基于高光譜圖像的葉綠素?zé)晒釬v/Fm圖像預(yù)測方法

王 東 沈楷程 范葉滿 龍博偉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

0 引言

水分脅迫可直接影響植物光合作用，進(jìn)而影響其干物質(zhì)積累效率[1]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)可反映葉片的光能吸收、轉(zhuǎn)化、傳遞及分配能力[2-3]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)中的Fv/Fm表示PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)的最大光能轉(zhuǎn)換效率，該指標(biāo)在植物生理變化和逆境脅迫研究中具有重要意義[4-5]。POUDYAL等[6]在高溫脅迫條件下使用Fv/Fm對不同基因型番茄耐熱性進(jìn)行篩選，以實(shí)現(xiàn)番茄耐熱性的早期檢測。BADR等[7]基于玉米葉片相對含水率和Fv/Fm參數(shù)研究了不同基因型玉米的干旱脅迫響應(yīng)分析。王振華等[8]對棉花進(jìn)行了不同梯度水分脅迫和氮素脅迫研究，發(fā)現(xiàn)二者均可造成Fv/Fm值的降低。姚潔妮[9]基于綠葉素?zé)晒鈩恿W(xué)圖像、序列前向選擇、線性分類判別器算法完成了擬南芥干旱程度的可視化分析，準(zhǔn)確率最高可達(dá)92%。Fv/Fm的快速測量在植物逆境脅迫研究中意義重大，而當(dāng)前的Fv/Fm測量方法需對植物進(jìn)行20～30 min暗適應(yīng)[10]，無法實(shí)現(xiàn)實(shí)時測量。

針對Fv/Fm無法實(shí)時測量的問題，國內(nèi)外學(xué)者對以光譜技術(shù)預(yù)測Fv/Fm進(jìn)行了研究。ZHANG等[11]在不同鹽堿化程度的海灘測量多種植物葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)和高光譜數(shù)據(jù)，并用植被指數(shù)對各葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行回歸分析，其中植被指數(shù)(R680-R935)/(R680+R935)和R680/R935可用于預(yù)測葉綠素?zé)晒庵械腇o、Fm、Fv/Fm、qP和UPSII等參數(shù)，植被指數(shù)NDSI(680,935)可用于預(yù)測Fv/Fm，其預(yù)測回歸系數(shù)為-0.828，均方根誤差為0.020。譚昌偉等[12]對田間玉米進(jìn)行不同梯度氮肥處理，并在生長期的4個階段采集光譜和Fv/Fm數(shù)據(jù)，分析了植被指數(shù)和Fv/Fm的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)植被指數(shù)(R800-R445)/(R800-R680)和Fv/Fm相關(guān)性最高，其決定系數(shù)R2為0.813，均方根誤差RMSE為0.082。以上研究表明了可見-近紅外光譜反射率預(yù)測Fv/Fm的可行性，但當(dāng)前研究多使用植被指數(shù)或紅邊參數(shù)預(yù)測Fv/Fm，且均以單點(diǎn)或多點(diǎn)葉綠素?zé)晒鈪?shù)代表葉片整體指標(biāo)。然而脅迫條件下葉片的不同位置葉綠素?zé)晒鈪?shù)存在明顯差異，其單點(diǎn)或多點(diǎn)采樣方法導(dǎo)致預(yù)測精度受損。

為實(shí)現(xiàn)Fv/Fm的實(shí)時獲取，本文以辣椒幼苗(加長六號)為研究對象，測量其葉片高光譜圖像數(shù)據(jù)和葉綠素?zé)晒釬v/Fm圖像數(shù)據(jù)，通過特征點(diǎn)匹配完成高光譜圖像和Fv/Fm圖像匹配。使用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)、多元散射校正(MSC)和Savitzky-Golay卷積平滑(SG)3種光譜預(yù)處理算法濾除隨機(jī)噪聲，采用連續(xù)投影算法提取特征波段，對比偏最小二乘(PLSR)、徑向基函數(shù)(RBF)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和分析誤差反向傳播(BP)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3種建模算法的模型精度，選出最優(yōu)建模方式，以期為實(shí)現(xiàn)基于高光譜圖像的葉綠素?zé)晒釬v/Fm圖像準(zhǔn)確預(yù)測提供一種方法。

