基于高通量測序技術分析奶牛乳房炎關聯(lián)微生物群落結構及多樣性

劉肖利，程 彪，劉璐瑤，李勤凡，佟盼盼，張 毅，劉英玉，蘇戰(zhàn)強，李 斌

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2. 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

0 引 言

【研究意義】對CJ和HZS 2個奶牛場的奶牛進行乳房炎的檢查，最終將2個奶牛場中患有臨床型乳房炎的奶牛乳汁隨機采樣各3份，非臨床型奶牛乳汁隨機采樣各1份，通過對臨床型乳房炎奶牛和非臨床型奶牛乳樣中細菌的16S rRNA基因V3-V4區(qū)的PCR擴增和高通量測序，分析臨床型奶牛乳汁樣本和非臨床型奶牛乳汁樣本中微生物群落結構分布的多樣性差異?！厩叭搜芯窟M展】奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)生產(chǎn)的重要疾病之一[1-4]。引起奶牛乳房炎的病因十分復雜，引起其發(fā)病的病原體大約有150多種，包括細菌、真菌、支原體，還包括病毒等[5-7]。其中常導致奶牛乳房炎發(fā)病的病原體以細菌最為多見，種類多達20余種，而金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌等約占90%以上[8-10]。奶牛生活的環(huán)境中存在的微生物同樣值得重視，包括大腸桿菌、乳房鏈球菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌等[11-13]?！颈狙芯壳腥朦c】由于傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限性，在臨床乳房炎病例中通過常規(guī)培養(yǎng)不能被檢測到的細菌約占25%[14]，而許多臨床乳房炎動物采集的細菌培養(yǎng)陰性乳樣品中也可能存在細菌種類[15]。在乳房炎樣本中含量相對較少和難以培養(yǎng)的細菌通過常規(guī)方法極少被檢測到，不能全面反映樣本中菌群分布，借助分子生物學技術對牛奶樣本中的菌群進行多樣性分析很有必要?！緮M解決的關鍵問題】采集臨床型和非臨床型奶牛乳汁樣本，通過Illumina NovaSeq高通量測序技術研究樣本中的菌群多樣性，分析奶牛乳房炎菌群組成，為奶牛乳房炎的防控提供更全面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

NanoDrop ND-1000分光光度計，美國Thermo公司；高速冷凍離心機，德國賽多利斯公司；PCR儀，美國Thermo公司。

從新疆伊犁某2個奶牛場(HZS，CJ)采集奶牛樣品8份，其中HZS場采樣4份，3份為臨床乳房炎樣本，1份為非臨床型牛乳樣本。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

臨床乳房炎樣品編號為HZS.LC1、HZS.LC2、HZS.LC3，非臨床型牛乳樣本編號為HZS.ZC；CJ場采樣4份，3份為臨床乳房炎樣本，1份為非臨床型牛乳樣本，臨床乳房炎樣本編號為CJ.LC1、CJ.LC2、CJ.LC3，非臨床型牛乳樣本編號為CJ.ZC。先用溫水徹底清洗患病奶牛的采樣乳頭，再用75%的酒精棉對乳頭進行消毒，最后使用消毒紙巾擦干；棄去采樣乳區(qū)的前3把乳汁，無菌采集第3把以后的乳樣約50 mL，置于無菌管中，并將樣品做好標記，放入附有冰袋的采集箱中送實驗室檢測。

1.2.2 16S rRNA基因V3-V4區(qū)的PCR擴增

使用基因組DNA提取試劑盒提取細菌總基因組DNA，并使用NanoDrop ND-1000分光光度計和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，調(diào)整DNA溶液濃度后，使用通用引物338F-806R(338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3',806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')進行細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)的PCR擴增[16]。反應程序：98℃ 2 min，98℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共25個循環(huán)；72℃ 5 min?；厥諗U增產(chǎn)物，然后使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit分析試劑盒進行定量，委托上海派森諾生物技術有限公司的Illlumina NovaSeq6000測序平臺進行測序。

