低分子量骨膠原肽酶解制備工藝優(yōu)化和特性分析

姚玉梅 袁湘汝 韓魯佳 楊增玲 劉 賢

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083)

0 引言

目前，環(huán)保型膠黏劑主要包括蛋白膠、淀粉膠、木質(zhì)素膠、單寧膠等[1]。其中，基于蛋白質(zhì)及其蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物衍生的蛋白基膠黏劑因其特有的高固含量、無毒無害、優(yōu)異的熱塑性和易降解性受到了國內(nèi)外研究者的關(guān)注。

我國動物蛋白質(zhì)產(chǎn)品總產(chǎn)量穩(wěn)居世界首位，據(jù)統(tǒng)計，2019年我國肉類產(chǎn)量達7 758.8萬t[2]。作為畜禽屠宰的副產(chǎn)物，畜禽骨骼占胴體的20%～30%，年產(chǎn)量約為2 000萬t。畜禽骨骼中富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)骨膠原、軟骨素和礦物元素等營養(yǎng)成分，可作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源和脂質(zhì)來源，對其開展深度綜合利用和高值高效轉(zhuǎn)化對環(huán)境保護和資源循環(huán)利用具有實際意義。受限于動物骨骼獨特的組成結(jié)構(gòu)和組成成分，動物骨骼中的膠原蛋白常經(jīng)水解工藝制備骨膠原肽，后與其它化學(xué)交聯(lián)劑制備骨蛋白基膠黏劑[3-5]，其化學(xué)式為C102H151O39N31，現(xiàn)已應(yīng)用為生物質(zhì)燃料膠黏劑、鑄造膠黏劑、紙塑膠黏劑、標簽?zāi)z黏劑[6]。

骨膠原肽的分子量分布對骨膠原肽基復(fù)合材料的性能和微結(jié)構(gòu)影響顯著，即在一定的骨膠原肽分子量區(qū)間內(nèi)，其材料化開發(fā)的結(jié)構(gòu)與性能最優(yōu)[7-9]，更利于骨膠原肽基材料的增值增效與應(yīng)用推廣。當(dāng)分子量分布較廣或較窄時，易導(dǎo)致復(fù)合材料的防潮性差、初黏性低、力學(xué)性能差等問題[9]，這是由于蛋白質(zhì)的水解程度不僅影響了骨膠原肽分子量分布，還間接影響了其理化性能，如溶解度、膠凝能力、起泡性和穩(wěn)定性[10-11]。一般而言，水解度與蛋白酶解產(chǎn)物的分子量及分布呈負相關(guān)，即水解度較低時，分子量較大且分布區(qū)間較寬；水解度較高時，分子量變小、分布區(qū)間較窄，而產(chǎn)物的分子量越接近中心值，分子量分布區(qū)間越小，分子量的均一性就越好。而骨粉的粒徑、脂肪含量、蛋白質(zhì)含量和酶解工藝都會影響骨蛋白的水解效率[5,12-13]。為尋求水解度與骨膠原肽材料特性的最佳平衡點，制備均一性的低分子量骨膠原肽，國內(nèi)外研究學(xué)者展開了深入的探討，前期研究結(jié)果表明：脂肪酶預(yù)處理可以通過去除骨粉蛋白上的脂質(zhì)、暴露骨蛋白來改善蛋白質(zhì)的酶解敏感性[11]，有利于降低骨膠原肽的分子量分布區(qū)間；而雙酶分步酶解工藝可以顯著提高蛋白的水解效率來降低骨膠原肽的分子量[8,14]，但是探討兩者復(fù)合使用對酶解效果和酶解產(chǎn)物特性的影響鮮有報道。

本文考察不同種類蛋白酶對牛骨粉的酶解效果，并篩選和優(yōu)化低分子量骨膠原肽制備工藝；結(jié)合酶解過程中各項指標的變化、產(chǎn)物表征分析和Person相關(guān)系數(shù)法考察不同酶解工藝對產(chǎn)物特性的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