1 數(shù)據(jù)采集與匹配

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年8月4—9日在西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)科研溫室進(jìn)行。以辣椒幼苗(加長六號)為試驗(yàn)材料，挑選長勢一致的四葉一心辣椒幼苗40株作為試驗(yàn)對象。為避免強(qiáng)光直曬葉片，試驗(yàn)期間對溫室進(jìn)行遮光處理。試驗(yàn)共設(shè)置4個水分梯度，將含水率控制在田間含水率的60%～80%(對照組)、40%～60%(輕度脅迫)、20%～40%(中度脅迫)和0～20%(重度脅迫)，每組選取10株長勢相近的幼苗，為試驗(yàn)提供Fv/Fm數(shù)值不同的葉片。采用土壤水分傳感器(GHHB-001-485型，威海晶合數(shù)字礦山技術(shù)有限公司)連續(xù)監(jiān)測各組土壤含水率，確保土壤含水率始終在設(shè)置范圍內(nèi)。為排除植株個體差異，采集數(shù)據(jù)前剔除長勢最好和最差的各1株幼苗，隨機(jī)選取剩余幼苗的一片功能葉，每天測量同一葉片上的高光譜和Fv/Fm數(shù)據(jù)，由于測量Fv/Fm數(shù)據(jù)需將葉片摘下，故每株幼苗只測量一次。

1.2 高光譜數(shù)據(jù)采集

RENSONON PikaXC2為本試驗(yàn)的高光譜成像設(shè)備，在圖1所示的高光譜成像系統(tǒng)中采集高光譜數(shù)據(jù)。相機(jī)光譜范圍為392.34～1 009.43 nm，光譜分辨率為1.3 nm。設(shè)置曝光時間為19.83 ms、增益系數(shù)為5、幀率為28 f/s、掃描行數(shù)為700，高光譜圖像分辨率為700像素×1 600像素。數(shù)據(jù)采集計(jì)算機(jī)配置為：CPU i7-7700hq、GPU GTX1070、16 GB 2 400 MHz內(nèi)存和512 GB Intel 760P SSD硬盤。光譜圖像校正、處理、分析均使用Matlab R2014a 軟件。

圖1 高光譜成像系統(tǒng)Fig.1 Hyperspectral imaging system1.載物臺 2.測試架 3.鎢鹵素?zé)艄庠?4.燈架 5.鏡頭 6.高光譜成像儀 7.數(shù)據(jù)采集計(jì)算機(jī) 8.辣椒樣本

試驗(yàn)于每日17：00開始測量，為降低環(huán)境光影響，測量時關(guān)閉室內(nèi)其他光源，將葉片葉柄固定在載物臺上進(jìn)行活體測量，載物臺與鏡頭固定距離為60 cm。為降低相機(jī)暗電流噪聲對光譜圖像質(zhì)量的影響，預(yù)熱光源30 min[13]后對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行黑白校準(zhǔn)[14]。在上述條件下，獲取標(biāo)準(zhǔn)白板的高光譜圖像數(shù)據(jù)記為W，蓋上鏡頭蓋測得暗電流記為B，原始高光譜圖像校正公式為

(1)

式中I——原始辣椒葉片光譜數(shù)據(jù)

R——校正后的辣椒葉片光譜數(shù)據(jù)

1.3 葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)采集

葉綠素?zé)晒獬上裨O(shè)備采用捷克PSI公司的FC800，圖像分辨率設(shè)置為520像素×696像素，調(diào)節(jié)焦距直至葉片清晰，在正式試驗(yàn)前使用健康葉片確定最佳參數(shù)[15]，設(shè)定參數(shù)為Act1 100% 、Super 40%、Act2 20%、Shutter 20 μs、Sensitivity 40%。為降低環(huán)境光影響，熒光數(shù)據(jù)于每日18：00開始采集，測量時關(guān)閉室內(nèi)其他光源，將測量設(shè)備用黑布遮蔽。經(jīng)過30 min暗適應(yīng)后，摘下葉片離體測量Fv/Fm圖像，完成測量后保存Fv/Fm的灰度圖像。

1.4 高光譜圖像與Fv/Fm圖像匹配

如圖2所示，在高光譜圖像與Fv/Fm圖像中各手動選擇兩個區(qū)域。在每個區(qū)域內(nèi)的邊緣上尋找使葉片全部邊緣匹配誤差最小的2組特征點(diǎn)，將其像素坐標(biāo)分別記為O1=(x1,y1)、O2=(x2,y2)(高光譜圖像坐標(biāo)系下)，O′1=(x′1,y′1)、O′2=(x′2,y′2)(Fv/Fm圖像坐標(biāo)系下)，由高光譜圖像坐標(biāo)系向Fv/Fm圖像坐標(biāo)系的坐標(biāo)轉(zhuǎn)換計(jì)算過程為

