略．

2.2?松柏醇模塊構建與優(yōu)化

松柏醇合成模塊涉及到4CL、CCR和脫氫酶3個基因，首先對不同來源的基因進行組合篩選．選擇對阿魏酸具有較強特異性的擬南芥At4CL和天藍色鏈霉菌Sco4CL以及伯克霍爾德氏菌的Bmfcs[17-19]為候選4CL酶，同樣地，擬南芥來源的AtCCR1被證實對阿魏酸酰CoA到松柏醛的反應具有較高催化活?性[20]．由于松柏醛到松柏醇為脫氫還原反應，基于序列的同源性[21]，選擇大腸桿菌對醛基的催化效率較高的醇脫氫酶YahK和YgiB[22-23]、幽門螺桿菌的HpCAD[24]作為候選酶．

為了驗證這些酶的功能，在AtCCR1不變的情況下，筆者設計了一套組合實驗，構建了9個菌株(圖3(a))，以獲得松柏醇合成模塊的最佳酶組合．表達Sco4CL的菌株僅產(chǎn)生少量的松柏醇，遠低于At4CL1和Bmfcs．另一方面，表達YahK和YgiB合成的松柏醇含量在125.73～140.11mg/L之間，遠?高于表達HpCAD，而且yahK優(yōu)于ygiB．因此At4CL1、AtCCR1和yahK是最適合的松柏醇合成??模塊．

其次，優(yōu)化松柏醇合成模塊的基因表達模式．以pETDeut-1為骨架載體，對3個基因進行單(雙)順反子表達設計，構建了6種表達載體(圖3(b))，并導入大腸桿菌，構建了菌株MYT28-MYT33．發(fā)酵結果表明(圖3(c))，不同表達模塊中松柏醇的產(chǎn)量相差很大．最適宜的表達模式是雙順反子表達At4CL1和AtCCR1，單順反子表達yahK時，菌株MYT28合?成 145.60mg/L的松柏醇．進一步表明異源基因在?載體上的排列順序和組合對整個模塊功能有較大?影響，這種現(xiàn)象在代謝工程合成紫杉醇前體中也被?報道[10]．

圖3?松柏醇合成模塊的構建與優(yōu)化

2.3?丁香酚合成模塊的構建與優(yōu)化

丁香酚合成模塊由兩個酶組成，松柏醇酰基轉移酶和丁香酚合成酶．以文獻報道最高活性的PhCFAT[25]氨基酸序列為模板，通過NCBI smart blast(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/smarblast/smartBlast.cgi)搜索，找到同源性較高的擬南芥的乙醇羥基轉移酶(AtAT)．LtCAAT1也具有松柏醇?；D移酶活??性[26]，作為候選酶之一．已經(jīng)有多種植物來源的丁香酚合成酶被鑒定，通過比較Km等酶學動力參數(shù)，選取CbEGS1、GdlEGS2、LtAPS1和PaAIS1[27-29]作為丁香酚合成酶候選酶．按單順反子模式，將3個?；D移酶基因和4個丁香酚合成酶基因克隆到pRSFDuet-1骨架載體上，構建12個表達載體，并導入BL21(DE3)細胞，獲得12個菌株CJY1-CJY12.培養(yǎng)基中添加松柏醇，進行發(fā)酵．如圖4(a)所示，所有菌株在11.23min出現(xiàn)一個新峰，與丁香酚標準品具有相同的保留時間．經(jīng)過質譜鑒定，新峰產(chǎn)物為丁香酚．表明所選擇的12個基因在大腸桿菌中表達后具有催化功能，能合成丁香酚．以共表達PhCFAT和GdlEGS2的菌株CJY10合成最多的丁香酚，為67.20mg/L．

圖4?丁香酚合成模塊的構建與優(yōu)化

2.4?葡萄糖發(fā)酵合成丁香酚

丁香酚合成前體酪氨酸受到基因的全局負調控[30]，為了增強酪氨酸的供給，在MYT1的基礎上敲除基因，得到一株底盤菌株MYT2，酪氨酸產(chǎn)量達到138.76mg/L(圖5(a))．為了驗證中低拷貝數(shù)質粒對丁香酚合成模塊表達的影響，將阿魏酸合成模塊pMYT12、松柏醇合成模塊pMYT23、丁香酚模塊pCJY13(或pCJY14)導入MYT2中，得到丁香酚合成菌株EG1和EG2．用葡萄糖發(fā)酵，結果如圖5(b)所示，菌株EG2可以從頭合成更多的丁香酚，為43.64mg/L．