實驗材料：取自北京福成屠宰場的牛骨，經(jīng)去離子水清洗干凈后，剔除可見殘肉和骨髓，于-40℃、0.1 MPa下冷凍干燥72 h后，粉碎過0.5 mm篩，于-20℃冰箱密封儲存。脂肪酶P1000，購自深圳綠微康生物工程有限公司，標稱酶活為100 000 U/g；風(fēng)味蛋白酶500 MG，復(fù)合蛋白酶Protamex 1.6，中性蛋白酶0.8 L，堿性蛋白酶2.4 L，均購自丹麥Novozym公司，標稱酶活分別為500 LAPU/g，1.5 AU/g，0.8 AU/g，2.4 AU/g。甲醛溶液，十二水合磷酸氫二鈉，二水合磷酸二氫鈉，分析純，西隴化工股份有限公司；考馬斯亮藍G250，分析純，成都西亞化工股份有限公司。

實驗設(shè)備：XS105型分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；Research plus型微量可調(diào)移液器(Eppendorf公司，德國)；TCYQ型水浴恒溫振蕩器(蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司)；PHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；TW20型恒溫水浴鍋(JULABO公司，德國)；SevenEasy型實驗室pH計(Mettler Toledo公司，瑞士)；ZDJ-4A型自動電位滴定儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；UV-2550型紫外-可見分光光度計(Shimadzu公司，日本)；Pulverisette 15型粉碎機(Fritsch公司，德國)；ST85B3-I型冷凍干燥機(Millrock公司，美國)；Spectrum400型傅里葉變換紅外光譜儀(PerkinElmer公司，美國)；RID-20型示差折光檢測器(Shimadzu公司，日本)；D8 Advance 型X射線衍射儀(Bruker公司，德國)；SDT Q600型熱重分析儀(TA公司，美國)；島津高效液相色譜儀(Shimadzu公司，日本)。

1.2 雙酶分步酶解工藝設(shè)計

將骨粉用一定pH值的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解，配置成一定質(zhì)量濃度的骨粉溶液。參考4種蛋白酶的酶解工藝參數(shù)[14]，分別調(diào)節(jié)骨粉溶液的初始pH值，進行4種蛋白酶的酶解實驗，具體工藝參數(shù)如表1所示。蛋白酶解過程后，于90℃下酶失活10 min。對不同酶解工藝處理后的酶解產(chǎn)物在離心速率4 000 r/min下離心20 min，收集上清液于4℃保存，取部分上清液測定其水解度；去離子水反復(fù)洗滌后收集酶解殘渣，用于后續(xù)的化學(xué)和結(jié)構(gòu)分析。酶解反應(yīng)均設(shè)3組平行實驗。評估4種蛋白酶的酶解效果，充分考慮不同種類蛋白酶最適酶解工藝參數(shù)的差異性，設(shè)計雙酶分步酶解工藝，考察其酶解效率，從而制定兩種效率最佳的雙酶分步酶解工藝。

表1 4種蛋白酶的酶解工藝參數(shù)Tab.1 Enzymatic hydrolysis conditions of four proteases

1.3 不同骨膠原肽制備工藝設(shè)計

參考前期研究結(jié)果，選定脂肪酶預(yù)處理工藝參數(shù)為：底物質(zhì)量濃度0.09 g/mL、初始pH值7.5，加酶量為0.08%、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時間4 h[11]。采用無預(yù)處理+雙酶分步酶解工藝、預(yù)處理+雙酶分步酶解工藝制定4種復(fù)合酶解工藝，開展低分子量骨膠原肽制備實驗。每組制備工藝均設(shè)3組平行實驗。

1.4 酶解效果評價指標測定

1.4.1水解度

采用甲醛電位滴定法測定水解度[15]。取5 mL酶解上清液于燒杯中，加入60 mL蒸餾水，啟動磁力攪拌器，用0.05 mol/L 標準滴定溶液滴定至pH計指示pH值8.2，記錄消耗的NaOH溶液體積。然后加入10 mL甲醛溶液至燒杯中，混勻后再用上述NaOH溶液繼續(xù)滴定至pH值9.2，記錄消耗的NaOH溶液體積，記為V1。同時記錄空白試驗組的NaOH消耗體積，記為V2。水解度計算公式為