圖2 圖像匹配方式示意圖Fig.2 Schematic of image matching

O′i=m(Oi-O1)Rot+O′1

(2)

(3)

(4)

(5)

式中m——縮放系數(shù)Rot——旋轉(zhuǎn)矩陣

θ——旋轉(zhuǎn)角

Oi——高光譜圖像中葉片除邊緣外的任意像素點(diǎn)向量

O′i——Fv/Fm圖像中葉片除邊緣外的任意像素點(diǎn)向量

由于高光譜圖像分辨率高于Fv/Fm圖像分辨率，匹配后高光譜像素坐標(biāo)會出現(xiàn)小數(shù)，為降低噪聲影響，以Fv/Fm像素坐標(biāo)為基準(zhǔn)，將相對坐標(biāo)距離小于0.5的多個高光譜像素點(diǎn)計(jì)算均值后對應(yīng)一個Fv/Fm圖像像素位置。

1.5 基于SPA的特征波長提取及模型構(gòu)建

由于高光譜數(shù)據(jù)維度很高，且存在大量無關(guān)數(shù)據(jù)，因此需要進(jìn)行特征波段提取[16-17]，以每個對應(yīng)像素點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)為輸入，F(xiàn)v/Fm值為輸出，使用連續(xù)投影算法(SPA)提取特征波長。該算法是一種前向特征波長提取算法，可以分析向量的投影，其選出的特征波長具有共線性最小、冗余信息最少等特征[18-19]。在提取特征波長后通過偏最小二乘回歸(PLSR)、分析誤差反向傳播(BP)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、徑向基函數(shù)(RBF)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)不同算法構(gòu)建模型，以決定系數(shù)R2、均方根誤差(RMSE)兩個參數(shù)作為模型的評價指標(biāo)，對比建模效果來確定最優(yōu)的建模算法。

2 研究方法與驗(yàn)證

2.1 試驗(yàn)

本次試驗(yàn)共進(jìn)行6 d，每天每組辣椒幼苗的生理狀態(tài)均有差異，在第6天時重度脅迫組所有葉片已經(jīng)褶皺且邊緣卷曲，故停止試驗(yàn)。本研究分別選取不同脅迫組下的葉片樣本各6片，獲得了24組Fv/Fm圖像和高光譜圖像，將各Fv/Fm圖像中葉片區(qū)域的全部像素點(diǎn)作為建模樣本，共有96 096個像素點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)每片葉片的Fv/Fm最大值和最小值，得出Fv/Fm范圍為0.38～0.86。將Fv/Fm圖像中的全部像素點(diǎn)按照含量梯度法[20]以4∶1劃分出訓(xùn)練集和測試集，得到訓(xùn)練集樣本76 887個，測試集樣本19 209個。

2.2 Fv/Fm圖像預(yù)處理及圖像匹配

原始Fv/Fm圖像中存在椒鹽噪聲，研究使用中值濾波[21]算法削弱噪聲。由圖3a可見，原始Fv/Fm圖像的椒鹽噪聲像素面積很小，故以3×3、5×5、7×7濾波窗進(jìn)行降噪，結(jié)果如圖3b～3d所示。

圖3 不同濾波窗濾波結(jié)果Fig.3 Filter results of different filter windows

由圖3b可知，3×3濾波窗即可完全濾除背景椒鹽噪聲，而5×5、7×7濾波窗丟失大量葉片圖像細(xì)節(jié)信息，因此本文選擇3×3濾波窗對所有Fv/Fm圖像進(jìn)行中值濾波。

提取高光譜圖像中紅(634 nm)、綠(557 nm)和藍(lán)(458 nm)3個波段組成RGB圖像，用大津法(Otsu法)分割(閾值0.107)獲取葉片區(qū)域，而后基于prewitt算子提取葉片邊緣[22]，得到高光譜圖像中的葉片邊緣。由此計(jì)算2個坐標(biāo)轉(zhuǎn)換參數(shù)：縮放系數(shù)(m)和旋轉(zhuǎn)矩陣(Rot)。由式(2)將高光譜圖像像素坐標(biāo)映射至Fv/Fm圖像，并以高光譜邊緣各點(diǎn)到Fv/Fm圖像葉片邊緣各點(diǎn)的最短距離為匹配誤差。為了直觀顯示葉片邊緣匹配效果，將匹配誤差點(diǎn)用紅色線描繪在表示Fv/Fm圖像邊緣的藍(lán)線上，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 高光譜圖像與Fv/Fm圖像匹配結(jié)果Fig.4 Spectral image and chlorophyll fluorescence image matching result