不同的發(fā)酵參數(shù)在不同程度上會影響大腸桿菌合成異源產(chǎn)物的能力[31]．為了提高丁香酚的產(chǎn)量，進行遞進式優(yōu)化發(fā)酵工藝．首先對IPTG誘導劑工作濃度進行優(yōu)化，結果如圖6(a)所示．IPTG濃度越高，丁香酚產(chǎn)量呈下降趨勢，同時生物量減少，表明高濃度的誘導不利于丁香酚的合成和細胞生長．其次對發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度進行優(yōu)化，結果如圖6(b)所示，5g/L葡萄糖的產(chǎn)量最低，但超過10g/L葡萄糖，丁香酚產(chǎn)量和生物量沒有得到提高．最后對酵母提取物濃度進行優(yōu)化，結果如圖6(c)所示，1g/L酵母提取物的產(chǎn)量最高，進一步提高酵母提取物濃度，雖然有利于細胞生長，但丁香酚產(chǎn)量顯著下降．為此得到最優(yōu)的發(fā)酵條件為0.1mmol/L IPTG、10g/L葡萄糖和1g/L酵母提取物．控制發(fā)酵起始OD600為1，發(fā)酵18h，從頭合成114.67mg/L丁香酚(圖6(d))．

圖5?工程大腸桿菌從頭合成丁香酚

圖6?優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)從頭合成丁香酚

3?結?語

在丁香酚的生物合成中，碳骨架來源于酪氨酸和S-腺苷甲硫氨酸，敲除阻芳香氨基酸合成途徑的全局遏基因以及腺苷甲硫氨基酸途徑中的全局負調控基因，增強了前體酪氨酸合成和甲基供體的供給，減少了中間副產(chǎn)物，提高了產(chǎn)物的代謝流通量，得到丁香酚合成底盤菌株．

采用模塊化代謝工程策略，將丁香酚生物合成途徑分成3個模塊并對每個模塊進行不同來源基因篩選和表達優(yōu)化，構建了工程大腸桿菌，首次實現(xiàn)了丁香酚的從頭微生物合成．

農(nóng)業(yè)真菌病害較難防治，其造成的作物損失受到全球的廣泛關注，對生物農(nóng)藥的需求日益劇增．本文研發(fā)了丁香酚的微生物合成技術，有望在未來具有較大的應用前景．

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Modular Engineering offorProduction of Eugenol

Zhao Guangrong1, 2， Cao Jiayu1, 2，Ma Yating1, 2，Qiu Zetian1, 2，Li Jia1, 2

(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China；2. Frontier Science Center for Synthetic Biology and Key Laboratory of System Bioengineering (Ministry of Education)，Tianjin 300350，China)

Eugenol is a green biological pesticide that is mainly used to control agricultural diseases，such as tomato gray mold，grape downy mildew，and potato late blight. Since eugenol has been extracted only from cloves，basil，and other plants so far，its production rate is poor and is unfriendly to the environment in terms of waste residue discharge. In this study，in order to synthesize eugenolusing microorganisms，synthetic biology and modular engineering strategies were used for designing，constructing，and engineering. The eugenol heterogeneous synthesis pathway was divided into three modules，namely the upstream module for ferulic acid synthesis，midstream module for coniferyl alcohol synthesis，and downstream module for eugenol synthesis. Combinatorial screening of enzymes from different sources in these modules and expression optimization of each module were performed. By using His-tag and knocking out the global regulatory gene，the upstream module(PcTAL-HpaBC-AtCOMT)was optimized to reduce the accumulation of intermediate caffeic acid and increase the synthesis of ferulic acid. 4CL and alcohol dehydrogenase genes were screened，and their expression patterns were studied.The optimal midstream module was the one having a bicistronic expression of At4CL1-AtCCR1 and monocistronic expression of YahK，which maximized the yield of coniferyl alcohol. Combinatorial screening of three acyltransferase genes and four eugenol synthase genes resulted in the most eugenol synthesis，with monocistronic PhCFAT and GdlEGS2. The eugenol synthesis pathway was expressed in a tyrosine-over-producing chassis. By optimizing the initial concentration of glucose，yeast extract，and inducer，the eugenol yield reached 114.67mg/L within a suitable medium and fermentation conditions. By modularly optimizing the eugenol heterogeneous synthesis pathway and transforming the chassis strains，the firstsynthesis of eugenol by microorganisms was realized herein with a promising application prospect.

eugenol；；metabolic engineering；synthetic biology

10.11784/tdxbz202103018

Q815

A

0493-2137(2022)07-0728-09

2021-03-08；

2021-05-26.

趙廣榮（1966—??），男，博士，教授.Email：m_bigm@tju.edu.cn

趙廣榮，grzhao@tju.edu.cn.

廣東省重點領域研發(fā)計劃資助項目(2020B0303070002).

the Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province(No. 2020B0303070002).

(責任編輯：田?軍)