(1)

式中c——NaOH標準溶液濃度，mol/L

V——酶解液總體積，mL

N——樣品總氮質(zhì)量分數(shù)，%

m——測定樣品初始質(zhì)量，g

1.4.2可溶性蛋白含量

采用紫外分光光度計測定可溶性蛋白含量(質(zhì)量比)[16]。以牛血清蛋白為標準蛋白液，在595 nm波長處測定其吸光度，繪制標準曲線后測定水溶性蛋白樣品的蛋白質(zhì)含量。可溶性蛋白含量計算公式為

(2)

式中S——可溶性蛋白含量，mg/g

Cp——標準曲線反映的蛋白質(zhì)量，mg

Vs——測定時使用體積，mL

1.4.3殘渣量

殘渣量是指酶解后剩余殘渣占酶解樣品的質(zhì)量分數(shù)，該指標在一定程度上反映了骨蛋白的回收效率[17-18]。經(jīng)不同蛋白酶工藝后的剩余固體殘渣于25℃自然晾干后稱量，即為殘渣的質(zhì)量。殘渣量計算公式為

(3)

式中m1——酶解后的殘渣質(zhì)量，g

1.4.4pH值

初始pH值將顯著影響脂肪酶和蛋白酶的活力，適宜pH值條件下酶分子結(jié)構(gòu)/活性穩(wěn)定使得酶解效率較高[19]。參考GB/T 22592—2008，測定pH值方法如下：取10 mL酶解上清液于小燒杯中，將電極浸入試樣中，小心搖動或進行攪拌，讀數(shù)穩(wěn)定時記下pH值，準確值0.01。每個試樣進行3次測定，取均值作為該試樣的pH值。

1.5 骨膠原肽產(chǎn)物特性分析

采用分子量排阻的高效液相色譜的方法(SE-HPLC)，使用島津高效液相色譜儀分析牛骨蛋白水解物的分子量分布，操作步驟參考文獻[12]略有改動。試樣液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。采用TSKgel GMPWXL型水相凝膠柱(日本TOSOH公司)，柱溫為35℃，進樣量為20 μL，洗脫液是0.1 mol/L NaNO3+0.06 % NaN3水溶液，流速為0.6 mL/min。使用窄分布聚乙二醇(PEO)標樣組(日本TOSOH公司)作為分子量標樣，采用HW-2000 GPC型色譜工作站計算物質(zhì)的統(tǒng)計分子量、分子量分布寬度指數(shù)。

采用高效液相色譜分析牛骨蛋白水解物的氨基酸組成，操作步驟參考文獻[20-21]，略有改動。采用C18型色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)，柱溫為40℃，進樣量為10 μL，檢測波長為254 nm，流動相A是體積比為93∶7的pH值6.50的0.1 mol/L醋酸鈉溶液和乙腈溶液，流動相B為體積比為20∶80的水和乙腈溶液，流速1.0 mL/min。

在-48℃真空條件下干燥48 h的4種骨膠原肽作為試樣進行熱穩(wěn)定性分析，參照文獻[22]，略有改動。操作條件如下：稱取5～6 mg試樣，以氮氣為載氣，流速為100 mL/min，以10℃/min的升溫速率升溫到700℃。

對試樣進行官能團特征分析，采用KBr壓片法，以1∶100質(zhì)量比混勻，檢測時紅外分析掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1[22]。