統(tǒng)計(jì)各幅圖像的匹配誤差，其中最大匹配誤差為2像素點(diǎn)，最小為0像素點(diǎn)，最大RMSE為0.58像素點(diǎn)，最小RMSE為0.46像素點(diǎn)。表明其葉片邊緣匹配較為準(zhǔn)確，可滿足后續(xù)的建模需求。

2.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理及基于SPA的特征波長選取

高光譜原始數(shù)據(jù)存在隨機(jī)噪聲[23]，導(dǎo)致原始高光譜圖像存在無關(guān)信息，會影響Fv/Fm預(yù)測模型的精度，所以需要對原始光譜圖像進(jìn)行預(yù)處理。本文分別使用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)、多元散射校正(MSC)和Savitzky-Golay卷積平滑(SG)3種預(yù)處理方法對原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，以實(shí)現(xiàn)消除隨機(jī)噪聲和表面散射并保留光譜有效信息的目的[24]。在此基礎(chǔ)上以SPA算法篩選特征波長，通過對比特征波長數(shù)量、決定系數(shù)和均方根誤差3個參數(shù)確定最優(yōu)預(yù)處理算法，結(jié)果如表1所示。

表1 3種預(yù)處理算法結(jié)果Tab.1 Three preprocessing algorithm results

在3種預(yù)處理算法中，篩選出的特征波長數(shù)量近似，但是使用不同算法的精度相差較大。其中，SG算法平滑濾波效果相對較好，訓(xùn)練集和測試集的R2均為0.819，而RMSE均為0.018，其測試集R2比SNV算法和MSC算法分別提高了8.5%和8.3%，RMSE分別降低了21.7%和14.3%。相比之下，SVN與MSC算法的效果較差，兩者的R2略高于0.750，而RMSE在0.020以上。主要原因可能是這兩種算法沒有很好地降低光譜中的隨機(jī)噪聲。綜合比較3種預(yù)處理算法后，選取SG算法對所有原始高光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。在通過SG-SPA篩選特征波長過程中篩選到第23個特征波長時預(yù)測集RMSE為0.018。SPA的特征波長提取結(jié)果如圖5所示。

圖5 SPA算法尋找特征波長結(jié)果Fig.5 Results of characteristic wavelengths selected by SPA algorithm

由圖5a可見，SPA算法共提取出特征波長23個，可見光區(qū)域(400～780 nm)內(nèi)11個，近紅外區(qū)域(780 nm以上)內(nèi)12個，而392～500 nm與900～1 009 nm波段范圍內(nèi)分別有7個和9個特征波長且分布較集中。本文中SPA算法最先提取出的3個特征波長分別為737、692、672 nm，均處于葉綠素?zé)晒夤庾V的波長范圍(640～850 nm)，葉綠素?zé)晒夤庾V在690 nm和740 nm附近有兩個波峰[25]，同時這3個特征波長還位于紅邊區(qū)域，而紅邊位置包含豐富的生理信息(如葉綠素含量、含水率等[26])。本文在400～500 nm和600～700 nm之間共存在9個特征波長，而影響植物光合作用的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等光合色素在這個范圍內(nèi)存在多個吸收峰[27]，同時Fv/Fm值與相同環(huán)境下光合速率存在正相關(guān)性[28]，在水分脅迫下葉片的光合作用會被抑制，進(jìn)而篩選出在這個范圍內(nèi)的特征波長也很可能與此相關(guān)。

2.4 建模結(jié)果與分析

以上述24片葉片非邊緣區(qū)域全部像素點(diǎn)的23個特征波長光譜反射率為輸入，以Fv/Fm值為輸出，分別使用偏最小二乘法回歸、徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立預(yù)測模型，選擇以運(yùn)行10次的決定系數(shù)和均方根誤差來評價模型精度，結(jié)果如表2所示。