1.2.3 生物信息學

使用Qiime(1.9.1)軟件對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾、去嵌合體序列，最終得到有效序列，調(diào)用UCLUST，將有效序列按97%的序列相似度進行歸并和操作分類單元(OTU)劃分，選取豐度較高的OTU作為代表序列，采用Greengenes數(shù)據(jù)庫(Release 13.8)對OTU進行物種注釋，并統(tǒng)計樣本在各層次的物種豐度。使用ɑ多樣性指數(shù)(Chao1、Observed species、Shannon、Simpson)來評估不同樣本中菌群的物種豐富度和多樣性的差異性，對OTUs進行稀疏曲線分析，使用Qiime軟件分別計算各樣本的Shannon、Chao1、覆蓋度( coverage)等參數(shù)，同時使用R語言根據(jù)Bray-Curtis距離算法得到Beta多樣性距離矩陣，利用非加權平均法(UPGMA)對樣本中豐度靠前的屬進行聚類分析并繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 樣品測序

研究表明，共得到2 229 421條有效序列，測得樣本的序列長度分布在400～450 bp，平均長度在430 bp左右。乳房炎樣本菌群豐富度及多樣性總體比非臨床型樣本高。所有樣本的曲線都逐漸趨于平坦，測序量足以覆蓋大部分微生物類群，增加測序量可能只會產(chǎn)生少量的新物種，測序數(shù)據(jù)量合理。表1,圖1

2.2 在門分類水平上的細菌組成

研究表明,在臨床型乳房炎樣本中，優(yōu)勢菌群分別是變形菌門(Proteobacteria)、無壁菌門(Tenericutes)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)。在CJ場中，樣本中豐度最高的菌群是無壁菌門(Tenericutes)、變形菌門(Proteobacteria)；在HZS場中，樣本豐度最高的菌群是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)；CJ場與HZS場相比，無壁菌門(Tenericutes)僅在樣本CJ.LC1、CJ.LC2中被檢測到，且菌群豐度高達57%以上，而在HZS場中，樣本HZS.LC3中，厚壁菌門(Firmicutes)的菌群豐度均高于其他5個乳房炎樣本，達96%左右；樣本CJ.LC3、HZS.LC1、HZS.LC2中，均含有4個菌群，分別是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)，但細菌類群在各樣本間的比例有所差異。在非臨床樣本中，優(yōu)勢菌群是變形菌門(Proteobacteria)，且該細菌類群在2個非臨床型樣本中的豐度高達92%以上，其次是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，菌群豐度均大于1%；臨床型乳房炎樣本與非臨床型樣本相比，變形菌門(Proteobacteria)豐度均低于非臨床型樣本，其他菌群門和豐度均高于非臨床樣本。圖2

表1 樣本菌群Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Microflora Alpha Diversity Index of Sample

圖1 相似度為97%條件下各樣本的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of each sample at cutoff level of 3%

2.3 在科分類水平的組成

研究表明，在臨床型乳房炎樣本中，優(yōu)勢菌群分別是莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、支原體(Mycoplasmataceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)，主要群落分別是布魯氏菌科(Brucellaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)、柄桿菌科(Caulobacteraceae)、噬幾丁質(zhì)菌科(Chitinophagaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)等；在CJ場中，豐度最高的菌群莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、支原體(Mycoplasmataceae)，在HZS場中，豐度最高的菌群是莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)；在CJ場中，樣本CJ.LC1、CJ.LC2豐度最高的菌群是支原體(Mycoplasmataceae)，分別占細菌總數(shù)的94%和57%，在樣本CJ.LC3中，豐度最高的菌群是莫拉氏菌科(Moraxellaceae)，占細菌總數(shù)的55%，樣本CJ.LC1、CJ.LC2與樣本CJ.LC3相比，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的菌群豐度相對較低，分別占細菌總數(shù)的2%、13%；在HZS場中，樣本HZS.LC1、HZS.LC2中豐度最高的菌群是莫拉氏菌科(Moraxellaceae)，分別占細菌總數(shù)的51%、46%，在樣本HZS.LC3中，菌群豐度最高的菌群是鏈球菌科(Streptococcaceae)，

注：HZS.ZC：HZS奶牛場非臨床型乳汁樣本；HZS.LC1：HZS奶牛場臨床型乳房炎乳汁樣本；HZS.LC2：HZS奶牛場臨床型乳房炎乳汁樣本；HZS.LC3：HZS奶牛場臨床型乳房炎乳汁樣本；CJ.ZC：CJ奶牛場非臨床型乳汁樣本；CJ.LC1：CJ奶牛場臨床型乳房炎乳汁樣本；CJ.LC2：CJ奶牛場臨床型乳房炎乳汁樣本；CJ.LC3：CJ奶牛場臨床型乳房炎乳汁樣本，下同