一般情況下，結(jié)晶度越高，熔點越高，韌性越差，透光性越差。獲取試樣的X射線衍射圖譜，具體參數(shù)設(shè)置如下：在CuKα射線下，X光管電壓40 kV，管電流40 mA，5°～60°范圍內(nèi)，掃描頻率為2(°)/min，掃描步寬為0.02°，疊掃3次，測定X射線衍射圖譜[22]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5制圖(OriginLab公司，美國)。數(shù)據(jù)均采用SPSS V20.0軟件(IBM公司，美國)進行單因素方差分析，采用LSD檢驗對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，在95%置信區(qū)間被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙酶分步酶解工藝對酶解效果的影響

2.1.1不同種類蛋白酶的酶解效果

參照表1中各蛋白酶的最佳酶解工藝參數(shù)進行牛骨粉的酶解試驗，其酶解效果及過程變量數(shù)據(jù)見表2。由表2可知，4種蛋白酶酶解能力各不相同，這是由于不同蛋白酶的作用位點具有特異性，即使同一底物原料也會有不同的水解能力。其中，采用堿性蛋白酶得到最高水解度，高達8.81%，這可能是由于在堿性條件下，骨蛋白質(zhì)更易于展開，且堿性蛋白酶本身的水解位點選擇性較為寬泛[23]，除水解疏水性氨基酸外，還可以水解色氨酸和丙氨酸形成的肽鍵，同時具有酯酶的活力[24]?？扇苄缘鞍缀靠勺鳛榉从趁附膺^程中蛋白質(zhì)變性和降解等多方面信息的特征參數(shù)，在4種蛋白酶解液中具有顯著性差異。酶解后的殘渣量沒有顯著性差異，且與水解度無明顯規(guī)律性，這可能是酶解過程中不同種類的蛋白酶附著在骨粉樣品上造成的。酶解液pH值變化值表明酶解液pH值變化較小，均在初始pH值處波動，但是整體在向中性靠近，這可能是由于隨著酶解反應(yīng)的進行，酶解液中的含氨基或含羧基的游離氨基酸與緩沖液中的磷酸根離子發(fā)生取代反應(yīng)，從而中和了酶解液。

表2 4種蛋白酶的酶解效果分析Tab.2 Effects of four proteases on enzymatic hydrolysis

2.1.2雙酶分步酶解工藝的酶解效果

蛋白酶解過程中為避免過多的鹽類添加，常以pH值的變化趨勢來制定雙酶分步酶解工藝，即堿性—中性—酸性[8]。此外，蛋白酶的分步加入可使兩種蛋白酶的酶活分別達到最高值，且消除兩種蛋白酶同時加入存在互為底物的干擾。為進一步探究兩種蛋白酶的復(fù)合應(yīng)用對牛骨蛋白酶解反應(yīng)的影響，對酶解過程中各指標的變化趨勢進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3所示。以經(jīng)單一堿性蛋白酶處理的骨粉溶液作為雙酶分步酶解對照組。由表3可知，在經(jīng)堿性蛋白酶酶解后再加入第2類蛋白酶處理將會明顯提升酶解效率，其水解度從大到小依次為：堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶組、堿性蛋白酶-復(fù)合蛋白酶組、堿性蛋白酶-中性蛋白酶組、雙酶分步酶解對照組，水解度分別為14.09%、11.09%、10.18%、8.81%。堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶組的水解度最高的原因可能是堿性蛋白酶先將蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部肽鏈裂開使其暴露，風(fēng)味蛋白酶作為內(nèi)切酶和外切酶，會從肽鏈末端將氨基酸水解下來。堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶組的可溶性蛋白含量也佐證了這一推斷。此外，由表1可知，風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的最適宜pH值分別為7、7.5、6.5，結(jié)合表3中酶解液pH值的變化，選擇風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶作為第2步酶解蛋白酶時，無需人工調(diào)節(jié)pH值，即可避免引入新的雜質(zhì)。

表3 雙酶分步酶解的酶解效果統(tǒng)計分析Tab.3 Effects of double-enzyme stepwise hydrolysis on enzymatic hydrolysis