表2 不同算法建模結(jié)果Tab.2 Three algorithm modelling results

由表2可知，3個模型中PLSR精度最低，RBF網(wǎng)絡(luò)精度略低于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)精度最高，其訓(xùn)練集R2為0.919，RMSE為0.010，測試集R2為0.918，RMSE為0.011。從建模結(jié)果上看使用機(jī)器學(xué)習(xí)模型的訓(xùn)練集與測試集的精度都得到了明顯提升，這是由于機(jī)器學(xué)習(xí)對于非線性數(shù)據(jù)的擬合效果更佳。

2.5 預(yù)測成像結(jié)果

利用全部特征波長建立SG-SPA-BP模型預(yù)測辣椒葉片每個像素點(diǎn)的Fv/Fm值，運(yùn)用偽彩圖渲染生成Fv/Fm分布圖，不同顏色代表其Fv/Fm值，為確定模型在不同F(xiàn)v/Fm范圍內(nèi)的適用性，按照葉片表型分為4組：健康葉片(Fv/Fm均值0.80)、萎蔫葉片(Fv/Fm均值0.76)、萎縮葉片(Fv/Fm均值0.73)和邊緣卷曲葉片(Fv/Fm均值0.67)。每組選擇一片典型葉片進(jìn)行分析，其Fv/Fm均值分別為0.79、0.75、0.71和0.65。將熒光圖像與高光譜預(yù)測圖像進(jìn)行對比，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 預(yù)測結(jié)果Fig.6 Prediction results

圖6中每組中從左至右為葉片RGB圖像、Fv/Fm圖像、高光譜預(yù)測圖像和誤差圖像。圖6a顯示健康葉片RGB圖像，葉片舒展無異常，圖6b顯示萎蔫葉片RGB圖像，葉片邊緣完整清晰可見，圖6c顯示萎縮葉片的RGB圖像，邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則形狀內(nèi)部有褶皺，圖6d顯示邊緣卷曲葉片的RGB圖像，邊緣不可見且被葉背遮擋。圖6a、6b為舒展葉片預(yù)測結(jié)果，在葉片邊緣區(qū)域預(yù)測誤差較大，剔除邊緣像素點(diǎn)后預(yù)測結(jié)果較為準(zhǔn)確，最大誤差為0.073，最小誤差為0.008，RMSE為0.009。圖6c中由于萎縮葉片上出現(xiàn)起伏，造成了整體誤差偏大，最大誤差為0.045，最小誤差為0.008，RMSE為0.010。圖6d中由于邊緣卷曲葉片大部分葉片邊緣被葉背遮擋，所以預(yù)測結(jié)果有較大的誤差，其最大誤差為0.138，而其他區(qū)域可以準(zhǔn)確預(yù)測，最小誤差為0.008，RMSE為0.012。統(tǒng)計(jì)全部24片葉片，在去除邊緣后其預(yù)測誤差的RMSE為0.010，由此實(shí)現(xiàn)了高光譜圖像對Fv/Fm圖像的準(zhǔn)確預(yù)測。

3 結(jié)論

(1)通過尋找邊緣特征點(diǎn)和坐標(biāo)變換的方式實(shí)現(xiàn)了高光譜圖像與Fv/Fm圖像的匹配，最大匹配誤差為2像素點(diǎn)，最小為0像素點(diǎn)，所有圖像中最大均方根誤差為0.58像素點(diǎn)，最小均方根誤差為0.46像素點(diǎn)。

(2)對比了MSC、SNV、SG 3種不同光譜預(yù)處理算法，并使用SPA算法篩選特征波段。其結(jié)果表明SG算法的預(yù)處理效果最好，其測試集R2比SNV算法和MSC算法分別提高了8.5%和8.3%，RMSE分別降低了21.7%和14.3%。

(3)分別使用PLSR、RBF和BP算法對比建模精度，發(fā)現(xiàn)以BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法建立的模型預(yù)測效果相對較好，其測試集R2為0.918、RMSE為0.011。相較PLSR算法R2提高了12.1%，RMSE降低了38.9%。上述結(jié)果表明使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法可明顯提高模型的預(yù)測精度。

(4)通過4組不同F(xiàn)v/Fm均值的葉片，分析了水分脅迫下葉片表型明顯變化時的預(yù)測誤差。在受到嚴(yán)重干旱脅迫時，葉片明顯卷曲狀態(tài)下的預(yù)測誤差最大，為0.138。但在葉片非邊緣區(qū)域預(yù)測誤差相對較小，全部24幅圖像在去除邊緣后的預(yù)測誤差的RMSE為0.010。