占細菌總數(shù)的96%，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)占細菌總數(shù)的1%，與樣本HZS.LC1、HZS.LC2相比，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的菌群豐度相對較低，CJ場與HZS場相比，支原體(Mycoplasmataceae)僅在樣本CJ.LC1、CJ.LC2中被檢測到，鏈球菌科(Streptococcaceae)僅在樣本HZS.LC3中被檢測到，而莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、Brucellaceae(布魯氏菌科)、噬幾丁質(zhì)菌科(Chitinophagaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、柄桿菌科(Caulobacteraceae)在樣本CJ.LC2、樣本CJ.LC3、樣本HZS.LC1、HZS.LC2中均被檢測到。在非臨床型樣本中，優(yōu)勢菌群是莫拉氏菌科(Moraxellaceae)，且該細菌類群在2個非臨床型樣本中的豐度高達50%以上，主要群落分別是假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)等。乳房炎樣本之間菌群結構分布基本一致，且臨床型和非臨床型奶牛乳汁中菌群結構分布和豐度變化有所差異。圖3

圖3 細菌科分類水平的比較Fig.3 Comparison of bacteria groups at family level

2.4 在屬分類水平的組成

研究表明，在臨床乳房炎樣本中，優(yōu)勢菌群分別是不動桿菌屬(Acinetobacter)、支原體(Mycoplasmataceae)、鏈球菌屬(Streptococcus)、主要菌群分別是棒桿菌屬(Corynebacterium) 、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、沉積物桿狀菌屬(Sediminibacterium)、嗜糖假單胞菌屬(Pelomonas)、羅斯氏菌屬(Rothia)等；在CJ場中，樣本CJ.LC1、CJ.LC2中豐度最高的菌群是支原體(Mycoplasmataceae)，分別占細菌總數(shù)的94%和57%，在樣本CJ.LC3中，豐度最高的菌群是不動桿菌屬(Acinetobacter)，占細菌總數(shù)的53%，而樣本CJ.LC1、CJ.LC2中不動桿菌屬(Acinetobacter)的菌群比例相對較小，分別占細菌總數(shù)的2%、12%，在HZS場中，樣本HZS.LC1、HZS.LC2中豐度最高的菌群是不動桿菌屬(Acinetobacter)，分別占細菌總數(shù)的49%、43%，在樣本HZS.LC3中豐度最高的菌群是鏈球菌屬(Streptococcus)，占細菌總數(shù)的95%，而不動桿菌屬(Acinetobacter)僅占細菌總數(shù)的1%。CJ場與HZS場相比，僅在CJ場在2個乳房炎樣本中檢測到支原體，而在HZS場在1個乳房炎樣本中檢測到鏈球菌屬。樣本CJ.LC3、HZS.LC1、HZS.LC2中的菌群結構分布基本一致；在非臨床型樣本中，優(yōu)勢菌群是不動桿菌屬(Acinetobacter)，主要菌群分別是蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、沉積物桿狀菌屬(Sediminibacterium)、嗜糖假單胞菌屬(Pelomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)；在CJ場和HZS場中，不動桿菌屬(Acinetobacter)在2個非臨床型樣本的菌群豐度高達50%，其他菌群豐度均在1%以上。奶?；既榉垦缀缶航Y構變化最大的屬是支原體和鏈球菌屬。圖4

圖4 細菌屬分類水平的比較Fig.4 Comparison of bacteria groups at genus level

2.5 聚類分析

研究表明，乳房炎樣本之間相似度較高，非臨床型樣本之間雖未聚在一起，但二者細菌群落相似性也較高，說明菌群在不同組內(nèi)平行樣本之間存在個體差異性。取豐度在前20屬，繪制熱圖，在臨床乳房炎樣本中鏈球菌和支原體較其他病原微生物而言豐度明顯較高，不同樣本中均有相對豐度較高的屬，臨床乳房炎樣本與非臨床型樣本相比，屬水平豐度較高菌群較多。圖5,圖6