2.2 不同酶解工藝對骨蛋白酶解效率的影響

圖1(圖中K1組為堿性蛋白酶酶解工藝；A組為堿性蛋白酶-復(fù)合蛋白酶酶解工藝；B組為堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶酶解工藝；C組為脂肪酶預(yù)處理-堿性蛋白酶-復(fù)合蛋白酶酶解工藝；D組為脂肪酶預(yù)處理-堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶酶解工藝)展示了堿性蛋白酶-復(fù)合蛋白酶酶解工藝、堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶酶解工藝、脂肪酶預(yù)處理-堿性蛋白酶-復(fù)合蛋白酶酶解工藝、脂肪酶預(yù)處理-堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶酶解工藝的4種復(fù)合酶解工藝對牛骨粉的酶解效果，水解度從大到小依次為：D組、C組、B組、A組，分別為19.02 %、16.12 %、14.09 %、11.09%。由圖1可知，采用雙酶分步酶解工藝、脂肪酶+雙酶分步酶解工藝對骨蛋白的酶解反應(yīng)具有積極的促進作用；脂肪酶預(yù)處理對水解度具有積極的促進作用，水解度提高了近5個百分點，進一步證實脂肪酶預(yù)處理可顯著提升酶解效率，與先前的研究結(jié)果一致[11]。

圖1 4種復(fù)合酶解工藝對水解度的影響Fig.1 Effects of four prepared progresses of ossein peptides on DH

2.3 骨膠原肽的理化性質(zhì)分析

2.3.1肽分子量分布

由3～9個氨基酸殘基組成的短鏈肽被稱為低聚肽，其分子量范圍為180～1 000 Da。一般而言，水解度越高，低聚肽占比越高，分子量越小，分布區(qū)間越窄[25]。通過凝膠色譜柱的出峰時間來區(qū)分樣品分子量的大小，分子量大的較早出峰，分子量越小出峰時間越晚。由于采用的統(tǒng)計平均方式不同，便得到不同的平均分子量，即最常用的數(shù)均分子量Mn、重均分子量Mw、z均分子量Mz和粘均分子量Mz+1，其中Mn、Mw均有明確的物理意義，而Mz、Mz+1只是一種統(tǒng)計平均的方法，無明確的物理意義[12]。而肽分子量的分布系數(shù)Mw/Mn和分子量分散度Mz/Mw常作為衡量分子量均一性的指標，其數(shù)值越大，表明分子鏈長短分布越不均、越不集中，分子量均一性越差。分別將A、B、C、D組4種復(fù)合酶解工藝下制備的骨膠原肽編號為OP1、OP2、OP3、OP4。由圖2可知，4種骨膠原肽的淋出時間和信號強度上具有較大差異，隨著水解度的增加，淋出時間前移；相較于OP3，樣品OP1、OP2、OP4的洗脫峰都相對較寬，說明其分子量分布較廣，不均一；且樣品OP1和OP4中出現(xiàn)肩峰(圖2a和圖2d)，說明在該淋出時間下分子量相近，所占比重較高。從譜圖上看，4種骨膠原肽樣品的分子量差異較小，分子量分布呈先集中后分散的趨勢。由表4可知，4種骨膠原肽的Mw分別為947、1 021、883、866 Da，進一步佐證了脂肪酶預(yù)處理對降低骨膠原肽分子量的積極促進作用。結(jié)合水解度和Mw數(shù)據(jù)分析可知，相較于其它3組，采用脂肪酶預(yù)處理-堿性蛋白酶-復(fù)合蛋白酶酶解工藝獲得的骨膠原肽的肽分子量分布具有一定的優(yōu)越性。這一結(jié)果也表明，片面提升水解度不一定會獲得優(yōu)質(zhì)的骨膠原肽，尋求水解度、肽分子量分布、骨膠原肽材料特性間的平衡關(guān)系的相關(guān)研究具有重要的探討意義。

表4 4種骨膠原肽的平均分子量Tab.4 Average molecular weight of four kinds of ossein peptide samples

圖2 4種骨膠原肽的淋洗時間-信號強度曲線Fig.2 Relation between leaching time and signal strength curves of four ossein peptide samples