圖5 樣本層級聚類樹Fig.5 Hierarchical clustering tree

注：紅色色塊代表該屬在該樣本中的豐度較其他樣本高，藍色色塊代表該屬在該樣本中的豐度較其他樣本低

3 討 論

研究首次利用高通量測序技術對奶牛乳房炎乳汁樣本進行研究，通過16S rRNA基因的V3-V4區(qū)測序分析，檢測乳房炎樣本中微生物群落結構多樣性。6個乳房炎樣本共獲得25個門，47個綱，82個目，174個科，349個屬；2個非臨床型奶牛乳汁樣本共獲得23個門，38個綱，61個目，125個科，212個屬。研究表明，臨床型奶牛乳汁中菌群多樣性與豐富度均高于非臨床型奶牛，表明患乳房炎的奶牛乳汁中菌群結構更為復雜。

不同奶牛場采集的乳房炎樣本菌群分布有所差異。研究在乳房炎樣本中檢測到的主要菌門分別是無壁菌門(Tenericutes)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)。Catozzi等[17]的研究表明，乳房炎樣本中菌群主要有厚壁菌門( Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)，與研究結果一致。Falentin等[18]的研究表明，乳房炎樣本中主要主要菌群分別是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)，與研究結果相比，主要菌群基本一致，但無壁菌門(Tenericutes)在研究中為主要菌群。說明乳房炎樣本之間菌群分布基本一致，但由于區(qū)域、動物種類不同等可能造成微觀的菌群比例差異。

變形菌門(Proteobacteria)的多數(shù)細菌均能引起各種傳染性臨床綜合征(如肺炎、泌尿道感染等)[19，20]。研究表明，乳房炎樣本和非臨床型樣本中變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度均較高，但是變形菌門是否和發(fā)生乳房炎有密切的關系，需要進一步研究。到目前為止，尚無大量由不動桿菌引起牛乳房炎的相關報道[21]，莫拉氏菌科( Moraxellaceae) 中的不動桿菌屬(Acinetobacter)中有50多個物種[22]，但大多數(shù)是非致病性環(huán)境生物[23]。銅綠假單胞菌是奶牛乳腺炎的一個眾所周知的病因，通?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分離鑒定，由銅綠假單胞菌引起的乳腺炎，經(jīng)常與奶牛舍的水和奶頭消毒劑的污染有關[24]。假單胞菌科( Pseudomonadaceae ) 中的假單胞菌( Pseudomonas)是機會致病菌，可以適應多種環(huán)境條件，與肺部炎癥密切相關[25，26]。腸桿菌科中常見的屬是機會性環(huán)境病原體，由這類細菌所引起的乳房炎，可能是受污染的糞便以及牛舍內(nèi)潮濕的環(huán)境所引起[27]。腸道微生物不僅在維持宿主營養(yǎng)、防御和免疫發(fā)育中起關鍵作用[28]；并且有報道揭示腸道微生物與牛奶微生物之間在發(fā)生牛乳房炎時，二者微生物存在緊密的聯(lián)系，當腸道微生物遷移到乳腺后，可通過損害宿主細胞導致臨床或慢性乳腺炎[29, 30]。

臨床型乳房炎樣本和非臨床型樣本之間主要OTU存在較大差異。與非臨床型樣本相比，無壁菌門(Tenericutes)僅在臨床型乳房炎樣本中檢測到，厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度變化較大，此次發(fā)生乳房炎的主要病因可能與無壁菌門(Tenericutes)、厚壁菌門(Firmicutes)有較大的關系。研究發(fā)現(xiàn)，在HZS場中，有1個臨床樣本中豐度最高菌群的是鏈球菌，在CJ場中，有2個樣本中豐度最高菌群的是支原體。HZS場發(fā)生乳房炎的病因可能是由鏈球菌引起，CJ場發(fā)生乳房炎的病因可能是由支原體引起。

4 結 論

臨床型奶牛乳汁中菌群豐度明顯升高，多樣性變化顯著。非臨床型乳汁樣本中豐度較高的菌群依次是變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門。奶牛患乳房炎后菌群結構比例變化顯著的門是厚壁菌門，研究發(fā)現(xiàn)，僅在乳房炎樣本中檢測到菌群結構比例變化顯著的門是無壁菌門(高達57%)，變化顯著的是支原體(高達57%)和鏈球菌(高達95%)。奶?；既榉垦缀髸鹉膛Ｈ橹菏д{(diào)，乳汁菌群結構分布和豐度變化與乳房炎的發(fā)生具有密切的聯(lián)系。