在本研究中使用的堿性脂肪酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶單價分別為500、1 000、1 000、1 000元/kg，參考表1中各蛋白酶的酶解工藝參數(shù)可知，每處理1 kg牛骨粉樣品所需蛋白酶理論添加量分別為7.40 g、42.3 mL、67.68 g、28.2 g，折合成本增加3.7、42.3、67.68、28.2元/kg。而在水解度和肽分子量相差無明顯差異的情況下，脂肪酶預(yù)處理-堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶酶解工藝具有更好的經(jīng)濟可行性。

2.3.2氨基酸組成

通過HPLC對4種骨膠原肽樣品的氨基酸組成定性分析可知，4種骨膠原肽樣品中含有豐富的游離氨基酸，其中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和賴氨酸含量較高。由圖3可知，OP4的總游離氨基酸含量最高，可達257.760 mg/g；OP2次之，為204.848 mg/g，這可能是由于作為內(nèi)切酶和外切酶的風(fēng)味蛋白酶有利于游離氨基酸的釋放。此外，經(jīng)脂肪酶預(yù)處理后的OP3和OP4樣品的氨基酸含量也明顯增加。

圖3 4種骨膠原肽的氨基酸組成譜圖Fig.3 Chromatograms of amino acid composition of four kinds of ossein peptide samples

2.3.3熱重分析

圖4為4種骨膠原肽樣品的熱重分析結(jié)果。試樣在升溫開始階段50～150℃范圍有一個較大的失重峰，這明顯是樣品中水分的蒸發(fā)過程；150～350℃范圍樣品的失重速率明顯提高，并達到峰值。從圖4中發(fā)現(xiàn)，4種骨膠原肽樣品的失重曲線相差不大，均在90、200、370℃發(fā)生明顯失重，其中樣品OP1和OP3的質(zhì)量損失率最高，為48.61%和47.38%。4種骨膠原肽樣品的失重速率曲線具有明顯差異，隨著水解度的升高，樣品的最大降解溫度向左偏移，熱穩(wěn)定性呈降低趨勢。在90℃附近，樣品OP3和OP4的失重速率明顯高于其它兩種，這是因為隨著分子量的減小，防潮性變差導(dǎo)致樣品中的含水率較高；在 200～500℃附近，OP1和OP2樣品的失重速率明顯高于OP3和OP4，這是因為270～350℃和350～460℃分別是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的特征分解溫度區(qū)間[26]，樣品中混合著的不同含量的蛋白酶與脂質(zhì)引起了此差異，如，經(jīng)脂肪酶預(yù)處理的OP3和OP4樣品中含有一定的脂肪酶(本質(zhì)屬于蛋白質(zhì))，故在300℃附近的蛋白質(zhì)峰處失重速率較高，而未經(jīng)脂肪酶預(yù)處理的OP1和OP2 樣品中脂質(zhì)含量較多，故在350℃附近的脂質(zhì)峰處失重速率較高。

圖4 4種骨膠原肽樣品的熱重分析Fig.4 Pyrolysis characteristics of four kinds of ossein peptide samples

2.3.4紅外譜圖分析

圖5 4種骨膠原肽樣品紅外譜圖Fig.5 FT-IR spectra of four kinds of ossein peptide samples

2.3.5X射線衍射譜圖分析

由圖6可以看出，4種骨膠原肽樣品在2θ為10°和20°附近處分別出現(xiàn)了衍射峰，而這兩個衍射峰是膠原蛋白的特征衍射峰[30]。其中，在2θ=8°處的比較尖銳的衍射峰可以反映骨膠原肽分子量間的距離，在2θ=20°處的較寬的衍射峰是骨膠原肽內(nèi)部結(jié)構(gòu)引起的漫散射。此外，2θ=31°處的衍射峰可以反映膠原蛋白質(zhì)中三股螺旋結(jié)構(gòu)單元的組成[31]。而4種骨膠原肽在此處的實測衍射強度具有較大的差異，衍射峰強度較高的原因可能是骨膠原肽中含有部分未分離出的蛋白酶或是脂肪蛋白酶。而OP3在2θ=31°處的衍射峰明顯低于其它3種，這可能是由于隨著水解度的提高，產(chǎn)物中肽分子量分布更加均勻集中，結(jié)晶度在一定程度上呈降低趨勢，其中，OP3樣品中大部分三股螺旋結(jié)構(gòu)已被破壞，衍射峰強隨之降低。

圖6 4種骨膠原肽的XRD 譜圖Fig.6 XRD spectra of four kinds of ossein peptide samples

2.4 Person相關(guān)系數(shù)

采用Person相關(guān)系數(shù)法對4種復(fù)合酶解工藝中牛骨粉酶解反應(yīng)的過程變量進行分析，探究水解度與骨膠原肽產(chǎn)物特性間的關(guān)系，結(jié)果如圖7所示。以顯著性水平進行顯著性標記來繪制圖形，以紅色標記表示正相關(guān)，以藍色標記表示負相關(guān)，顯著相關(guān)以“*”標記表示。一般而言，相關(guān)系數(shù)越大，顏色越深，關(guān)系越強。由圖7可知，水解度與Mn、Mw呈負相關(guān)關(guān)系，與Mz、Mz+1、Mw/Mn、Mz/Mw及總游離氨基酸含量呈正相關(guān)關(guān)系，這表明隨著水解度的提高，骨膠原肽的分子量在降低，但是自身黏性增加，分子量分布發(fā)散度呈變大的趨勢。此外，除Mn外，Mw與其它指標呈負相關(guān)關(guān)系；總游離氨基酸含量與Mn、Mw呈負相關(guān)，即肽分子量越大，氨基酸含量越低，這表明了水解度程度較低會影響氨基酸從肽鏈上脫離，進一步佐證了上述推斷。

圖7 牛骨蛋白酶解效率和過程變量的相關(guān)性分析Fig.7 Correlations between enzymolysis efficiency and various properties of ossein peptide samples

3 結(jié)束語

以前期研究結(jié)果證實的骨膠原肽高值高效材料轉(zhuǎn)化利用所需的材料特性為導(dǎo)向，本文以制備均一性的低分子量骨膠原肽為研究目標，考察脂肪酶預(yù)處理、多酶分步酶解工藝以及兩者的復(fù)合應(yīng)用對牛骨粉酶解效果的影響，篩選出最佳的均一性低分子量骨膠原肽制備工藝；并對4種骨膠原肽樣品的理化性質(zhì)進行系統(tǒng)分析，進一步探究不同復(fù)合酶解工藝下制備的骨膠原肽的產(chǎn)物特性。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶預(yù)處理與雙酶分步酶解工藝的復(fù)合應(yīng)用可以顯著提升水解度，改善酶解產(chǎn)物的分子量分布和氨基酸組成。其中，采用脂肪酶預(yù)處理-堿性蛋白酶-復(fù)合蛋白酶的酶解工藝制備的低分子量骨膠原肽性能綜合表現(xiàn)最優(yōu)，其重均分子量、分子量分布系數(shù)和分散度分別為883 Da、9.73和7.91，水解度為16.12%；而采用脂肪酶預(yù)處理-堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶酶解工藝的水解度、總游離氨基酸含量最高，分別為19.02%、257.76 mg/g，骨膠原肽產(chǎn)物特性也表現(xiàn)優(yōu)異。此外，隨著水解度的提高，骨膠原肽的肽分子量分布系數(shù)降低，骨膠原肽的熱穩(wěn)定、結(jié)晶度也出現(xiàn)輕微降低，這是由膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)被破壞引起的，而這些結(jié)構(gòu)和組成的變化都將在一定程度上利于骨膠原肽的材料增值轉(zhuǎn)化，故尋求水解度與材料特性的最佳平衡點可以兼容蛋白回收的經(jīng)濟性、生產(chǎn)工藝的清潔高效、新型材料性能的安全穩(wěn)定性。